CN108339008A - 一种丹酚制剂在抗脑缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体是一种丹酚制剂在制备抗脑缺血再灌注损伤的新用途：通过大鼠中动脉栓塞模型(MCAO)建立脑缺血再灌注动物模型，观察行为学、脑梗死面积、脑含水量、脑组织中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)、IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平，HE染色观察MCAO造模以及给药后大鼠皮层损伤情况。结果均证明给大鼠用丹酚ip 15mg/kg具有显著的抗脑缺血再灌注损伤的作用，且明显优于缺血性脑卒中一线治疗化药尼莫地平ip 20mg/kg的疗效，可以用于制备抗脑缺血再灌注损伤的预防和/或治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种丹酚制剂在制备抗脑缺血再灌注损伤预防和/或治疗药物中的应用。
背景技术
近年来，脑卒中发病率逐年升高，是目前三大致死性疾病之一，具有高发病率、高患病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点。脑卒中分为缺血性卒中和出血性卒中，缺血性卒中发病率远高于出血性卒中，占脑卒中的60～70％以上，缺血脑组织在一定条件下恢复血液流动，出现了更加严重的脑功能障碍和结构损伤，称之为脑缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury，IRI)。治疗缺血性脑卒中的主要途径是疏通脑血管恢复血液供应，而减轻缺血再灌注损伤已成为治疗环节中不可缺少的重要部分。
丹酚来自于丹参，但不同于现今市售的丹参制剂。丹酚是在工艺过程与处方煎煮过程基本一致的情况下，提取得到的丹参全水溶性有效部位，该名称已经国家食品药品监督管理总局核准。其主要特点有：(1)丹酚、丹酚制剂与丹参药材三者的指纹图谱保持相似，从而保证丹酚的功能、主治与其药材的功能主治一致；(2)丹酚的纯度很高，用HPLC法测定，以丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A 6个对照品按外标法计算的含量之和达90％以上，加上其余峰(约10-25个成分峰)以丹酚酸B计的总含量达98％以上；(3)丹酚的含量很高，16g药材可提得丹酚320mg左右(人用的最佳剂量为120mg/天)；(4)丹酚毒性很低，小鼠以30g/kg灌胃未见死亡，据此推算，约为人用剂量的1925倍，应视为无毒；(5)建立了数字化量化的质量标准，改变了自古以来的计量方式和用药习惯；(6)丹酚的生产工艺科学、高效、节能减排、高收率低成本。其工艺已经中试生产放大验证，各技术参数完全可行，其工艺过程也比较简单：丹参药材经预处理后在室温或低温条件下搅拌快速提取2次，提取液合并过滤，滤液过大孔树脂柱，经洗涤后洗脱，稀洗脱液再过树脂柱，经洗涤后用高浓度乙醇洗脱，洗脱液经热压灭菌，脱色过滤，滤液喷雾干燥即得丹酚，为类白色或淡黄色粉末。
丹酚作为缺血性心血管病用药，发明人已经获得发明专利和临床批件，临床研究在进行中，用于缺血性脑血管病预防和/或治疗的研究在进行中，旨在填补这一空白。
发明内容
本发明公开了一种丹酚制剂在制备抗脑缺血再灌注中的新用途。
本发明公开了一种丹酚制剂在制备抗脑缺血再灌注中的应用。
本发明公开了一种丹酚制剂在制备抗脑缺血再灌注的有益效果主要体现在：通过大鼠中动脉栓塞模型(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立脑缺血再灌注动物模型，观察行为学、脑梗死面积、脑含水量、脑组织中乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)及丙二醛(Malonaldehyde，MDA)、IL-6、IL-1β、TNF-α水平，HE染色观察MCAO造模以及给药后大鼠皮层损伤情况。结果均证明丹酚具有显著的抗脑缺血再灌注损伤的作用，可以用于制备抗脑缺血再灌注损伤的预防和/或治疗药物。
附图说明
图1丹酚对大鼠缺血再灌注后脑梗死体积的影响
图2丹酚大鼠脑缺血再灌注后脑损伤形态学的影响
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1本发明所述的一种丹酚制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤作用试验
大鼠脑缺血再灌注模型的建立
