KR102617873B1 - 티로신 황산화 항체 변이체의 제거를 위한 정제 프로세스, 정제된 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이뮤노글로불린 쇄 내 하나 이상의 티로신 잔기 상에서의 황산화된 티로신이 결여된 정제된 항체 및 항원-결합 단편 조성물에 관한 것이다. 황산화된 티로신 변이체를 항체 및 항원-결합 단편 조성물로부터 제거하기 위한 정제 방법이 또한 제공된다.
Description
본 발명은 티로신 황산화가 결여된 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 상기 조성물을 제조하기 위한 정제 방법에 관한 것이다.
티로신 황산화는 술페이트 트리옥시드 (SO3) 기가 아미노산 티로신 기의 측쇄 상의 히드록실 기에 공유적으로 결합되는 번역후 변형 (PTM)이다. 이러한 PTM은 트랜스-골지 네트워크에서 발생하고, 2종 효소, 티로실프로테인 술포트랜스퍼라제 (TPST)에 의해 촉매된다. 분자 메카니즘은 활성화된 술페이트의 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트에서 티로신으로의 전달을 수반하고, 다양한 단백질 및 펩티드 상에서 발견된 바 있다. 최근의 발견은 티로실프로테인 술포트랜스퍼라제 2가 황산화를 위한 산 잔기에 의해 플랭킹된 티로신을 인식한다는 것을 나타낸다. 이러한 PTM은 단백질 사이의 상호작용을 강화하는 것을 담당하고 분비형 및 막횡단 스패닝 단백질 상에서 발생한다. 일부 케모카인 수용체는 예컨대 CCR5, 주요 HIV-1 및 여러 당단백질 호르몬 수용체의 N-말단 세포외 도메인에서 티로신 황산화되는 것으로 제시된 바 있다. 예를 들어, 거머리-유래된 트롬빈 억제 펩티드 히루딘의 천연 형태는 티로신 황산화된다. 흥미롭게도, 다양한 혈액 응고 장애를 치료하기 위해 사용된 히루딘의 2종의 재조합 형태 (레바스크(Revasc) 및 레플루단(Refludan))는 황산화되지 않는다. 황산화는 생체분자의 질량을 80 Da만큼 증가시키며, 이는 포스페이트 모이어티 (PO3)와 동일한 질량 차이이다. 꽤 안정한 P-O 결합을 형성하는 PO3과는 달리, SO3은 매우 불안정성이고 고온 및 낮은 pH 조건 하에 용이하게 분해된다.
치료 항체 제제에서의 상이한 PTM 변이체의 존재는 불균질성으로 이어지며, 이는, 변형의 위치에 따라, 항체 효력, 생체이용률 또는 면역원성의 변경으로 이어질 수 있다. 이러한 이슈는 또한 규제 기관 앞에 이슈를 생성한다. 티로신 황산화가 케모카인 수용체 및 다른 단백질에서 기재된 바 있을지라도, 이러한 변형이 항체 제제에서 발생하는지를 확인할 필요가 있고, 확인되면 그들을 제거할 필요가 있다.
본 발명은, 예를 들어,
아미노산 서열: KASQSLDYEGDSDMN (서열식별번호(SEQ ID NO): 38)을 포함하는 CDR-L1;
아미노산 서열: GASNLES (서열식별번호: 39)를 포함하는 CDR-L2; 및
아미노산 서열: QQSTEDPRT (서열식별번호: 40)를 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및/또는
아미노산 서열: DYNVD (서열식별번호: 33)를 포함하는 CDR-H1;
하기 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2:
DINPNNGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 59);
DINPNSGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 60);
DINPNDGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 61);
DINPNQGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 62);
DINPNGGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 63); 또는
DINPNX1GGTIYX2QKFX3X4 (서열식별번호: 64) 여기서, X1= D, N, S 또는 Q, X2= A 또는 S, X3= Q 또는 K, 및 X4= E 또는 G; 및
CDR-H3: NYRWFGAMDH (서열식별번호: 35)
를 포함하는 중쇄 가변 도메인
을 포함하며, 검출가능한 수준의 CDR-L1 상에서의 황산화된 티로신이 결여된 항-LAG3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9)을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물 중 항체 또는 단편은 추가로 검출가능한 수준의 FR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3, FR-L4, FR-H1, CDR-H1, FR-H2, CDR-H2, FR-H3, CDR-H3, FR-H4 및 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성원에서의 황산화된 티로신이 결여된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 단편은 조작된 효모 또는 CHO N-연결된 글리칸을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9) 함유 조성물은 티로신 황산화가 결여되고 약 148590 Da, 148752 Da 및/또는 148914 Da의 분자량을 갖는 (예를 들어, G0F 및/또는 G1F 글리칸 종 (예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같음), 피로글루타메이트로 전환된 N-말단 중쇄 글루타민 및/또는 제거된 C-말단 중쇄 리신을 갖는) 항체의 하나 이상의 종을 포함한다.
본 발명은 또한 티로신 황산화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9)을 (예를 들어, CDR-L1 상에서의) 하나 이상의 황산화된 티로신을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편 및 황산화된 티로신이 결여된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 수성 혼합물로부터 제거하기 위한 방법이며, 혼합물의 pH를 약 6.5 내지 약 7.0 또는 약 6.5 내지 약 7.5로 조정하고, 혼합물을 음이온 교환 수지와 접촉시키고, 혼합물의 비-수지 결합된 수성 분획을 수지로부터 제거 및 보유하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 칼럼을 수성 조성물로, 예를 들어, 등용매 조건 하에 세척하고, 세척 조성물을 수지로부터 제거 및 보유하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수지는 칼럼 내에 있고, 방법은 상기 혼합물을 칼럼에 부가하고, 유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 크로마토그래피 칼럼 내 디메틸아미노프로필 음이온 교환 리간드를 포함하는 크로마토그래피 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5로 평형화시키고, 혼합물의 pH를 약 6.5로 조정하고, 혼합물을 칼럼에 적용하고, 유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고, 칼럼 내 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5로 세척하고, 유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 크로마토그래피 칼럼 내 4급화된 폴리에틸렌이민 음이온 교환 리간드를 포함하는 크로마토그래피 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0; 임의적으로, 5 mM NaCl로 평형화시키고, 혼합물의 pH를 약 7.0으로 조정하고, 혼합물을 칼럼에 적용하고, 유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고, 칼럼 내 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.0; 임의적으로, 5 mM NaCl로 세척하고, 유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 유동-관통물의 A280 흡광도는 모니터링되고, A280이 적어도 약 2.5 흡광도 단위/cm에 처음 도달할 때 수집 및 보유되고; A280이 약 1.0 흡광도 단위/cm 미만으로 떨어질 때 수집 및 보유되지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 항체 또는 항원-결합 단편을 양이온 교환 크로마토그래피, 추가로 결합-용리 모드의 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 단백질-A 크로마토그래피, 단백질-L 크로마토그래피, 단백질-G 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 분별 침전, 여과, 원심분리 또는 바이러스 불활성화에 의해 정제하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 중쇄는 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 발현된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
아미노산 서열: KASQSLDYEGDSDMN (서열식별번호: 38)을 포함하는 CDR-L1;
아미노산 서열: GASNLES (서열식별번호: 39)를 포함하는 CDR-L2; 및
아미노산 서열: QQSTEDPRT (서열식별번호: 40)를 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및/또는
아미노산 서열: DYNVD (서열식별번호: 33)를 포함하는 CDR-H1;
하기 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2:
DINPNNGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 59);
DINPNSGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 60);
DINPNDGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 61);
DINPNQGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 62);
DINPNGGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 63); 또는
DINPNX1GGTIYX2QKFX3X4 (서열식별번호: 64) 여기서, X1= D, N, S 또는 Q, X2= A 또는 S, X3= Q 또는 K, 및 X4= E 또는 G; 및
CDR-H3: NYRWFGAMDH (서열식별번호: 35)
를 포함하는 중쇄 가변 도메인.
