CN108314729A - 岩藻糖基化抗体的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体的分离方法，具体为具有不同岩藻糖基化程度的抗体的分离方法。所述方法基于抗体对Fc受体的结合亲和力。本发明进一步涉及Fc受体用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的用途。
Description
本申请为2012年10月16日提交的，发明名称为“岩藻糖基化抗体的分离方法”的PCT申请PCT/EP2012/070439的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2014年4月21日，申请号为201280051644.2。
发明领域
本发明涉及抗体的分离方法，具体为具有不同岩藻糖基化程度的抗体的分离方法。所述方法基于抗体对Fc受体的结合亲和力。本发明进一步涉及将Fc受体用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体。
背景
人IgG1由两种Fab(抗原结合片段)片段组成，所述片段包含负责抗原识别的可变区，以及与免疫系统的组分相互作用并介导免疫效应子功能的恒定Fc(可结晶片段)结构域，所述免疫效应子功能例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。连接到恒定区的CH2结构域内在天冬酰胺297(Asn297，N297)处的保守的N-糖基化位点的碳水化合物结构对于介导这些效应子功能而言是必需的(1-4)。
天然地，连接到Fc结构域的寡糖主要是在平分型GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)、末端半乳糖、核心岩藻糖和唾液酸的含量方面不同的双触角(biantennary)复合型结构(图1)。
近期研究已显示，碳水化合物组合物的修饰强烈影响抗体介导的免疫效应子功能(3-5)。低水平的半乳糖基化积极影响补体激活，同时缺乏核心岩藻糖导致对FcγRIIIa更高的结合亲和力并由此增强ADCC(5-7)。已经开发了多种方法以调控糖基化特征以及生成具有改进的生物功能的治疗性抗体(8-10)。
例如，过表达β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶(GnT)III和甘露糖苷酶(Man)II的哺乳动物细胞中产生的糖改造的抗体以高比例的二等分、非岩藻糖基化寡糖为特征，并且由于对FcγRIIIa多达50倍的更高亲和力而引起增强的ADCC(9)。然而，通过GnT III的过表达引入的碳水化合物修饰抑制岩藻糖基化反应，所述碳水化合物修饰导致仅部分非岩藻糖基化的抗体。由于IgG分子的Fc结构域带有两个N-连接糖基化位点，岩藻糖基化反应的部分抑制可导致抗体库内岩藻糖的分布改变。此类抗体制剂可能含有带有一个或两个岩藻糖残基的分子的混合物，而它们中的一些是完全非岩藻糖基化的。显然，此类非岩藻糖基化的不同程度影响对FcγRIIIa的总体亲和力并导致不同生物活性。因此，此类抗体库的详细鉴定是必需的。
岩藻糖基化和非岩藻糖基化IgG对FcγRIIIa的亲和力之间的差异为至多50倍，因此可以利用该相互作用来分离抗体库中不同岩藻糖基化的种类并独立地表征它们。
用于IgG纯化的现有亲和层析基质不能区分IgG库中不同的糖基化模式，因为固定化捕获蛋白质特异性结合抗体的蛋白质骨架。例如蛋白质A和蛋白质G在Fc区的CH2和CH3结构域之间的界面内结合，而其它IgG特异性蛋白例如蛋白质L识别kappa轻链的恒定部分(11-13)。
已经采用凝集素亲和层析，例如使用结合含有岩藻糖的聚糖的橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)以富集带有特异性聚糖结构的蛋白质(14)。可选地，已经使用识别特异性碳水化合物结构的聚糖-靶向抗体，例如Lewis x抗原的特异性抗体(15)。尽管这些方法可适于富集带有特异性碳水化合物的糖蛋白，然而所述方法对于缺乏特异性碳水化合物的糖蛋白，例如非岩藻糖基化的抗体的富集用途有限。此外，这些方法对于抗体都不是特异性的，因此在将抗体库应用至亲和力基质之前要求严格纯化所述抗体库，以避免受其它带有靶向聚糖结构的蛋白质污染。最终，这些方法依赖于可能难以获得的特异性凝集素或抗体，并且所述方法尚未成功用于制备目的。
鉴于部分或完全非岩藻糖基化的抗体在诱导免疫效应子功能中的效价大大增加(这是对于实验以及治疗目的所关注的)，期望从来自抗体库中存在的完全岩藻糖基化的抗体中分离所述部分或完全非岩藻糖基化的抗体。本发明提供简单且有效的方法来实现此类分离。
发明描述
本发明提供的分离方法基于某些Fc受体例如FcRγIIIa区分岩藻糖基化和(部分或全部)非岩藻糖基化抗体的能力。所述方法使用固定化Fc受体从抗体库分离不同岩藻糖基化的抗体，用于分析和制备目的。可将本文描述的方法分析地应用于表征抗体库的碳水化合物组成。由于所述方法可筛选大量样品，例如，可将其用于选择产生具有高非岩藻糖基化寡糖含量的糖改造的抗体的宿主细胞克隆。制备应用可制备完全非岩藻糖基化或完全岩藻糖基化抗体群，可表征所述抗体群的不同FcγRIIIa结合性质和生物活性。
在第一方面，本发明提供用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的方法，其包括以下步骤：
a)提供抗体的群，
b)使所述抗体的群与固定在载体上的Fc受体接触，
c)洗脱非特异性结合于所述Fc受体的抗体，和
d)洗脱特异性结合于所述Fc受体的抗体。
在特定实施方案中，抗体为IgG抗体，更特别地为IgG1抗体。在一些实施方案中，抗体包含人Fc区。在一个实施方案中，抗体为糖基化抗体。在具体实施方案中，抗体被糖改造为在它们的Fc区具有改变的寡糖结构。在更加具体的实施方案中，抗体被糖改造为在它们的Fc区与相应的非糖改造抗体相比具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中，与非改造的宿主细胞对比，已经在经改造具有增加的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶(GnT)III活性的宿主细胞中产生了抗体。在更具体的实施方案中，宿主细胞也被改造以具有增加的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。增加的GnTIII活性通常由一种或多种多核苷酸引入至宿主细胞引起，所述多核苷酸编码具有GnTIII活性的一种或多种多肽，即能够催化β-1,4连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基与N-连接寡糖的三甘露糖基核心之β-连接的甘露糖苷的结合的多肽。所述多肽包括呈现与β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性类似，但不一定相同的酶活性的融合多肽，根据国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)，所述β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III也称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰氨基葡萄糖-转移酶(EC 2.4.1.144)，如在特定生物测定中测量，具有或不具有剂量依赖性。在某些实施方案中，具有GnTIII活性的多肽为包含GnTIII的催化结构域和异源高尔基体驻留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。特别地，高尔基体定位结构域为甘露糖苷酶II或GnTI的定位结构域，最特别是甘露糖苷酶II的定位结构域。可选地，高尔基体定位结构域选自由以下组成的组：甘露糖苷酶I的定位结构域、GnTII的定位结构域，以及α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。可用于糖改造抗体以在它们的Fc区具有增加的非岩藻糖基化寡糖的比例的糖改造方法描述于Umana等，Nat Biotechnol 17，176-180(1999)；Ferrara等，Biotechn Bioeng 93，851-861(2006)，和PCT公开号WO 99/54342、WO 2004/065540和WO03/011878中，所述文献的每一篇的内容均通过引用以其整体明确并入本文。