采用大鼠中动脉栓塞模型(MCAO)建立大鼠脑缺血再灌注模型：大鼠用3％水合三氯乙醛(300mg/kg，ip)麻醉后仰卧固定，常规消毒，取颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉(CCA)，用缝合线穿起备用。分离颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，并用缝合线缠绕备用，分离过程中避免损伤迷走神经和气管。将颈总动脉和颈外动脉近心端结扎，颈内动脉处用动脉夹夹闭。在颈外动脉处剪一切口，将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将线栓由颈外动脉插入，打开颈内动脉处动脉夹，将线栓插入颈内动脉，继续插入至颅内，插入深度约18.5±0.5mm至微感阻力，结扎ICA以固定线栓和防止出血，逐层缝合，线栓残端留1.5cm长于皮外，用记号笔涂黑。90min后，将线栓轻轻拔出，实现再灌。假手术组除不插入鱼线外，其他操作同上。
分组与给药
实验开始前大鼠在实验室动物房适应性饲养一周，以适应环境。适应性饲养结束后，大鼠根据体重随机分组，每组15只，共分5组：假手术组(生理盐水：0.1ml/k)、模型组(生理盐水：0.1ml/k)、阳性对照组(尼莫地平：20mg/kg)、丹酚低、中、高剂量组(丹酚：7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg)，各组动物每天上午八点半灌胃给药。
神经行为学评分
参考Longa的5分制法在动物缺血再灌注之后24h进行评分。评分规则为：
0分：无神经损伤症状；
1分：脑损伤对侧前肢伸展障碍；
2分：行走时，向瘫痪侧转圈；
3分：行走时，向对侧倾倒；
4分：不能自发行走，意识丧失。
分值越高，说明动物行为障碍越严重。取第一次实验及第二次实验动物行为学结果进行统计。
脑组织切片TTC染色
大鼠缺血再灌注24小时后，将大鼠断头处死，迅速取出脑组织，去除嗅球、小脑和低位脑干，然后迅速将脑组织置于-80℃冰箱，10min后取出，冠状切为5片，然后将脑片置于2％2，3，5-三苯氯化四氮唑(TTC)染色液，避光放置于37℃水浴中保温20min，其间每隔7-8min上下面翻动一次。经TTC染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，梗死组织呈白色。
脑水肿测定
采用干湿重法测定大鼠脑水肿含量。灌注后处死大鼠，快速分离出脑组织，称量所取脑组织的重量，即得到湿重，随后将脑组织放置在110℃烘箱中烘至恒重，称取脑组织干重。通过下式计算脑含水量，以百分率表示：(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100％。
脑组织匀浆制备
缺血再灌注24h后，断头处死大鼠。取缺血侧大脑半球置于研磨器中，称重，按1∶9加入生理盐水放在冰上迅速研磨，重复匀浆几次使组织尽量碾碎。将匀浆倒入10mL离心管中，2500rpm 4℃离心15min，取上清分装于0.5mL离心管中，采用BCA法按试剂盒说明检测蛋白质含量。取脑匀浆样本按试剂盒说明书处理样品并测定。
LDH、CK、SOD、MDA以及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平测定
取脑组织匀浆，按试剂盒说明操作。
HE染色
随机选取各组大鼠，每组4只，将大鼠麻醉后，进行心室灌注100ml PBS和150ml4％多聚甲醛，取出大鼠脑组织，用10％福尔马林溶液固定。进行石腊包埋，冠状切片，切片厚4～5μm。HE染色方法：
将已入蒸馏水后的切片放入苏木精(Hematoxylin，H)水溶液中染色数分钟。
分别置于酸水及氨水中分色数秒钟。
流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
依次投入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
入酒精伊红(Eosin，E)染色液染色2～3分钟。
染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
光镜下观察大鼠胰腺的病理改变，并拍照记录。
将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。
统计学处理
所有数据均以均数±标准差(Mean±SEM)表示，多组间均数比较采用方差分析(ANOVA)，随后采用Newman-Keuls test检验，比较组间差异，以P＜0.05为统计学差异性显著。
实验结果
丹酚改善大鼠缺血再灌注神经行为学评分
大鼠缺血再灌注之后24h进行神经行为学评分。如表1所示，阳性药尼莫地平组及丹酚低、中、高剂量组(7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg)均能显著改善大鼠缺血再灌注后神经行为学评分。
表1丹酚对大鼠缺血再灌注后神经行为学的影响(n＝12)
注：#表示与假手术组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05。
丹酚能降低大鼠缺血再灌注后脑梗死体积
如图1及表2所示，阳性药尼莫地平组及丹酚中、高剂量组(15mg/kg、30mg/kg)均能显著降低大鼠脑缺血再灌注后脑梗死面积。