이러한 방법의 산물인 조성물은 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9)는 AEX 크로마토그래피에 의해 정제되며, 여기서 황산화된 티로신이 결여된 항체는 약 148590 Da, 148752 Da 및/또는 148914 Da의 분자량을 갖는다 (예를 들어, G0F 및/또는 G1F 글리칸 종 (예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같음), 피로글루타메이트로 전환된 N-말단 중쇄 글루타민 및/또는 제거된 C-말단 중쇄 리신을 가짐).
도 1. AEX 피드 (굵은 트레이스), 스트립 (얇은 트레이스) 및 풀 분획 (점선 트레이스)의 IEX-HPLC UV 프로파일의 오버레이.
도 2. AEX 피드, 풀 및 스트립 샘플의 무손상 질량 스펙트럼.
도 3. AEX 풀 및 스트립 샘플의 환원된 경쇄 질량 스펙트럼.
도 4a-b. AEX 풀 및 스트립 분획의 환원된 LysC 펩티드 맵핑의 UV 트레이스.
도 5a-c. (a) 400-1800 m/z에서의 경쇄 AA25-43+80 Da의 CID 단편화 스펙트럼 (b) m/z 300-1100에서의 줌 인 (c) m/z 1200-2000에서의 줌 인.
도 6. 경쇄 펩티드 AA25-43+80 Da의 ETD 단편화. 80Da 부착된 단편 이온을 표지하였다.
도 7a-b. (a) 알칼리성 포스파타제 처리의 존재 및 부재 하의 AEX 스트립 분획의 디콘볼루션된 무손상 질량 스펙트럼. (b) 알칼리성 포스파타제 처리의 존재 및 부재 하의 닭 오브알부민의 디콘볼루션된 무손상 질량 스펙트럼.
도 8a-b. (a) mAb AEX 풀 및 스트립의 정규화된 농도를 환원된 SDS-PAGE에 적용하고, 웨스턴 혼성화에 의해 인간 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)에 대해 프로빙하고 (상부 패널), 이어서 스트리핑하고, 항술포티로신에 대해 재-프로빙하였다 (하부 패널). 우측 끝에 있는 HC 및 LC에 대한 지표 참조. (b) AEX 스트립 및 풀 이외의 상이한 CHO-유래된 mAb의 정규화된 농도를 환원된 SDS PAGE에 적용하고, 웨스턴 혼성화에 의해 인간 HC 및 LC에 대해 프로빙하고, 이어서 스트리핑하고, 항술포티로신에 대해 재-프로빙하였다. (a) 및 (b) 둘 다에 대해 매직마크(MagicMark) XP를 단백질 분자량 표준으로서 사용하였고, 동등량의 HEK293 및 EGF-처리된 A431 세포 추출물을 대조군으로서 분석한다.
도 9a-c. 하기의 SIC: (a) AEX 스트립 분획으로부터의 LC25-43+80 Da, (b) 합성 펩티드 XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)+인산화 및 (c) 합성 펩티드 XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)+황산화.
도 10. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 리본 다이아그램으로의 CDR 루프를 제시하는 mAb 티로신 (Y31) 부위.
도 11. 하기에서 생산된 모노클로날 항체에 대한 우세한 N-연결된 글리칸: 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO N-연결된 글리칸) 및 조작된 효모 세포 (조작된 효모 N-연결된 글리칸): 사각형: N-아세틸글루코사민 (GlcNac); 원형: 만노스 (Man); 다이아몬드형: 갈락토스 (Gal); 삼각형: 푸코스 (Fuc).
도 2. AEX 피드, 풀 및 스트립 샘플의 무손상 질량 스펙트럼.
도 3. AEX 풀 및 스트립 샘플의 환원된 경쇄 질량 스펙트럼.
도 4a-b. AEX 풀 및 스트립 분획의 환원된 LysC 펩티드 맵핑의 UV 트레이스.
도 5a-c. (a) 400-1800 m/z에서의 경쇄 AA25-43+80 Da의 CID 단편화 스펙트럼 (b) m/z 300-1100에서의 줌 인 (c) m/z 1200-2000에서의 줌 인.
도 6. 경쇄 펩티드 AA25-43+80 Da의 ETD 단편화. 80Da 부착된 단편 이온을 표지하였다.
도 7a-b. (a) 알칼리성 포스파타제 처리의 존재 및 부재 하의 AEX 스트립 분획의 디콘볼루션된 무손상 질량 스펙트럼. (b) 알칼리성 포스파타제 처리의 존재 및 부재 하의 닭 오브알부민의 디콘볼루션된 무손상 질량 스펙트럼.
도 8a-b. (a) mAb AEX 풀 및 스트립의 정규화된 농도를 환원된 SDS-PAGE에 적용하고, 웨스턴 혼성화에 의해 인간 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)에 대해 프로빙하고 (상부 패널), 이어서 스트리핑하고, 항술포티로신에 대해 재-프로빙하였다 (하부 패널). 우측 끝에 있는 HC 및 LC에 대한 지표 참조. (b) AEX 스트립 및 풀 이외의 상이한 CHO-유래된 mAb의 정규화된 농도를 환원된 SDS PAGE에 적용하고, 웨스턴 혼성화에 의해 인간 HC 및 LC에 대해 프로빙하고, 이어서 스트리핑하고, 항술포티로신에 대해 재-프로빙하였다. (a) 및 (b) 둘 다에 대해 매직마크(MagicMark) XP를 단백질 분자량 표준으로서 사용하였고, 동등량의 HEK293 및 EGF-처리된 A431 세포 추출물을 대조군으로서 분석한다.
도 9a-c. 하기의 SIC: (a) AEX 스트립 분획으로부터의 LC25-43+80 Da, (b) 합성 펩티드 XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)+인산화 및 (c) 합성 펩티드 XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)+황산화.
도 10. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 리본 다이아그램으로의 CDR 루프를 제시하는 mAb 티로신 (Y31) 부위.
도 11. 하기에서 생산된 모노클로날 항체에 대한 우세한 N-연결된 글리칸: 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO N-연결된 글리칸) 및 조작된 효모 세포 (조작된 효모 N-연결된 글리칸): 사각형: N-아세틸글루코사민 (GlcNac); 원형: 만노스 (Man); 다이아몬드형: 갈락토스 (Gal); 삼각형: 푸코스 (Fuc).
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현된 특정 항체 및 다른 단백질은 황산화된 티로신 변이체로 오염된다. 이러한 변이체의 질량 분광사진 분석은 부가된 술페이트 기의 질량에 상응하는 약 +80 Da의 부가물을 특징으로 한다. 이러한 부가물은 또한 항-황산화된 티로신 항체와 저항성 및 반응성인 알칼리성 포스파타제이다. 본 발명은 이러한 오염 티로신 황산화된 변이체를 포함하는 조성물을 정제하기 위한 방법 뿐만 아니라 상기 변이체가 본질적으로 없는 항체 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 관련 기술 분야에 널리 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은, 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 관련 기술분야에 널리 알려지고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용 및 논의된 다양한 일반적인 참고문헌 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [James M. Cregg (Editor), Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010), Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)] 참조.