在特定实施方案中，抗体的Fc受体的结合亲和力取决于抗体的岩藻糖基化程度。在具体的此类实施方案中，抗体的Fc受体的结合亲和力随抗体的岩藻糖基化程度降低。在一个实施方案中，特别是其中抗体为IgG抗体时，Fc受体为Fcγ受体。在特定实施方案中，Fc受体为FcγRIIIa。在更具体的实施方案中，Fc受体为FcγRIIIa(V158)。在一些实施方案中，特别是其中抗体包含人Fc区时，Fc受体为人的。在一个实施方案中，Fc受体为重组Fc受体(即Fc受体通过重组生产获得)。
在一个实施方案中，固定Fc受体于其上的载体为聚合物基质。聚合物基质通常为珠粒形。在一个实施方案中，聚合物基质为交联琼脂糖或其衍生物。在具体实施方案中，聚合物基质为(交联琼脂糖，获自GE Healthcare，Uppsala，Sweden)。在另一实施方案中，聚合物基质为交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。在具体实施方案中，聚合物基质为(交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，获自Applied Biosystems,Foster City,USA)。Fc受体可以各种方式固定在载体上。根据载体的性质，技术人员将容易地能够确定适当的固定方法。例如，聚合物基质上的固定通常通过待固定的蛋白质与基质中包含的官能团(例如羟基、醛基、环氧基)的化学反应来实现。适合的聚合物基质以及偶联化学反应和方案是本领域熟知的。下文的实例中还描述了在两种不同载体上的固定。在一个实施方案中，载体不是细胞或细胞膜。在某些实施方案中，所述方法为层析方法。在一个此类实施方案中，载体包含在层析柱中。在一个此类实施方案中，通过使抗体群通过层析柱来实施抗体群与Fc受体的接触。
在特定实施方案中，抗体的群是纯化的。在某些实施方案中，抗体的群是亲和纯化的，特别是使用蛋白质A或蛋白质G亲和纯化的。例如，可实施亲和纯化，作为通过用亲和力基质孵育抗体群的批纯化，或作为通过使抗体群流动相通过亲和力基质固定相的层析纯化。在一个实施方案中，抗体的群是通过亲和层析纯化的。在更具体的实施方案中，通过蛋白质A或蛋白质G亲和层析，特别是蛋白质A亲和层析来纯化抗体的群。在其它实施方案中，通过尺寸排阻层析，或通过亲和层析与尺寸排阻层析结合来纯化抗体群。
在一个实施方案中，抗体的群以溶液形式提供。在更具体的实施方案中，抗体的群以缓冲液的形式提供。在一个实施方案中，缓冲液的pH值为约7.0至约8.5，特别是约8的pH值。在一个实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。在更加具体的实施方案中，缓冲液为10mMTris、50mM甘氨酸、100mM NaCl，pH 8，或20mM Tris、20mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、20mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH 8。在一些实施方案中，在缓冲液中实施抗体群与Fc受体的接触。在具体此类实施方案中，缓冲液与其中提供了抗体群的缓冲液相同。在一个实施方案中，通过蛋白质A或蛋白质G亲和层析，特别是蛋白质A亲和层析来纯化抗体的群，并且在相同缓冲液中实施与Fc受体的接触，其中所述亲和层析(包括由蛋白质A洗脱后的抗体溶液的中和)后获得抗体的群。在特定实施方案中，在抗体群的纯化以及与Fc受体接触之间不需要中间步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：
c1)洗涤所述载体。
在一个实施方案中，所述洗涤包括使载体与缓冲液接触，这使得抗体与待保持的Fc受体特异性结合，随后除去所述缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液的pH值为约7.0至约8.5，特别是约8的pH值。在一个实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。在更加具体的实施方案中，缓冲液为10mM Tris、50mM甘氨酸、100mM NaCl，pH 8，或20mM Tris、20mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、20mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH 8。在一个实施方案中，所述缓冲液与其中提供了抗体的缓冲液相同。在一个实施方案中，将相同缓冲液用于提供(纯化的)本文的抗体的群(步骤a)，用于抗体的群与Fc受体接触(步骤b)，用于洗脱非特异性结合于受体的抗体(步骤c)，以及洗涤载体(步骤c1)。
在特定实施方案中，所述方法可分离抗体亚群，其中大部分抗体不包含两个抗体Fc区的N-聚糖中的岩藻糖残基，或者包含两个抗体Fc区的N-聚糖的一个或两个中的岩藻糖残基。在进一步具体实施方案中，所述方法可分离具有至少90％，优选至少95％的岩藻糖基化程度的抗体、具有低于20％，优选低于10％的岩藻糖基化程度的抗体，以及具有约10％至75％，优选约20％至60％的岩藻糖基化程度的抗体。在一个实施方案中，所述方法适用于分离基本上由部分岩藻糖基化和完全非岩藻糖基化的抗体组成的抗体亚群。在一个实施方案中，所述方法适用于分离基本上由以下抗体组成的抗体亚群：所述抗体不包含两个抗体Fc区的N-聚糖中的岩藻糖残基，或者包含两个抗体Fc区的N-聚糖之一的岩藻糖残基。在一个实施方案中，所述方法适用于分离抗体亚群，其基本上无包含两种抗体Fc区的N-聚糖中的岩藻糖残基的抗体。
在某些实施方案中，所述方法被用于分析目的。在其它实施方案中，所述方法被用于制备目的。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：
e)收集步骤c)和/或步骤d)的所述洗脱抗体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：
f)使用收集的抗体用于实验或治疗目的。
在一个实施方案中，通过测量在280nm波长下的UV吸光度来检测洗脱的抗体。