表2丹酚对大鼠缺血再灌注后脑梗死率的影响(n＝4)
注：#表示与假手术组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05。
丹酚能降低大鼠缺血再灌注后脑水肿
如表3所示，阳性药尼莫地平组及丹酚低、中、高剂量组(7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg)均能显著降低大鼠脑缺血再灌注后脑水肿程度。
表3丹酚对大鼠缺血再灌注后脑含水量的影响(n＝4)
注：#表示与假手术组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05。
丹酚能降低大鼠缺血再灌注后LDH、CK水平
如表4所示，阳性药尼莫地平组和丹酚低、中、高剂量组(7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg)均能显著降低大鼠缺血再灌注后LDH、CK水平。
表4丹酚对大鼠缺血再灌注后LDH、CK的影响(n＝9)
注：#表示与假手术组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05。
丹酚能降低大鼠缺血再灌注后氧化应激状态
如表5所示，阳性药尼莫地平组和丹酚低、中、高剂量组(7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg)均能显著降低大鼠缺血再灌注后MDA水平，并升高大鼠缺血再灌注后SOD水平，改善大鼠氧化应激状态。
表5丹酚对大鼠缺血再灌注后MDA、SOD的影响(n＝9)
注：#表示与假手术组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05。
丹酚能降低大鼠缺血再灌注后炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平
如表6所示，阳性药尼莫地平组和丹酚低、中、高剂量组(7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg)均能显著降低大鼠缺血再灌注后炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，表明丹酚对大鼠脑缺血再灌注后炎症反应有明显的抑制作用。
表6丹酚对大鼠缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α的影响(n＝9)
注：#表示与假手术组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05
丹酚对大鼠脑缺血再灌注后脑损伤形态学的影响
如图2，与假手术组相比，模型组皮层神经元坏死严重，神经元数目明显减少，细胞核固缩，胞体缩小变形，间质水肿严重，血管周间隙增宽。给予丹酚治疗后，能够明显减少这种病理学改变。提示丹酚具有神经保护作用，能够减轻缺血再灌注引起的神经细胞病理学损伤。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种丹酚制剂在抗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。
2.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于预防给药对大鼠局灶性脑缺血(MCAO)再灌注损伤的保护作用。
3.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于预防给药对四动脉结扎致大鼠全脑缺血损伤的保护作用。
4.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于预防给药对急性不完全小鼠脑缺血损伤的保护作用。
5.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于治疗给药对大鼠局灶性脑缺血(MCAO)损伤的保护作用。
6.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于再灌后2h给药对大鼠MCAO再灌注损伤的保护作用。
7.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于于再灌后3h给药对大鼠MCAO再灌注脑损伤的保护作用。
8.权利要求1所述抗脑缺血再灌注损伤中应用于缺血后3h给药对大脑中动脉闭塞(MCAO)所致永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用。
9.权利要求1～8所述丹酚抗脑缺血再灌注损伤中应用于预防和/或治疗均有效，中剂量疗效最佳，明显优于尼莫地平的人用治疗剂量，高剂量(为中剂量的2倍)与中剂量相比，疗效无显著差异，不成量效关系。
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