황산화된 티로신은, 예를 들어, 하기 구조를 갖는 부가된 술페이트 기를 갖는 티로신을 포함한다:
크로마토그래피
본 발명은 황산화된 티로신을 포함하는 오염 변이체 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Ab1-Ab9)을 조성물, 예를 들어, 일부는 황산화된 티로신을 갖고 일부는 황산화된 티로신이 결여된 항체 또는 단편의 혼합물을 포함하는 조성물로부터 제거하여 검출불가능한 수준의 티로신 황산화된 변이체 (예를 들어, Ab1 또는 Ab6의, 예를 들어, 티로신 황산화된 CDR-L1)를 포함하는 조성물을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 유동-관통 모드의 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피에 의해 처리되어 티로신 황산화된 변이체가 제거된다. 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 수지는 디메틸아미노프로필 리간드 (즉, 디메틸아미노프로필 모이어티를 포함하는 리간드)를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 크로마토그래피에 적용된 조성물은 선행 단백질-A 크로마토그래픽 정제의 산물이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은, 예를 들어, AEX 처리 (예를 들어, 디메틸아미노프로필 리간드를 가짐) 전에 트리스 (예를 들어, 0.5M, 0.725M 또는 1M)로 약 6.5의 pH로 pH 조정된다. 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 칼럼 (예를 들어, 디메틸아미노프로필 리간드를 가짐)은, 예를 들어, 나트륨 포스페이트, 예를 들어, 25 mM, 예를 들어, 나트륨 포스페이트 pH 5, 6.2 또는 6.5로 평형화된다. 칼럼 (예를 들어, 디메틸아미노프로필 리간드를 가짐)은, 본 발명의 한 실시양태에서, 완충제로 (예를 들어, 나트륨 포스페이트, 예를 들어, 25 mM, 예를 들어, 나트륨 포스페이트 pH 6.5로) 세척되어, 칼럼 내에 있지만 AEX 수지에 단단히 결합되지 않은 항체 또는 단편이 회수될 수 있다. AEX 수지에 단단히 결합되지 않은 유동-관통물은 수집되고 (예를 들어, 분획으로), 예를 들어, 풀링된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 사용 후에, 칼럼은, 예를 들어, 1M NaCl로 스트리핑된다.
AEX 유동-관통 물질의 질량 분광측정법 분석은 CDR-L1 상에서의 티로신 황산화가 결여된 Ab6의 여러 글리코실화된 종을 밝혀내었다. 이들 종은 하기 표 1에 요약된다. 이들 이론적 질량은 중쇄 상의 N-말단 글루타민이 N-말단 피로글루탐산으로 전환되고 (pE1) 및 중쇄 상의 C-말단 리신이 제거된 (-K) Ab6 분자의 계산된 질량을 지칭한다.
* 글리칸 종 G0F 및 G1F의 아이덴티티에 대해 도 11 참조
본 발명은 약 148590, 148749, 및/또는 148915 중 하나 이상의 분자량을 갖는 종을 포함하고/거나; 글리칸 종 G0F 및/또는 G1F를 포함하는, 검출가능한 수준의, 예를 들어, CDR-L1 상에서의, 티로신 황산화가 결여된 항-LAG3 항체 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9; 바람직하게는 Ab6)를 포함하는 조성물을 포함한다.
유동-관통 모드는 폴리펩티드의 회수를 위한 용리 단계를 포함하지 않는 방법에 의한 크로마토그래피 수지를 사용한 폴리펩티드의 정제를 지칭한다. 이러한 방법에서, 관심 폴리펩티드는 수지에 단단히 결합하지 않지만, 관심 폴리펩티드로부터 제거될 오염 물질은 수지에 단단히 결합한다. 예를 들어, AEX 수지는 티로신 황산화를 갖는 오염 변이체 항체 및 티로신 황산화가 결여된 항체를 포함하는 조성물을 AEX 수지를 함유하는 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼의 유동-관통물 중 항체 또는 단편을 수집 및 보유하는 것을 포함하는 방법에서 유동-관통 모드로 사용된다. 황산화가 결여된 비결합된 항체는 용리로 이어지지 않는 조건, 예를 들어, 등용매 조건 하에 칼럼으로부터 세척 제거 (및 보유)될 수 있다. 이러한 방법에서, 오염물은 칼럼에 결합된 채로 남아있고 티로신 황산화가 결여된 항체는 유동-관통물에 남아있을 것이다.
결합/용리 모드는 용리 단계를 포함하는 방법에 의한 크로마토그래피 수지를 사용한 폴리펩티드의 정제를 지칭한다. 이러한 방법에서, 관심 폴리펩티드는 수지에 단단히 결합하지만, 관심 폴리펩티드로부터 제거될 오염 물질은 수지에 단단히 결합하지 않는다. 크로마토그래피 칼럼에 있어서, 오염물은 칼럼을 통해 유동하고 주로 수지에 비결합된 채로 남아있다. 결합된 항체는, 임의적인 세척 후, 비결합되고 수지로부터의 결합해제를 야기하는 용리 완충제에 노출된 경우에 수집 및 보유된다.
크로마토그래피 수지 리간드는 고정상 입자 (예를 들어, 세파로스 입자)에 고정된 물질이며, 이는 다중-구성성분 이동상에 존재하는 목적하는 분자 (예를 들어, 항체 또는 오염물)에 가역적으로 결합한다.
본 발명의 한 실시양태에서, AEX 수지는 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 (즉, 4급화된 폴리에틸렌이민 모이어티를 포함하는 리간드)를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수지 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드를 가짐)는 1M NaCl로 사전 평형화시킨다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수지 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드를 가짐)는 나트륨 포스페이트, 예를 들어, 25 mM 및 NaCl, 예를 들어, 5 mM; pH 약 7.0으로 평형화시킨다. 본 발명의 한 실시양태에서, 칼럼 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드를 가짐)은 피드로 로딩하고, 나트륨 포스페이트, 예를 들어, 25 mM 및 NaCl, 예를 들어, 5 mM; pH 약 7.0으로 세척하고; 유동-관통물은, 예를 들어, 분획으로, 예를 들어 수집되고 풀링된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 크로마토그래피 칼럼 내 음이온 교환 리간드를 포함하는 크로마토그래피 수지를 약 10-50 mM 나트륨 포스페이트; pH 약 6.5 내지 7.5로 평형화시키고, 혼합물의 pH를 약 6.5 내지 7.5로 조정하고, 혼합물을 칼럼에 적용하고, 유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고, 칼럼 내 수지를 약 10-50 mM 나트륨 포스페이트; pH 약 6.5 내지 7.5로 세척하고, 유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명의 방법은 크로마토그래피 칼럼 내 음이온 교환 리간드를 포함하는 크로마토그래피 수지를 약 10-50 mM 나트륨 포스페이트; pH 약 6.5 내지 7.0으로 평형화시키고, 혼합물의 pH를 약 6.5 내지 7.0으로 조정하고, 혼합물을 칼럼에 적용하고, 유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고, 칼럼 내 수지를 약 10-50 mM 나트륨 포스페이트; pH 약 6.5 내지 7.0으로 세척하고, 유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것을 포함한다.