在一个实施方案中，步骤c)的洗脱包括步骤b)中的接触后在抗体群中保持游离抗体的分离。其中载体包含在层析柱中，并且通过使抗体群经过层析柱来实施抗体群与Fc受体的接触，在通过层析柱的流中发现步骤c)中洗脱的抗体。在一个实施方案中，步骤c)中洗脱的抗体为完全岩藻糖基化抗体。在更具体的实施方案中，步骤c)中洗脱的抗体的岩藻糖基化程度为至少90％，优选至少95％。在一个实施方案中，步骤c)中洗脱的大部分抗体包含在两个抗体Fc区的N-聚糖每个中的岩藻糖残基。
在特定实施方案中，步骤d)的洗脱包括使载体与缓冲液接触，所述缓冲液中断抗体与Fc受体的结合。在一个此类实施方案中，缓冲液的pH值在约3至约5范围内，优选在约4至约5范围内。在一个实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。在一个实施方案中，步骤d)中洗脱的抗体为部分岩藻糖基化和/或完全非岩藻糖基化的抗体。在更具体的实施方案中，步骤d)中洗脱的抗体的岩藻糖基化程度低于90％，优选低于75％，最优选低于60％。在一个实施方案中，步骤d)中洗脱的大部分抗体包含两个抗体Fc区的N-聚糖之一中的岩藻糖残基，或者不包含两个抗体Fc区的N-聚糖中的岩藻糖残基。
在特定实施方案中，在不同pH值下实施步骤d)的洗脱。在一个实施方案中，pH值在约3至约5范围内，优选在约4至约5范围内。在具体实施方案中，pH值包括4.6和4.2。在另一特定实施方案中，步骤d)的洗脱可分离部分岩藻糖基化抗体与完全非岩藻糖基化的抗体。在更具体的实施方案中，步骤d)的洗脱可分离具有低于20％，优选低于10％的岩藻糖基化程度的抗体与具有约10％至75％，优选约20％至60％的岩藻糖基化程度的抗体。在又一特定实施方案中，步骤d)的洗脱允许抗体亚群的分离，其中大部分抗体包含两个抗体Fc区的N-聚糖之一中的岩藻糖残基，或者大部分抗体不包含两个抗体Fc区的N-聚糖中的岩藻糖残基。在一些实施方案中，通过使载体与一系列缓冲液相继接触来实施步骤d)的洗脱，所述缓冲液阻断具有不同岩藻糖基化程度的抗体与Fc受体的结合。在具体的此类实施方案中，缓冲液具有不同pH值。在一个实施方案中，pH值在约3至约5范围内，优选在约4至约5范围内。在具体实施方案中，pH值包括4.6和4.2。在一个实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。在更具体的实施方案中，缓冲液为10mM Tris、50mM甘氨酸、100mM NaCl，或20mM Tris、20mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、20mM柠檬酸钠、100mM NaCl(具有不同pH值)。
另一方面，本发明涵盖Fc受体在用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的方法中的用途。一方面，如本文所描述，本发明提供本发明的方法中Fc受体的用途。在一个实施方案中，Fc受体为Fcγ受体。在特定实施方案中，Fc受体为FcγRIIIa。在更具体的实施方案中，Fc受体为FcγRIIIa(V158)。在一个实施方案中，Fc受体为人的。在进一步实施方案中，Fc受体为重组Fc受体。在特定实施方案中，Fc受体固定在载体上。载体可单独地或组合地包含关于本发明的方法中使用的载体的前述段落中的任何特征。
在又一方面，本发明提供固定在载体上的Fc受体在用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的方法(例如本发明的方法)中的用途。在一个实施方案中，Fc受体为Fcγ受体。在特定实施方案中，Fc受体为FcγRIIIa。在更具体的实施方案中，Fc受体为FcγRIIIa(V158)。在一个实施方案中，Fc受体为人的。在进一步实施方案中，Fc受体为重组Fc受体。载体可单独地或组合地包含关于本发明的方法中使用的载体的前述段落中的任何特征。
除非以下另有定义，本文使用的术语如本领域所通用。
本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们包含Fc区或相当于免疫球蛋白的Fc区的区。术语还涵盖包含Fc区或相当于免疫球蛋白的Fc区的区的融合蛋白。
术语“免疫球蛋白”是指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白为约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，所述IgG类的免疫球蛋白由二硫键接的两条轻链和两条重链组成。从N-末端至C-末端，各重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变区，随后是铰链区(HR)和三个恒定区(CH1，CH2和CH3)，也称为重链恒定区。在IgE类免疫球蛋白的情况下，重链此外具有CH4结构域。因此，免疫球蛋白重链为以N-端到C-端方向由以下结构域组成：VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4)的多肽。类似地，从N-末端到C-末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变区，随后恒定轻链结构域(CL)，也称为轻链恒定区。因此，免疫球蛋白轻链以N-端到C-端方向由以下结构域组成：VL-CL的多肽。免疫球蛋白的重链可分为五种类型之一，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)，或μ(IgM)，其中一些可被进一步分为子类型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。根据它的恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白的轻链分为两种类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。免疫球蛋白基本上由两个Fab片段和通过免疫球蛋白铰链区连接的Fc区组成。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。主要的抗体有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可被进一步分为子类(同种型)，例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类的抗体的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ，和μ。
将本文的术语“Fc区”或“Fc结构域”用于规定含有至少部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略微不同，通常规定人IgG重链Fc区从Cys226，或从Pro230，延伸至重链的羧基末端。然而，可能存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文另有规定，根据EU编号系统，也称为EU index，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所描述对Fc区或恒定区中氨基酸残基编号。