임의의 적합한 수량의 항체 또는 항원-결합 단편은 크로마토그래피 수지, 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 또는 디메틸아미노프로필 리간드를 갖는 AEX) 상에 로딩될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 100-150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 150-200, 100-200, 250-350, 또는 280-320 그램의 물질, 예를 들어, 항체 또는 단편이 수지 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 또는 디메틸아미노프로필 리간드를 갖는 AEX)의 리터당 로딩된다.
크로마토그래피 칼럼 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 또는 디메틸아미노프로필 리간드를 갖는 AEX 수지를 함유함)이 사용되는 경우에, 임의의 허용되는 치수가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 칼럼 직경 또는 높이는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 cm이다.
유량은 일정 기간에 걸쳐 칼럼 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 또는 디메틸아미노프로필 리간드를 갖는 AEX 수지를 함유함)을 통과하는 이동상의 부피를 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 유량은 시간당 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215 리터이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 칼럼 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 또는 디메틸아미노프로필 리간드를 갖는 AEX 수지를 함유함)의 유동-관통물의 280 nm에서의 흡광도 (A280)는 모니터링된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 유동-관통물의 주요 A280 피크에서의 항체 또는 단편 산물은 수집 및 보유된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 유동-관통물은 A280이 cm (경로 길이)당 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 또는 3.0 A280 흡광도 단위에 도달할 때 수집되고, 수집은 A280이 cm (경로 길이)당 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 또는 3.0 A280 흡광도 미만으로 떨어질 때 중지된다.
이동상에서의 미립자 물질로 인한 막힘으로부터 크로마토그래피 칼럼 (예를 들어, 4급화된 폴리에틸렌이민 리간드 또는 디메틸아미노프로필 리간드를 갖는 AEX 수지를 함유함)을 보호하기 위해, 프리-칼럼 필터가 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 필터는 폴리에테르술폰 막이다. 또한, 유동-관통물로부터 임의의 미립자를 여과하기 위해 포스트-칼럼 필터가 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 필터는 0.2 또는 0.5 μm 세공 크기를 갖는다.
황산화된 티로신을 갖는 변이체의 존재는, 예를 들어, 유동-관통 분획의 질량 분광사진 분석에 의해 확증될 수 있다. 황산화된 변이체는 비-황산화된 변이체보다 더 높은 질량을 가질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 황산화된 변이체는 황산화가 결여된 변이체보다 약 80 Da 더 무겁다. 본 발명의 한 실시양태에서, 황산화는 포스파타제에 의한 소화에 대해 저항성이 있고, 황산화된 펩티드는 인산화된 펩티드와 비교 시 전자 전달 해리 (ETD)에 의한 상이한 단편화 패턴을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 티로신 황산화가 결여된 항체 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9; 바람직하게는 Ab6)를 포함하는 조성물은 검출가능한 (예를 들어, CDR-L1에서의) 티로신 황산화가 결여된 조성물을 지칭한다. 검출불가능한 수준의 (예를 들어, CDR-L1에서의) 티로신 황산화를 포함하는 조성물은 조성물의 질량 분광측정법 분석에 의해 관찰될 수 없는 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물의 질량 분광측정법 분석은 조성물의 이뮤노글로불린 펩티드의 무손상 및 환원된 질량 측정 및 환원된 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 환원된 펩티드 맵핑은 항체 이뮤노글로불린 디술피드 결합의 변성 및 환원, 및 유리 시스테인의 알킬화, 이어서 효소적 소화 (예를 들어, LysC, 트립신 또는 GluC를 사용함)를 포함한다. 효소적 소화된 펩티드는 질량 분광측정법에 의해 분석되었다. 본 발명의 한 실시양태에서, "검출불가능한" 수준은 조성물 중 비변형된 종과 비교 시 약 0.5% 미만 (약 0.4, 0.3, 0.2, 0.1% 미만)의 (예를 들어, CDR-L1 상에서의) 티로신 황산화된 종을 지칭한다.
폴리펩티드의 분자량은, 예를 들어, (변형된 또는 비변형된/황산화된 또는 비황산화된) 아미노산의 기지의 중량 및 기지의 변형 (예를 들어 산화, 탈아미드화, 글리코실화, 및 C 및 N 말단 변형)을 기반으로 하여 계산될 수 있다. 분자량은, 예를 들어, 액체 크로마토그래피와 커플링될 때, 질량 분광측정법 분석에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 질량 분광측정법은 사중극자 비행 시간 (Q-TOF) 질량 분광측정법 또는 오비트랩 질량 분광측정법이다.
용어 "크로마토그래피"는 관심 용질, 예를 들어, 조성물 중 물질을, 흡착제로서 작용하는 수지에 물질을 접촉시킴으로써 조성물 중 다른 물질로부터 분리하는 프로세스를 지칭한다. 흡착제는, 예를 들어, 프로세스의 특정한 완충 조건 하에, pI, 소수성, 크기 및 구조와 같은 용질의 특성으로 인해 더 강하게 또는 덜 강하게 물질을 흡착 또는 보유한다. 크로마토그래피는 크로마토그래피 수지의 층을 통해, 예를 들어, 수지를 함유하는 칼럼을 통해 조성물의 퍼콜레이션의 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 배치 크로마토그래피 정제는 수지의 슬러리를 제조하고, 항체 또는 단편 함유 조성물을 슬러리와 접촉시켜 분리될 물질을 수지에 흡착시키는 것을 포함한다. 수지에 결합되지 않은 물질을 포함하는 용액은, 예를 들어, 슬러리가 침강되도록 하고 상청액을 제거함으로써 슬러리로부터 분리되고, 비-결합된 물질은 보유 또는 폐기될 수 있다. 슬러리는 임의적으로 하나 이상의 세척 단계에 적용된다. 목적하는 경우에, 슬러리는 적절한 용리 완충제와 접촉시켜 수지-결합된 물질을 수지로부터 탈착시킬 수 있다. 탈착된 물질은 보유 또는 폐기될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물 중 항체의 황산화된 티로신 변이체는 음이온 교환 수지에 결합되는 한편 비-황산화된 티로신 변이체는 수지에 유의하게 결합하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단백질-A 또는 단백질-G 크로마토그래피에 의해 정제된다. 단백질-G 및 단백질-A는 각각 그룹 G 스트렙토코쿠스 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 박테리아 단백질이다. IgG-유형 항체의 Fc 영역에 대한 단백질-G 및 단백질-A의 친화성은 IgG, Fc 영역을 함유하는 IgG 단편, 및 IgG 하위부류의 정제에 대한 기초를 형성한다. 단백질-A 또는 단백질-G는 단백질-A 또는 단백질-G 크로마토그래피에 대해 사용될 수 있는 세파로스와 같은 고체상에 커플링될 수 있다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 단백질-A 및/또는 단백질-G를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다중모드 크로마토그래피 (혼합-모드)에 의해 정제된다. 다중모드 또는 혼합-모드 단백질 크로마토그래피는 다중 모드의 상호작용, 예를 들어, 이온 교환, 히드록시아파타이트, 친화성, 크기 배제, 및/또는 소수성 상호작용을 할 수 있는 리간드로 관능화된 수지를 기반으로 한다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단백질-L 크로마토그래피에 의해 정제된다. 단백질 L은 이뮤노글로불린 경쇄를 통해 이뮤노글로불린에 결합하는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스(Peptostreptococcus magnus) 단백질이다. 단백질 L은 IgG, IgM, IgA, IgE, 및 IgD를 포함한, 대표적인 모든 항체 부류에 결합한다. 재조합 단백질 L은 이뮤노글로불린 및 이뮤노글로불린 단편의 카파 경쇄의 가변 영역에 결합한다. 단백질 L은 인간에서 4개의 카파 경쇄 하위유형 중 3개 (1, 3, 및 4) 및 마우스에서 카파 1에 결합한다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 단백질-L 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 정제된다. HIC는 소수성에서의 차이로 단백질을 분리한다. 분리는 단백질 및 크로마토그래피 매질의 소수성 표면 사이의 가역적 상호작용을 기반으로 한다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 HIC를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제된다. SEC는 분자 크기에서의 차이로 단백질을 분리한다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 SEC 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 바이러스 불활성화에 적용된다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 바이러스 불활성화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 pH 처리에 의해 수행된다. 구체적으로, pH 극한에 대한 조성물의 직접 노출은 바이러스 클리어런스를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, pH 처리는, 본 발명의 한 실시양태에서, 낮은 pH 처리 (예를 들어, pH 3.0-3.6)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 높은 pH 처리에 적용된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 바이러스 불활성화는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 용매 또는 세제로 수행된다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 바이러스 불활성화를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
"이온 교환"은 분자를 그의 순 표면 전하에서의 차이에 기초하여 분리한다. 분자는 그의 전하 특성에서 상당히 다르고, 그의 전체 전하, 전하 밀도, 및 표면 전하 분포에서의 차이에 따른 하전된 크로마토그래피 수지와의 상호작용의 상이한 정도를 나타낼 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.
어구 "이온 교환" 수지는 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환) 또는 양으로 하전된 (즉, 음이온 교환) 고체상을 지칭한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. "양이온 교환" 수지는 음으로 하전되고, 고체상 위로 또는 그를 통해 통과하는 수성 용액에서 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체상을 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하는데 적합한 고체상에 부착된 임의의 음으로 하전된 리간드가 사용될 수 있다. 양이온 교환 물질은 하기 리간드: 술포프로필 (SP) -CH2-CH2-CH2-SO3-; 메틸 술포네이트 (S) -CH2-SO3 -; 또는 카르복시메틸 (CM) -CH2-COO-를 갖는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. "음이온 교환" 수지는 양으로 하전되며, 이에 따라 그에 부착된 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 고체상을 지칭한다. 음이온 교환 수지를 형성하는데 적합한 고체상에 부착된 임의의 양으로 하전된 리간드가 사용될 수 있다. 음이온 교환 물질은 하기 리간드: 4급 암모늄 (Q) -CH2-N+-(CH3)3; 디에틸아미노에틸 (DEAE) -CH2-CH2-N+-(CH2-CH3)2; 또는 디에틸아미노프로필 (ANX) -CH2-CHOH-CH2-N+-(CH2-CH3)2를 갖는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고퓨어(GoPure) D 50 μm 칼럼은 디메틸아미노프로필 관능기를 갖는다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 (결합/용리 모드의) AEX 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
용어 "고체상" 또는 "고정상"은 하나 이상의 리간드 (예를 들어, 음이온 교환 리간드 또는 양이온 교환 리간드)가 부착될 수 있는 임의의 비-수성 매트릭스를 의미하기 위해 사용되거나, 또는 대안적으로, 크기 배제 크로마토그래피의 경우에, 이는 수지의 겔 구조를 지칭할 수 있다. 이동상은 크로마토그래픽 정제에서 항체 또는 항원-결합 단편을 고체상 위로 운반하는 액체, 예를 들어 수성 물질이다. 이동상은 칼럼에 적용된 로딩 완충제를 포함할 수 있다. 고체상을 형성하는데 사용될 수 있는 물질의 예는 폴리사카라이드 (예컨대 아가로스 및 셀룰로스) 및 다른 기계적으로 안정한 매트릭스 예컨대 실리카 (예를 들어, 제어된 세공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 이들 중 임의의 것의 유도체를 포함한다.
"평형화" 완충제 또는 용액은 정제를 위해 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 혼합물로의 로딩 전에 크로마토그래피 수지의 pH 및 전도성을 조정하는데 사용된다. 이러한 목적상 사용될 수 있는 적합한 완충제 또는 용액, 예를 들어, 예컨대 상기 기재된 완충제는 관련 기술분야에 널리 알려져 있고, 관심 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 단계에서 사용되는 선택된 수지와 상용성인 pH에서의 임의의 완충제를 포함한다.
"로딩" 완충제 또는 용액은 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 혼합물을 정제 수지 (예를 들어, 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지) 상에 로딩하는데 사용된다. 임의의 적절한 용액이 로딩 완충제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 로딩 완충제는 이전 정제 단계로부터 유래되는 완충 혼합물 예컨대 용리 완충제로부터 제조된다.
용어 "세척" 완충제 또는 용액은 항체 또는 항원-결합 단편을 용리하기 전에 정제 수지 (예를 들어, 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지)로부터 하나 이상의 불순물을 용리하는데 사용되는 조성물이다. 용어 "세척하는"은 적절한 조성물이 크로마토그래피 수지를 통해 또는 그 위로 통과하는 것을 기재한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세척액은 등용매이다. 등용매 세척 조건 하에, 크로마토그래피의 이동상은 본질적으로 동일하게 남아있다.
티로신 황산화된 변이체 항체 및 항원-결합 단편이 오염물일지라도, 본 발명은, 예를 들어, 비-티로신 황산화된 변이체의 부재 하에 AEX 크로마토그래피 수지에 결합된 또는 비결합된 이러한 변이체를 포함하는 조성물을 포함한다. 비결합된 변이체는 비-티로신 황산화된 항체 및 단편으로부터의 제거 후 AEX 칼럼으로부터 용리함으로써 수득될 수 있다.
"용리" 완충제는 크로마토그래피 수지에 결합된 분자 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)를 해리한다.
상류 프로세싱
오염 티로신 황산화된 변이체가 정제되어야 하는 항체 및 항원-결합 단편은 숙주 세포 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은, 한 실시양태에서, 변이체의 제거 전의, 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터의 항체 또는 항원-결합 단편의 발현 및 단리에 유리한 조건 하에 배양 배지 내 숙주 세포에서의 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린의 이러한 발현을 포함한다. 본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 숙주 세포 발현 및 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의-항원 결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 범주는 하기를 포함하는, (예를 들어, CDR-L1 상에서의) 티로신 황산화가 없는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 생산하기 위한 방법을 포함한다: (i) 상기 항체 또는 단편의 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) 내로 도입하는 단계, 및 (ii) 숙주 세포를 세포에서의 이뮤노글로불린 쇄의 발현에 유리한 조건 하에 배양하며, 예를 들어, 여기서 이뮤노글로불린 쇄(들)를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편은 숙주 세포로부터 배양 배지 내로 분비되는 것인 단계, 및 (iii) 본원에 논의된 바와 같은 유동-관통 모드의 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 이뮤노글로불린 쇄 폴리펩티드(들)를 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 단리하는 단계.