“相当于免疫球蛋白的Fc区的区”预期的包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位变体以及改变的变体，所述改变产生取代、添加，或缺失但是基本上不会降低免疫球蛋白介导效应子功能的能力(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)。例如，一种或多种氨基酸可从免疫球蛋白的Fc区的N-末端或C-末端缺失，而无生物功能的显著损失。根据本领域已知的一般规则可选择此类变体，以便对活性影响最小(参见，例如，Bowie等，Science 247，1306-10(1990))。
术语“岩藻糖基化”是指连接到抗体的肽骨架的寡糖中存在岩藻糖残基。具体地，岩藻糖基化抗体包含连接到抗体Fc区的N-连接寡糖的一个或两个中的最内端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的α(1,6)-连接岩藻糖，例如在人IgG1Fc结构域的位置Asn 297(Fc区残基的EU编号)。由于免疫球蛋白的较小序列变化，Asn297还可位于位置297的上游或下游约±3氨基酸内，即位置294和300之间。
“岩藻糖基化程度”是岩藻糖基化寡糖相对于通过MALDI TOF MS的N-糖苷酶F处理的抗体样品中鉴别的所有寡糖的百分比。在“完全岩藻糖基化抗体”的样品中基本上所有寡糖包含岩藻糖残基，即被岩藻糖基化。在一个实施方案中，完全岩藻糖基化抗体的岩藻糖基化程度为至少90％。因此，此类样品中的抗体个体通常包含两个Fc区中N-连接寡糖每个中的岩藻糖残基。相反，“完全非岩藻糖基化”抗体的样品中基本上没有寡糖被岩藻糖基化，并且此类样品中抗体个体不包含两个Fc区中N-连接寡糖中的岩藻糖残基。在一个实施方案中，完全非岩藻糖基化的抗体的岩藻糖基化程度低于10％。在“部分岩藻糖基化抗体”的样品中，仅部分寡糖包含岩藻糖。此类样品中的抗体个体可不包含Fc区中N-连接寡糖中的岩藻糖残基，包含岩藻糖残基Fc区中N-连接寡糖的一个或两个中的岩藻糖残基，前提条件是基本上样品的所有抗体个体不包含Fc区中N-连接寡糖中的岩藻糖残基，并且基本上样品的所有抗体个体不包含两个Fc区中N-连接寡糖中的岩藻糖残基。在一个实施方案中，部分岩藻糖基化抗体的岩藻糖基化程度为约10至约75％。
如本文所使用，术语“糖改造(glycoengineer)、糖改造的”是指肽骨架的任何操作或天然存在的或重组多肽或其片段的翻译后修饰，所述“糖改造、糖改造的”改变多肽的糖基化模式。糖改造包括氨基酸序列的修饰、单个氨基酸的侧链基的修饰，或寡糖结构的修饰，以及这些方法的组合。糖改造还包括细胞的糖基化机制的代谢改造，包括寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖改造包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖改造的抗体是由产生所述抗体的宿主细胞中糖基转移酶活性的改变引起的。糖基转移酶包括例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)、β(1,4)-半乳糖糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnTI)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II(GnTII)和α(1,6)-岩藻糖基转移酶。在特定实施方案中，糖改造抗体是由产生所述抗体的宿主细胞中改变的葡糖胺转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性引起的。可以通过以下方法获得具有在其Fc区中非岩藻糖基化寡糖增加比例的抗体，例如，通过在具有增加的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)活性，任选地此外具有增加的甘露糖苷酶II(ManII)活性的宿主细胞中，或具有降低的α(1,6)岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中产生抗体。
“FcγRIIIa(V158)”是指具有在氨基酸位置158的缬氨酸(V)残基的FcγRIIIa的同工型(也称为CD16a；参见Uni Prot No.P08637，人蛋白的NCBI登录号NP_000560)。通过FcγRIIIa(V158)结合IgG显示比通过FcγRIIIa(F158)结合IgG更好(17)。
“特异性结合”是指结合对于Fc受体有选择性，并且可与不需要的或非特异性相互作用区分。可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员所熟知的其它技术，例如如本文所描述的表面等离振子共振(SPR)测量抗体结合Fc受体的能力。
“结合亲和力”是指分子(例如受体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，受体及其配体)的成员之间的1：1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(KD)代表，解离常数(KD)是解离和缔合速率常数(分别为koff和kon)之比。因此，等效的亲和力可包含不同速率常数，只要速率常数的比例保持不变。可通过包括那些本文描述的本领域已知的良好建立的方法测量亲和力。测量亲和力的特定方法为表面等离振子共振(SPR)。
术语“纯化的”当使用与抗体群相关时，意指抗体群基本上不含不相关，非抗体蛋白质。用于抗体的纯化的各种方法是本领域已知的，包括高压液相层析法、离子交换层析法、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。“亲和纯化的”抗体群是指抗体群已经使用亲和力基质纯化的抗体群，该基质与其特异性结合，但是不与不相关、非抗体蛋白特异性结合，例如包含蛋白质A或蛋白质G的亲和力基质。
本文使用的术语“缓冲液”是指具有规定pH值的溶液，通常包含稳定溶液pH的缓冲剂。缓冲剂是本领域熟知的并且包括，例如，柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、磷酸盐，乳酸盐或三(羟甲基)氨基-甲烷(Tris)。
本文使用的“大部分”意指超过总的50％，优选超过60％，最优选超过70％。
附图简述
图1.连接到人IgG1Fc结构域的Asn297的N-连接寡糖。粗体表示的糖限定了五糖核心，其它糖残基的添加是可变的。GlcNAc：N-乙酰葡糖胺；Fuc：岩藻糖；Man：甘露糖；Gal：半乳糖；NeuAc：N-乙酰神精氨酸。
图2.可溶性人FcγRIIIa(V158)的纯化。A)固定化金属螯合层析(IMAC)的层析图。实线：A280nm；点线：梯度。B)大小排阻层析(SEC)的层析图。实线：A280nm。C)SDS PAGE，考马斯亮蓝染色。泳道1：分子量标记物[kDa]；泳道2：FcγRIIIa(V158)降低(reduced)。D)分析SEC谱图(A280nm)。进样50μg样品。
图3.分析用的FcγRIIIa(V158)层析图。10μgA)糖改造的IgG“A”；B)野生型IgG“A”；C)糖改造的IgG“B”；D)野生型IgG“B”的层析图(A280nm)。对应于具有高含量非岩藻糖基化聚糖(“结合峰”)的抗体级分的峰由黑色方形表示。“结合峰”的面积如下：A)总峰面积的66％(48％非岩藻糖基化，如通过MALDI TOF MS测定)；B)总峰面积的26％(10％非岩藻糖基化，通过MALDI TOF MS测定)；C)总峰面积的75％(75％非岩藻糖基化，通过MALDI TOF MS测定)；D)总峰面积的31％(9％非岩藻糖基化，通过MALDI TOF MS测定)。