예를 들어, 항체 또는 단편은 용해, 예를 들어, 분쇄/마멸 (예를 들어, 유리 비드로), 프렌치 프레스 세포 용해, 효소적 소화 또는 초음파처리와 같은 방법에 의해 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 용해된 세포로부터의 가용성 및 불용성 물질을 포함한 용해된 세포는 세포 용해물을 형성한다. 본 발명은 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 방법 또는 세포 용해 및 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 원심분리를 포함한 방법에 의해 정제된다. 세포 용해물 또는 다른 현탁액의 원심분리는 항체 또는 단편을 함유하는 수성 분획으로부터 세포 파편과 같은 대부분의 미립자 물질을 제거한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 원심분리는 15-30분 동안 약 40,000 내지 50,000 X g에서 (예를 들어, 용해물의 용해물 고체 분획을 폐기하는 것을 포함하여 세포 용해물 상에서) 수행된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포는 원심분리에 의해 액체 세포 배양 배지로부터 제거된다. 예를 들어, 약 8,000 X g 내지 약 15,000 X g (예를 들어, 약 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000 또는 15000)의 범위 내의 중력을 사용한 원심분리는, 예를 들어, 약 0.9 X 10-8 내지 2.8x 109 범위의 Q/시그마 비를 특징으로 한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 액체 원심분리물은 (예를 들어, 0.1 내지 약 0.2 μm의 세공 크기로) 심층 여과된다. 본 발명은 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 방법 또는 원심분리 및 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄는 분비 신호 서열에 융합된 숙주 세포에서 발현되고 숙주 세포로부터 숙주 세포의 배양 배지 내로 분비된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 (예를 들어, AEX 크로마토그래픽 정제 전에 또는 후에) 여과에 의해 정제된다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 수성 조성물은 고체 미립자 물질을 제거하기 위해, 예를 들어, 약 1 μm, 0.45 μm 또는 0.22 μm의 세공 크기를 갖는 필터를 통해 여과된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 필터는 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)로 제조된다. 본 발명은 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 여과를 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 분별 침전에 의해 정제된다. 증가된 염 농도는 단백질 사이의 소수성 상호작용을 증진시키고 선택적 침전을 초래한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 단편을 포함하는 수성 조성물은 암모늄 술페이트, 덱스트란 술페이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 예를 들어, PEG4000), 아세톤, 폴리에틸렌이민, 프로타민 술페이트, 스트렙토마이신 술페이트, 또는 카프릴산의 존재 하에 침전된다. 본 발명은 황산화된 티로신 변이체가 결여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 방법 또는 유동-관통 모드의 AEX 크로마토그래피 및 분별 침전을 포함한 방법에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하여 황산화된 티로신 변이체를 제거하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 쇄가 발현되는 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 마우스 골수종 세포, PER 세포, 하이브리도마 세포 또는 진균 또는 효모 세포, 예를 들어, 피키아(Pichia) 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포는 글루타민 신타제가 결여된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 하나 이상의 발현 제어 서열 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 이뮤노글로불린은 발현 벡터 내에 있다. 높은 수준의 항체 또는 항원-결합 단편 발현을 달성하기 위해, 강한 프로모터/인핸서 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및/또는 신장 인자 알파 (EF1α) 프로모터가 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 발현을 구동하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 5' 비번역된 영역 내 인트론 서열은 핵으로부터의 세포질에의 전사된 mRNA의 유출을 증가시키도록 프로모터/인핸서 다음에 포함되고, 하나 이상의 3' 폴리아데닐화 신호 서열은 mRNA 수준을 극대화하도록 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 후기 또는 초기 폴리아데닐화 신호 서열 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 컨센서스 코작 서열은 번역 개시를 증진시키도록 제1 번역 개시 코돈의 바로 앞에 GCC GCC(A/G)CC (서열식별번호: 69)를 배치함으로써 생성된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 신호 펩티드 서열은 항체 또는 단편 분비를 지시하기 위해 이뮤노글로불린 쇄의 바로 앞에 배치된다.
세포 배양의 조건은 필요에 따라 모니터링 및 조정될 수 있다. 예를 들어, pH, 세포 카운트, 세포 생존율 및 온도와 같은 조건은 모니터링 및 조정될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포 배양물의 온도는, 예를 들어, 접종후 48시간에 37℃에서 30-35℃로 조정된다. 용존 산소는, 본 발명의 한 실시양태에서, 모니터링되고/거나 20-50%와 같은 설정점으로 조정된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 용존 CO2는 모니터링되고/거나, 예를 들어, 약 120-150 mm Hg 이하로 조정된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 오스몰랄농도는 모니터링되고/거나, 예를 들어, 약 270-330 mOsm/kg으로 조정된다.
항체
본 발명은 검출가능한 수준의 황산화된 티로신이 결여된 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 포함하는 조성물을 단리하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 단편은 황산화된 티로신을 포함하고 하기로부터 선택된 항원에 결합한다: PD1, CD27, LAG3, CTLA4, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2, CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17 또는 TSLP.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편이 결합하는 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "LAG3"은 인간 및 시노몰구스 원숭이, 예를 들어 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis) 또는 마카카 물라타(Macaca mulatta) LAG3 뿐만 아니라 그의 단편 예컨대 신호 펩티드가 결여된 그의 성숙 단편을 지칭한다.
티로신 황산화가 결여된 항-LAG3 항체 (예를 들어, WO2016028672에 개시된 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9)의 이뮤노글로불린 쇄의 예는 하기 요약된 것들을 포함한다. 예를 들어, 여기서 항체 또는 단편은 하기 제시된 CDR 및/또는 이뮤노글로불린 쇄 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 오염 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 KASQSLD Y EGDSDMN (서열식별번호: 38)을 갖는 CDR-L1을 포함하며, 여기서 Y (볼드체 및 밑줄표시됨)는 황산화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 단편은 4A10 중쇄 이뮤노글로불린 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린; VH 및/또는 VL 쇄 또는 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR (예를 들어, 4A10 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9 중 임의의 것에 대해, 임의의 N-말단 중쇄 글루타민은 피로글루타메이트로 전환되고/거나 임의의 C-말단 중쇄 리신은 제거된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 단편은 19E8 중쇄 이뮤노글로불린 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린; VH 및/또는 VL 쇄 또는 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR (예를 들어, 19E8 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)을 포함한다:
본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 단편은 11C9 중쇄 이뮤노글로불린 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린; VH 및/또는 VL 쇄 또는 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR (예를 들어, 11C9 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)을 포함한다:
본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 단편은 22D2 중쇄 이뮤노글로불린 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린; VH 및/또는 VL 쇄 또는 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR (예를 들어, 22D2 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)을 포함한다:
본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 또는 항원-결합 단편은 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9 중쇄 이뮤노글로불린 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린; VH 및/또는 VL 쇄 또는 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 또는 Ab9 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)을 포함한다:
ㆍ Ab1: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 53AHH 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6) IgG1 / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab2: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 56AHH 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55S) IgG1 / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab3: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 54AHH 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55D) IgG1 / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab4: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 52AHH 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55Q) IgG1 / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab5: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 57AHH 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6) IgG4 S228P (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab6: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 73AHD 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55D / VL3) IgG4 S228P / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab7: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 21AHG 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55S / VL3) IgG4 S228P / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
ㆍ Ab8: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 80AHG 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55Q / VL3) IgG4 S228P / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
또는
ㆍ Ab9: 인간화 경쇄 45AGX 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3)) 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인) 및 인간화 중쇄 72AHD 인간화 x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55G / VL3) IgG4 S228P / 카파 (PX) (또는 그의 가변 도메인); 이는, 예를 들어 하기를 포함함:
; 또는 하기 CDR을 포함함:
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 임의의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR-H2는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
DINPNX1GGTIYX2QKFX3X4 (서열식별번호: 64)
여기서,
X1= D, N, S 또는 Q,
X2= A 또는 S
X3= Q 또는 K
X4= E 또는 G
본 발명은 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산된 이뮤노글로불린에 전형적으로 부가된 N-연결된 글리칸 (CHO N-연결된 글리칸) 또는 조작된 효모 세포, 예컨대, 예를 들어, 피키아 파스토리스에 전형적으로 부가된 N-연결된 글리칸 (조작된 효모 N-연결된 글리칸)을 포함하는 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 4A10, 19E8, 11C9 및/또는 22D2; 예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 및/또는 Ab9)을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 도 11에 제시된 "조작된 효모 N-연결된 글리칸" 또는 "CHO N-연결된 글리칸" (예를 들어, G0 및/또는 G0-F 및/또는 G1 및/또는 G1-F 및/또는 G2-F 및/또는 Man5) 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 조작된 효모 N-연결된 글리칸, 즉, G0 및/또는 G1 및/또는 G2를 포함하며, 임의적으로, Man5를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 CHO N-연결된 글리칸, 즉, G0-F, G1-F 및 G2-F를 포함하며, 임의적으로, G0 및/또는 G1 및/또는 G2 및/또는 Man5를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편 이뮤노글로불린 쇄 상의 모든 N-연결된 글리칸의 약 80% 내지 약 95% (예를 들어, 약 80-90%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%)는 조작된 효모 N-연결된 글리칸 또는 CHO N-연결된 글리칸이다. 문헌 [Nett et al. Yeast. 28(3): 237-252 (2011); Hamilton et al. Science. 313(5792): 1441-1443 (2006); Hamilton et al. Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-392 (2007)] 참조. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 조작된 효모 세포는 GFI5.0 또는 YGLY8316 또는 미국 특허 번호 7,795,002 또는 문헌 [Zha et al. Methods Mol Biol. 988:31-43 (2013)]에 제시된 균주이다. 또한 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/066765 참조.
항-LAG3 항체 (예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8 및/또는 Ab9)의 티로신 황산화 변이체는 약 148670 Da, 148832 Da 및/또는 148994 Da의 분자량을 포함한다. 티로신 황산화가 결여된 변이체는 약 148590 Da, 148752 Da 및/또는 148914 Da의 분자량을 포함한다.
"단리된" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 그들이 생산된 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질 예컨대 세포 파편 및 성장 배지를 포함한다. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로 숙주 세포 또는 그의 성장 배지의 것으로부터의 생물학적 분자와 같은 발현 시스템 구성성분이 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전 부재 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재, 또는 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제의 구성성분을 지칭하는 것으로 의도되지는 않는다.
항체의 항원-결합 단편은 전장 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 일부분이다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어 sc-Fv; 나노바디 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 1개의 "경"쇄 및 1개의 "중"쇄를 갖는다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참조.
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체이며, 즉, 집단을 구성하는 항체 분자는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열에서 동일하다. 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495; 미국 특허 번호 4,816,567; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; 및 Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731] 참조.
키메라 항체는 제1 항체로부터의 가변 도메인 및 제2 항체로부터의 불변 도메인을 갖는 항체이며, 여기서 제1 및 제2 항체는 상이한 종으로부터의 것이다. (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 전형적으로, 가변 도메인은 실험 동물, 예컨대 설치류로부터의 항체 ("모체 항체")로부터 수득되고, 불변 도메인 서열은 인간 항체로부터 수득되며, 이로써 생성되는 키메라 항체는 모체 (예를 들어, 마우스) 항체보다 인간 대상체에서 불리한 면역 반응을 도출할 가능성이 더 적을 것이다.
인간화 항체는 인간 및 비-인간 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 항체 둘 다로부터의 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 이뮤노글로불린의 것들에 상응하고, 프레임워크 (FR) 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 임의적으로 인간 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 할당될 수 있다. 적어도 5개의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 몇개는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가로 나눠질 수 있다. 본 발명은 이들 부류 또는 하위부류의 항체 중 임의의 것의 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, 항-LAG3)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항-LAG3)은 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 불변 영역, 예컨대 γ1, γ2, γ3, 또는 γ4 인간 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항-LAG3)은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대 람다 또는 카파 인간 경쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 예로서, 및 비제한적으로, 인간 중쇄 불변 영역은 γ4일 수 있고, 인간 경쇄 불변 영역은 카파일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 Ser228Pro 돌연변이를 갖는 γ4이다 (Schuurman, J et al., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).
실시예
이들 실시예는 본 발명을 예시하며 이에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1 : 항체 티로신 황산화 변이체의 확인 및 정제 방법. 본 실시예에서, Ab6의 티로신 황산화 항체 변이체의 존재를 확인하였고, 변이체를 제거하기 위한 정제 방법을 개발하였다.
물질 및 방법
알칼리성 포스파타제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) (매사추세츠주 입스위치)로부터 입수가능하였다. 항-티로신 황산화 항체는 밀리포어(Millipore) (매사추세츠주 빌러리카)로부터 입수가능하였다. 합성 펩티드는 아나스펙(AnaSpec) (캘리포니아주 프리몬트)으로부터 구입하였다.
음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피
AEX 크로마토그래피를 지이 악타 아반트(GE Akta Avant) 시스템을 사용함으로써 유동 관통 모드의 포로스 고퓨어(POROS GoPure) D 프리-패킹된 칼럼, 0.5 x 5 cm, 1 mL를 사용하여 수행하였다. 단백질-A 크로마토그래피 정제된 mAb는 pH를 1M 트리스로 pH 6.5로 조정하였고, 칼럼 상에 로딩하였다. 단백질 로딩 전에, 칼럼을 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5로 평형화시켰고, 로딩 후 칼럼을 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5로 세척하고 1M NaCl로 스트리핑하였다. 280 nm에서의 흡광도를 실행 기간 동안 모니터링하였다. 분획, 풀 및 스트립, 및 AEX 로드를 수집하고 분석하였다.
이온 교환 HPLC
이온 교환 HPLC는 애질런트(Agilent) 1600 시리즈 시스템을 사용함으로써 주위 온도에서 MabPac SCX-10 칼럼 (4 x 250 mm, 3.14 ml) 상에서 수행하였다. 이동상 B는 30 mM 나트륨 포스페이트 pH 8.0이었고, 이동상 A는 25 mM MES, pH 5.8이었다. 칼럼을 먼저 10분 동안 1.0 mL/분의 유량으로 14% 이동상 B로 평형화시켰다. 이어서 mAb 단백질을 이동상 B의 구배 (18분에서 14% 내지 80%)를 사용하여 칼럼으로부터 용리하였다. 이어서 칼럼을 3분 동안 100% 이동상 B로 세정하고, 다음 샘플 분석을 위해 14% 이동상 B로 재평형화시켰다. 용리액의 280 nm에서의 흡광도를 LC 실행 전반에 걸쳐 모니터링하였다.
무손상 및 환원된 LC/MS
20 μg의 샘플을 50 mM 트리스 완충제 pH 8.0으로 0.5 mg/mL로 희석하였다. RP-HPLC 분리를 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC H-클래스를 사용하여 수행하였다. 사용된 칼럼은 액퀴티 UPLC BEH300 C4, 1.7 μm, 1.0 x 100 mm (워터스(Waters), 매사추세츠주 밀포드; -O-(Si)(CH3)2-C4H9 리간드)였다. 이동상은 이동상 A로서 물 중 0.1% 포름산 (FA) 및 이동상 B로서 아세토니트릴 (ACN) 중 0.1% FA였다. LC 유량은 0.08 mL/분이었고 칼럼 온도는 80℃에서 유지하였다. 항체를 30% - 90% B의 4 - 15분의 구배를 사용하여 용리하였다. MS 스펙트럼을 m/z 800 - 4000의 범위에서 스캐닝되었던 워터스 제보(Waters Xevo) G2 Q-TOF 시스템 상에서 획득하였다.