图4.分析用的FcγRIIIa(V158)层析图的评价。来自总峰面积的FcgRIIIa(V158)层析柱的“结合峰”的面积％，所述面积％是通过MALDI TOF MS测定的非岩藻糖基化％的函数。A)糖改造的和野生型IgG“A”(0–100％糖改造的IgG)的混合物。B)糖改造的和野生型IgG“B”(0–100％糖改造的IgG)的混合物。
图5.作为两种不同方法，对比MALDI TOF MS后的蛋白质A层析法和后续是FcγRIIIa(V158)层析法的蛋白质A层析法以分析由细胞培养上清液纯化的抗体的岩藻糖基化程度(糖改造的IgG“C”)。来自总峰面积的FcγRIIIa(V158)层析柱的“结合峰”的面积％，所述面积％是通过MALDI TOF MS测定非岩藻糖基化％的函数。
图6.制备FcγRIIIa(V158)层析图。糖改造的IgG“A”的层析图。IgG“A”洗脱三个峰：峰1为柱的流穿，峰2和3为用两个pH梯度的洗脱。显示了峰1、2和3的合并。实线：A280nm；点线：梯度；虚线：pH值。
图7.由制备用FcγRIIIa(V158)层析收集的抗体级分的生物活性。对于糖改造的IgG“A”(A)和IgG“B”(B)，对3个洗脱峰以及起始材料(加载至FcγRIIIa(V158)柱的抗体库)实施ADCC测定。黑色方形：起始材料；白色菱形：峰1；黑色三角形：峰2；黑色圆：峰3；白色方形(仅在B中示出)：野生型IgG“B”(未经糖改造的)。
图8.通过表面等离振子共振分析可溶性人FcγRIIIa(V158)与从制备用FcγRIIIa(V158)层析收集的抗体级分的相互作用。加载至FcγRIIIa(V158)柱上，A)IgG“B”，峰1(在稳态中分析)；B)IgG“B”，峰2；C)IgG“B”，峰3；D)IgG“B”的抗体库的传感图(Sensorgrams)和拟合。E)无糖改造的野生型IgG“B”的传感图(在稳态中分析)。
实施例
以下为本发明方法的实施例。应理解，鉴于上面提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。
实施例1
可溶性人FcγRIIIa(V158)K6H6的生产和纯化
通过使用磷酸钙转染方法，用哺乳动物表达载体转染HEK293-EBNA细胞来生产具有C端(赖氨酸)6和(组氨酸)6标签(参见SEQ ID NOs 1和2)的可溶性人FcγRIIIa(V158)。
对于转染，在使用补充有10％(v/v)FCS的DMEM培养基的T培养瓶中，将细胞培养成贴壁单层细胞培养物，并且当它们为50至80％汇合时进行转染。对于T150培养瓶的转染，转染前24小时，将1千5百万个细胞接种于补充有FCS(10％v/v最终浓度)的25mlDMEM培养基中，并置于培养箱中，在37℃下、潮湿的5％CO2气氛过夜。对于待转染的每个T150培养瓶，通过将94μg总质粒载体DNA混入水中至469μl的最终体积，与469μl 1M CaCl2溶液混合来制备DNA、CaCl2和水的溶液。向该溶液中加入938μl 50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)，立即混合10s，在室温下放置20s。用10ml补充有2％(v/v)FCS的DMEM稀释混悬液，并加至T150培养瓶中，替代现有培养基。然后，加入另外的13ml转染培养基。由25mlDMEM，10％FCS置换培养基前，在37℃、5％CO2下将细胞孵育约17至20小时。培养基更换后大约7天，通过在210xg下离心15min来收获条件化培养基，将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，并加入叠氮钠至0.01％(w/v)的最终浓度，并在4℃下保存。
通过固定化金属螯合层析法(IMAC)，随后尺寸排阻层析(图2A，B)来纯化分泌的蛋白质。
对于金属螯合层析法，在4ml/min下将上清液加载至用缓冲液A(20mM Na2HPO40.5M NaCl pH 7.4)平衡的NiNTA Superflow柱(柱体积：5ml；Qiagen，Germany)。通过用至少10个柱体积缓冲液A洗涤来除去未结合蛋白质。用缓冲液B(20mM Na2HPO4、0.5M NaCl、0.5M咪唑，pH 7.4)梯度洗脱FcγRIIIa(V158)。梯度由以下三步组成：1)0至45％缓冲液B，经8个柱体积，2)45至100％缓冲液B，经2个柱体积，和3)100％缓冲液B，2个柱体积。加载至用2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3，pH 7.4平衡的尺寸排阻层析柱(HiLoad 16/60Superdex 75；GE Healthcare，Sweden)前，合并第二洗脱峰并使用离心式过滤单元(AmiconUltra MWCO 10kD；Millipore，USA)浓缩。
通过测量在280nm下的光密度(OD)，使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，测定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)下并用考马斯亮蓝(InstantBlueTM from Expedeon)染色，通过SDS PAGE分析重组人FcγRIIIa(V158)的纯度和分子量。根据生产商说明书使用 Pre-Cast凝胶系统(4-12％Bis-Tris，Invitrogen，USA)(图2C)。使用Superdex 75 10/300GL分析用分子排阻柱(GEHealthcare，Sweden)，在25℃下，在2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3，pH 7.3运行缓冲液中，分析蛋白质的聚集体含量(50μg样品)(图2D)。
实施例2
抗体岩藻糖基化的分析
由人IgG生成Fc片段。在25℃下、在50mM Tris pH 8.0、150mM NaCl中用0.42U纤溶酶(Roche，Switzerland)/mg将抗体孵育72小时。使用蛋白质A珠粒(GE Healthcare)，从Fab-片段分离裂解的Fc片段，用50mM Tris pH 8.0、100mM甘氨酸、150mM NaCl洗涤。用50mMTris pH 3.0、100mM甘氨酸、150mM NaCl洗脱Fc片段。通过加入1：40v/v 2M Tris pH 8.0中和洗脱液，并将其加载至尺寸排阻层析柱(Superdex S200 10/300 GL，GE Healthcare)。将样品浓缩，并将缓冲液更换为20mM Tris pH 8(Amicon，Millipore)。
从人Fc片段释放N-连接寡糖。将不同酶用于从人Fc片段水解N-连接聚糖。通过用0.005U重组PNGase F(QAbio，USA)孵育，从1mg的Fc片段裂解N-连接寡糖。对于从Fc片段释放碳水化合物，使用未标记的Endo S(Genovis，Sweden)和Endo H(QAbio，USA)，结合0.1U/mg Endo H，以1：20的摩尔比用Endo S孵育样品。将所有反应物在20mM Tris pH8.0中在37℃下孵育16小时。
从完整人IgG释放N-连接寡糖。对于使用未标记的Endo S和Endo H的从完整人IgG释放碳水化合物，将样品缓冲液更换为20mM Tris pH 8.0(Amicon 5.000 MWCO，Millipore)，并在37℃下以与结合0.1U/mg Endo H的Endo S摩尔比1：7的比例孵育16小时。
羧肽酶B处理。为除去由C端赖氨酸引起的异质，用羧肽酶B(Roche；1mg/ml)进一步孵育样品。因此将1μl羧肽酶B/50μg蛋白质加至内切糖苷酶反应中，并在37℃下再次孵育1小时。消化后，使用蛋白质A(POROS A 20，Applied Biosystems)纯化样品并用1：40v/v 2MTris pH 8.0中和。
MALDI-TOF质谱分析。根据Papac等，通过质谱法(Autoflex，Bruker DaltonicsGmbH)以阳离子模式分析人IgGs的中性寡糖特征(18)。
通过直接输注(离线检测)ESI-MS分析来自人Fc片段的聚糖结构。用蛋白酶纤溶酶和羧肽酶B以及用内切糖苷酶Endo S和Endo H处理的20-50μg(至多90μl)抗体进样至Sephadex G25自填装的ECO SR柱(5x250mm)(KronLab)，所述ECO SR柱用2％(v/v)甲酸、40％(v/v)乙腈在0.5ml/min的流速下平衡30分钟。应用2％(v/v)甲酸、40％(v/v)乙腈在1ml/min的流速下进行8分钟等度洗脱，将进样的抗体样品脱盐。通过UV在280nm下记录脱盐蛋白质的洗脱，并将洗脱样品(体积约200-300μl)收集在1.5ml反应小瓶中。将脱盐样品的等份手动填充至金属-涂覆的玻璃针(Proxeon Biosystems Nano ESI-needles，目录号ES387)，插入质谱装置的纳喷雾源，并喷雾至来自Waters的ESI-Q-TOF II质谱仪或至来自Applied Biosystem的Q-Star Elite质谱仪。使用1000V的毛细管电压，30V的锥电压，在1000–2000m/z质量范围内以阳离子模式使用80℃的源温度采集MS光谱。去溶剂化温度关闭。通过相应的仪器软件采集MS数据2-3分钟。使用内部开发软件由Fc片段种类的相应的m/z模式，测定包含通过应用的内切糖苷酶截短的聚糖结构的不同组合的二聚Fc片段的摩尔质量(即其中两条肽链仅带有N-乙酰葡糖胺残基(GlcNAc/GlcNAc)的分子、其中一条肽链另外带有岩藻糖残基(GlcNAc+Fuc/GlcNAc)的分子，以及其中两条肽链均带有岩藻糖残基(GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc)的分子)。用相同的内部软件，使用不同糖基化变体的m/z光谱的峰面积的总和，计算三种不同残留糖基化二聚Fc-片段的相对比例。
通过LC/MS(在线检测)的来自人Fc片段的聚糖结构的ESI-MS分析。在偶联于QTofII质谱仪(Waters)的Agilent Cap LC1100上实施LC-MS方法。在Phenomenex Jupiter C18柱(5μm粒度，300A孔径，1x25mm)上实施层析分离。洗脱液A为0.5％(v/v)甲酸水溶液，洗脱液B为70％(v/v)异丙醇、20％(v/v)乙腈、9.5％(v/v)水和0.5％(v/v)甲酸。流速为40μl/min，在75℃下使用10μl最终体积的2μg蛋白质实施分离。
实施例3
分析用FcγRIIIa层析
亲和力基质的制备。使用离心式过滤器装置(Amicon Ultra MWCO 10kD；Millipore，USA)，将10mg FcγRIIIa(V158)的缓冲液更换为0.1M磷酸钠，0.05％(w/v)NaN3，pH 7，并浓缩至1.2ml的最终体积。通过UV光谱在280nm下测量光密度测定蛋白质浓度，并调节至8mg/ml。将对应于0.14g干燥珠粒的440μl POROS AL珠粒(AppliedBiosystems，USA)加至蛋白质溶液中。随后加入0.01M NaOH中的41.5μl 1M NaCNBH3，并在室温下将混悬液孵育过夜。通过珠粒的离心除去上清液，并通过UV光谱定量未结合蛋白质。在室温下将珠粒在0.01M NaOH中的500μl 1M Tris，pH 7.4和23μl 1M NaCNBH3淬灭30min。用1M NaCl将珠粒洗涤四次，并用2mM MOPS，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaN3，pH 7.3洗涤三次。最终，偶联14mg FcγRIIIa(V158)/g POROS AL珠粒。
使用固定在POROS AL上的FcγRIIIa(V158)的分析层析法。将含有FcγRIIIa(V158)的POROS AL珠粒填装在2x20mm Upchurch Scientific柱(柱体积：60μl)上，所述Upchurch Scientific柱安装到Agilent 1200 HPLC系统(Agilent Technologies，USA)上。所用缓冲液为用于平衡并洗涤的10mM Tris、50mM甘氨酸、100mM NaCl，pH 8，或用以洗脱的10mM Tris、50mM甘氨酸、100mM NaCl，pH 3。将系统的泵流速设定为0.5ml/min。在时间零处，通过自动进样器注射进样抗体制剂(10μg蛋白质A-纯化的抗体)并洗涤2min，然后在再平衡前，以0.66分钟持续时间的阶梯梯度洗脱4.33分钟。总循环持续时间为7分钟。
谱图显示两种峰：流穿峰和洗脱峰(图3)。通过积分测定两种峰的面积，并记录洗脱峰(“结合峰”)相对于总面积的百分比。
为将该方法应用于高通量分析目的以及在抗体制剂中定量非岩藻糖基化％，首先通过亲和层析使用蛋白质A在Agilent 1200 HPLC系统上从上清液纯化样品，并收集至96孔板。在10mM Tris、50mM甘氨酸、100mM NaCl，pH 3中洗脱样品，通过加入1：40(v/v)2M TrispH 8中和，并在FcγRIIIa(V158)层析柱上再进样。由于蛋白质A层析法后抗体浓度是已知的，将进样量调整至在FcγRIIIa(V158)层析柱上进样10μg各样品。
在洗涤缓冲液中将野生型和糖改造的抗体混合，以获得不同非岩藻糖基化比例，并在FcγRIIIa(V158)柱上直接层析法地分析。通过MALDI TOF MS测定的非岩藻糖基化％和在FcγRIIIa(V158)层析柱上“结合峰”％显示线性相关性(图4)。
通过两种不同方法平行分析表达糖改造的IgG“C”的不同细胞克隆的细胞培养上清液：1)蛋白质A层析法，随后MALDI TOF MS和2)后续为FcγRIIIa(V158)层析法的蛋白质A层析法。对于该高通量分析，在蛋白质A层析柱上进样100μl上清液，通过加入1：40(v/v)2MTris pH 8来中和洗脱液，并或者用PNGase F消化以用于碳水化合物的MALDI TOF MS分析或在FcγRIIIa(V158)层析柱上进样。蛋白质A层析法与FcγRIIIa(V158)层析法组合的优点是含有从蛋白质A柱洗脱的样品的96孔板无需其它的缓冲液更换或移液步骤，即可在中和后直接使用。对于由不同细胞克隆生产的抗体，将FcγRIIIa(V158)柱上“结合峰”的面积％与通过MALDI TOF MS获得的非岩藻糖基化％对比。用两种方法获得的类似等级，显示本发明的方法允许产生具有最高非岩藻糖基化程度的抗体的克隆的鉴别(图5)。
这些结果显示，可将FcγRIIIa层析法用于以高通量方式筛选细胞培养上清液，并根据它们的非岩藻糖基化程度将产生的抗体分级。
实施例4
制备用FcγRIIIa层析
亲和力基质的制备。将30mg FcγRIIIa(V158)偶联于NHS活化的Sepharose 4FF(GE Healthcare，Sweden)。简而言之，将FcγRIIIa(V158)交换到0.2M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.2中，浓缩至2ml的最终体积，并在室温下用3ml NHS活化的珠粒孵育4小时，所述NHS活化的珠粒之前用1mM冷HCl洗涤。除去上清液，并将珠粒用0.1M Tris，pH 8.5在室温下进一步孵育2小时。然后，通过重力流动将珠粒填装至空的Tricorn5/150柱(GE Healthcare，Sweden)，随后在1.2ml/min下使用 Explorer10(GE Healthcare，Sweden)填装。在14cm的柱长度下，最终柱体积为2.7ml。将30mg人FcγRIIIa(V158)固定。
使用固定在NHS Sepharose 4FF的FcγRIIIa(V158)制备具有不同程度的非岩藻糖基化的抗体的分离物。对于层析法，用10个柱体积的20mM Tris、20mM MOPS、20mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH 8将柱平衡，并在0.1ml/min的流速下加载3mg纯化抗体(通过蛋白质A亲和层析和尺寸排阻层析)。用5个柱体积的20mM Tris、20mM MOPS、20mM柠檬酸钠、100mMNaCl，pH 8洗涤柱，并且用三个pH阶梯在pH 4.6、pH 4.2和pH 3下洗脱不同抗体群(图6)。通过将20mM Tris、20mM MOPS、20mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH 8和20mM Tris、20mM MOPS、20mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH 3以适当的比例混合来获得期望的pH值。收集峰，浓缩并在蛋白质A HPLC上进样用于纯化，或用蛋白质A珠粒(要求用于后续MALDI TOF MS分析)批纯化。随后分析抗体的碳水化合物组成，它们与FcγRIIIa(V158)结合，以及它们诱导ADCC的能力。
实施例5
分离抗体的分析
碳水化合物组成的分析。对于寡糖的MALDI TOF MS分析，用PNGase F和Endo H从纯化抗体切割掉寡糖(16)。FcγRIIIa(V158)层析法分离具有不同含量的非岩藻糖基化聚糖的抗体级分。对应于流穿的第一峰具有最低量的非岩藻糖基化寡糖，随后是峰二和峰三(参见表2和表3)。然而，MALDI TOF MS分析仅显示制剂中非岩藻糖基化寡糖的总量。
为测定岩藻糖残基在两条抗体重链上Fc结构域中的分布，在使用Endo S和Endo H的组合处理中消化样品(描述于上文和PCT公开No.WO2011/039150中，其通过引用以其整体明确并入本文)。
对于IgG“A”，用纤溶酶、Endo H和Endo S消化纯化的抗体，以获得仅带有寡糖核心第一N-乙酰葡糖胺残基和岩藻糖残基(在岩藻糖基化碳水化合物的情况下)的Fc片段。通过ESI-MS分析这些Fc片段并且测定每个Fc片段上的岩藻糖分布(表1)。
表1.通过FcγRIIIa(V158)层析法的三种级分中分离的IgG“A”的抗体库的非岩藻糖基化碳水化合物的含量。PNGase F处理(7次运行的平均值)后通过MALDI TOF MS全面测定非岩藻糖基化程度或纤溶酶/Endo S/Endo H消化后通过ESI-MS测定每个Fc的岩藻糖分布(3次运行的合并)。
*各自峰中洗脱的所有聚糖的缺乏岩藻糖残基的聚糖的百分比。
+MALDI TOF和ESI-MS结果的对比计算值。通过所有三种Fc糖型的缺乏岩藻糖的聚糖的百分比相加来计算数值。例如在峰2，Fc片段的22/100包含2种非岩藻糖基化聚糖(即44/200聚糖为非岩藻糖基化)，64/100Fc片段包含1种非岩藻糖基化聚糖(即64/200聚糖为非岩藻糖基化)，而14/100Fc片段不包含任何非岩藻糖基化聚糖(即0/200聚糖为非岩藻糖基化)，得到峰2中洗脱的非岩藻糖基化聚糖共计44+64+0＝108/200＝54％。
对于IgG“B”，用Endo H(QA Bio)和Endo S(Genovis)消化纯化的抗体，以获得含有聚糖的完整IgG，所述聚糖由含有或不含岩藻糖的寡糖核心的第一N-乙酰葡糖胺残基组成。通过ESI-MS分析这些样品并且测定每个抗体的岩藻糖的分布(表2)。
表2.通过FcγRIIIa(V158)层析法的三种级分中分离的IgG“B”的抗体库的非岩藻糖基化碳水化合物的含量。PNGase F处理后，通过MALDI-TOF MS全面测定非岩藻糖基化程度(2次运行的平均值)或Endo S/Endo H消化后通过ESI-MS测定每个IgG的岩藻糖分布(2次运行的平均值)。
*各自峰中洗脱的所有聚糖的缺乏岩藻糖残基的聚糖的百分比。
+MALDI TOF和ESI-MS结果的对比计算值。通过所有三种Fc糖型的缺乏岩藻糖的聚糖的百分比相加来计算数值。例如在峰2，Fc片段的20.5/100包含2种非岩藻糖基化聚糖(即41/200聚糖为非岩藻糖基化)，68.5/100Fc片段包含1种非岩藻糖基化聚糖(即68.5/200聚糖为非岩藻糖基化)，而11/100Fc片段不包含任何非岩藻糖基化聚糖(即0/200聚糖为非岩藻糖基化)，得到峰2中洗脱的非岩藻糖基化聚糖共计41+68.5+0＝109.5/200＝54.8％。
对于IgG“A”和“B”，峰1含有两种重链上Fc结构域中带有岩藻糖基化糖的大部分抗体(即完全岩藻糖基化抗体)，然而峰2含有大部分具有一种岩藻糖基化和一种非岩藻糖基化碳水化合物的抗体，并且峰3的群含有大部分完全非岩藻糖基化的抗体。通过ESI-MS方法似乎略微低估了完全非岩藻糖基化的抗体％，因为计算值(参见上面表1和2中的最后一列)通常低于MALDI TOF MS结果。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。测试不同级分诱导ADCC的能力。收获Raji(用于IgG“A”的ADCC测定)或A549(用于IgG“B”的ADCC测定)细胞(用胰蛋白酶/EDTA处理贴壁细胞)，用钙黄绿素(Invitrogen)洗涤并在37℃下标记30分钟。30分钟后，用AIM V培养基将细胞洗涤3次并重悬浮于AIM V培养基中。以30,000细胞/孔的浓度铺板于圆底96孔板。加入各自的抗体稀释液孵育10分钟，然后与人效应细胞(NK92 1708克隆LC3E11为用FcγRIIIa(V158)转染的NK92细胞)接触。将以3：1比例的效应细胞和靶细胞在37℃下共孵育4小时。使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche Applied Science，目录号11 644 793 001)测量乳酸脱氢酶(LDH)释放。用硼酸盐缓冲液(5mM硼酸盐，0.1％(v/v)Triton X-100)通过裂解剩余的细胞测定钙黄绿素保留物，随后测量钙黄绿素荧光。对于抗体依赖性杀伤的计算，将自发释放(仅靶细胞和效应细胞而不含抗体)设定为0％杀伤，并且将最大释放(靶细胞和2％(v/v)Triton X-100)设定为100％杀伤。
与野生型IgG相比，仅第一峰(含有在两个重链上具有岩藻糖基化碳水化合物的抗体)具有降低诱导ADCC的能力(图7)。峰2和3具有相当的诱导ADCC的能力，显示每种抗体中仅有一种非岩藻糖基化聚糖足以向IgG传达优异的ADCC能力。
通过表面等离振子共振结合FcγRIIIa。在25℃下测定表面等离振子共振。按照生产商说明书(GE Healthcare，Sweden)，通过胺偶联将人抗原“B”固定在CM5芯片上。在100nM和10μl/min下捕获IgG级分90s。人FcγRIIIa(V158)在1.95-500nM的浓度范围内以50μl/min的流速通过流通池120s。监测解离220s。下一次进样前，用10mM甘氨酸，pH 2进样两次60s再生表面。通过减去在对照流通池上获得的响应来校正体折射系数差异。使用简单的一一对应的Langmuir结合模型，RI＝0，而Rmax＝局部( T100评价软件版本1.1.1)，通过同时拟合结合和解离传感图，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比例。
通过表面等离振子共振获得的结果符合ADCC测定的结果(表3和图8)。第一峰以及野生型IgG“B”的KD约50nM，结合速率和解离速率非常快，然而对于结合至FcγRIIIa(V158)，峰2和3以及糖改造的IgG“B”的KD约3nM并且解离速率慢得多。峰3的IgG对FcγRIIIa具有最高亲和力(V158)。
表3.FcγRIIIa(V158)和IgG“B”之间的亲和力。通过表面等离振子共振在25℃下获得KD。在固定化抗原上捕获通过FcγRIIIa(V158)层析法分离的IgG“B”的抗体库的三个峰和起始材料，并将FcgRIIIa(V158)用作分析物。拟合：动力学(1：1结合RI＝0，Rmax＝局部)或稳态。
综上所述，实施例显示，FcγRIIIa(V158)层析法允许根据抗体的Fc结构域中它们的非岩藻糖基化碳水化合物的含量分离抗体。可将方法应用于以高通量方式(结合蛋白质A层析法)筛选上清液，以鉴别产生具有高非岩藻糖基化程度的抗体的克隆或根据其岩藻糖含量分离IgG的级分用于进一步鉴定。用FcγRIIIa(V158)层析法分离的抗体群的分析首次显示，大部分在Fc结构域中具有一种或两种非岩藻糖基化碳水化合物的IgG表现相同的ADCC，因此无需100％非岩藻糖基化的抗体群以实现增强的效应子功能。
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尽管为了理解清楚的目的已经通过说明和实施例较详细地描述了上述发明，不应该把描述和实施例理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开明确地以引用方式整体并入。
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Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
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Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
210 215 220
<210> 2
<211> 669
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<400> 2
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaaggcaaa aagaaaaaga aaaagggcca ccaccatcac 660
catcactga 669
Claims (26)
1.一种用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供抗体的群，
b)使所述抗体的群与固定在载体上的Fc受体接触，
c)洗脱非特异性结合于所述Fc受体的所述抗体，和
d)洗脱特异性结合于所述Fc受体的所述抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述Fc受体对所述抗体的结合亲和力取决于所述抗体的岩藻糖基化程度。
3.权利要求1或2的方法，其中所述Fc受体为Fcγ受体。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述Fc受体为FcγRIIIa。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述Fc受体为FcγRIIIa(V158)。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体为IgG抗体。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体被糖改造为在它们的Fc区具有与相应的非糖改造抗体相比增加比例的非岩藻糖基化寡糖。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体的群是纯化的。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中使用蛋白质A或蛋白质G亲和纯化所述抗体的群。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述载体为聚合物基质。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述载体包含在层析柱中。
12.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
c1)洗涤所述载体。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)的洗脱包括在步骤b)中的接触后，在所述抗体群中保持游离的抗体的分离。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)中洗脱的所述抗体为完全岩藻糖基化抗体。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)的所述洗脱包括使所述载体与缓冲液接触，所述缓冲液中断抗体与所述Fc受体的结合。
16.权利要求15的方法，其中所述缓冲液的pH值在约3至约5的所述范围内。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中在不同pH值下实施步骤d)的洗脱。
18.权利要求17的方法，其中所述pH值包括4.6和4.2。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)洗脱的所述抗体为部分岩藻糖基化和/或完全非岩藻糖基化的抗体。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法被用于分析目的。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法被用于制备目的。
22.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
e)收集步骤c)和/或步骤d)的洗脱的抗体。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括以下步骤：
f)使用所述收集的抗体用于实验或治疗目的。
24.Fc受体在用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的方法中的用途。
25.固定在载体上的Fc受体，用于分离具有不同岩藻糖基化程度的抗体的方法。
26.如上文所述的发明。
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