20 μg의 샘플을 환원제 (50 mM 트리스 pH 8.0, 6 M 구아니딘 HCl 함유)에 의해 100 μL의 최종 부피로 희석하였다. 2 마이크로리터의 1M 디티오트레이톨 (DTT) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스) 용액을 각각의 샘플에 부가하고 이어서 20분 동안 56℃에서 인큐베이션하였다. RP-UPLC 분리를 워터스 액퀴티 UPLC H-클래스 상에서 수행하였다. 사용된 칼럼은 액퀴티 UPLC, BEH300 C4, 2.1 x 100mm, 1.7um (워터스)였다. MS 스펙트럼을 m/z 600 - 3000의 범위에서 스캐닝되었던 워터스 제보 G2 Q-TOF 시스템 상에서 획득하였다. MS 데이터를 매스링스(MassLynx) 4.1의 MaxEnt1에 의해 분석하였다.
펩티드 맵핑 LC/MS
100 μg의 샘플을 50 mM 트리스 pH 8.0, 6 M 구아니딘 HCl 및 5 mM EDTA를 함유하는 100 uL 변성 완충제로 완충제 교환하였다. 환원 반응을 용액 중 20 mM DTT로 30분 동안 56℃에서 수행하였다. 샘플을 암실에서 30분 동안 실온에서 50 mM 아이오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 알킬화 반응을 1μL의 500 mM DTT 용액을 부가함으로써 종료시켰다. 1:20 (w:w)의 효소:기질 비로 Lys-C 효소 (와코(Wako), 버지니아주 리치먼드)를 부가하기 전에, 환원된 및 알킬화된 샘플을 소화 완충제 (50 mM 트리스 pH 8.0)로 300 μL의 최종 부피로 희석하였다. 용액을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 펩티드를 할로 펩티드(HALO Peptide) ES-C18, 2.1 x 150 nm, 2.7 μm 칼럼 (맥-모드 애널리티컬, 인크.(MAC-MOD Analytical, Inc.), 펜실베니아주 채즈 포드)을 사용하여 워터스 액퀴티 UPLC H-클래스 상에서 RP-HPLC에 의해 분리하였다. MS 스펙트럼을 m/z 100 - 2000의 범위에서 스캐닝된 워터스 제보 G2 Q-TOF 시스템 상에서 획득하였다. MS 데이터를 바이오파마링스(BiopharmaLynx) 1.3 (워터스)에 의해 분석하였다.
표적 MS/MS
표적 펩티드의 LC/MS/MS를 LTQ-오비트랩 MS 시스템 (써모 피셔(Thermo Fisher), 매사추세츠주 월섬) 상에서 수행하였다. MS/MS 획득을 위해 FT 모드의 17500의 해상도를 적용하였다. 펩티드를 할로 펩티드 ES-C18 칼럼, 2.1X150 mm, 2.7 μm를 사용하여 워터스 액퀴티 UPLC H-클래스에 의해 분리하였다. MS/MS를 전구체 이온의 m/z 값에 따라 m/z 범위에서 스캐닝하였다. 정규화된 단편화 에너지를 CID 단편화에 대해 35% 및 ETD 단편화에 대해 35%로 세팅하였다. MS2 데이터를 수동으로 해석하였다.
알칼리성 포스파타제 처리
AEX 스트립 분획 내 10 ug의 mAb 단백질을 50uL 포스파타제 반응 완충제 중에서 희석하였다. 송아지 장으로부터의 1uL (10 단위) 알칼리성 포스파타제 (뉴잉글랜드 바이오랩스, 매사추세츠주 입스위시)를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 동안 부가하였다. 닭 오브알부민 (시그마(Sigma))을 양성 대조군으로서 나란히 처리하였다. 10uL 용액을 질량 분석을 위한 LC/MS에 주입하였다.
웨스턴 블롯팅
매직 마크 XP 웨스턴 스탠다드 (인비트로젠(Invitrogen)) 및 특정한 농도의 모노클로날 항체 (mAb) 및 대조군 세포 추출물 (HEK293 전세포 추출물 및 EGF 자극된 A431 세포 용해물 (밀리포어(Millilpore)) 둘 다를 95℃에서 가열하면서 β-메르캅토에탄올로 환원시키고 이어서 4-20% 구배 겔 (노벡스(Novex))을 사용하여 트리스-글리신 기반 SDS PAGE에 의해 용해시켰다. 용해된 단백질을 후속적으로 니트로셀룰로스 막 상에 전기-전달하고, 4℃에서 요동시키면서 트리스-완충된 염수 플러스 .05% 트윈20 (TBST) (시그마) 중에서 밤새 세척하였다. 이어서 막을 계속 요동시키면서 실온에서 트리스-완충된 염수 플러스 1% BSA (TBS-BSA) (시그마) 중에서 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체 (항-술포티로신/항-티로신 황산화 (밀리포어) 또는 항-인간 IgG (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리 인크.(Jackson ImmunoResearch Labratories Inc.)))를 TBS-BSA로 희석하고, 실온에서 2시간 동안 막과 함께 인큐베이션하였다. TBST로의 세척 후에, HRP-접합된 2차 항체 (염소-항-마우스 또는 염소-항-토끼 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)))를 5% 탈지유 단백질 플러스 .05% 트윈20-포스포완충된 염수 (인비트로젠)로 희석하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. TBST로의 최종 세척 후에, 발색을 위해 화학발광 기질 (써모 사이언티픽)을 사용하였으며; 신호는 포토그래픽 필름 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences))에 대한 노출 및 후속 프로세싱에 의해 회수하였다. 1차 항체 사이에서의 니트로셀룰로스 막 스트리핑을 이전에 나타낸 바와 같이 수행하였다 (Kaufmann SH, E.C., Shaper JH., The erasable Western blot. Anal Biochem., 1987. 161(1): p. 89-95).
결과 및 논의
mAb 분자의 분리
음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)는 전형적으로 모노클로날 항체 정제 동안 폴리싱 단계로서 활용된다. 이러한 단계는 전형적으로 유동-관통 모드로 작동되며, 여기서 mAb는 칼럼을 유동 관통하고 인-프로세스 불순물 (HCP, DNA)은 칼럼에 결합한다. AEX 전개 동안, 단백질 회수에 영향을 미치는, 수지에 결합된 칼럼 상에 로딩된 mAb의 분획이 있다는 것을 주지하였다. 단백질의 결합된 분획은 AEX 크로마토그래피의 스트립 분획에서 용리되었다. AEX 칼럼에 결합된 mAb를 특징화하기 위해, AEX 크로마토그래피의 분획을 분석하였다: "로드"는 AEX 정제 전의 샘플을 지칭하며; "풀"은 샘플의 유동-관통 부분을 지칭하고, "스트립"은 샘플의 결합된 분획을 지칭한다. AEX 크로마토그래피로부터의 로드, 풀 및 스트립 분획을 처음에 IEX-HPLC 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 도 1은 AEX 로드, 풀 및 스트립 분획에서의 mAb의 IEX-HPLC 프로파일을 제시한다. 도 1에 제시된 바와 같이, 스트립 분획은 로드 및 풀과 비교 시 유의하게 높은 양의 산성 변이체를 가졌다: 풀 분획 (점선 트레이스)에서 23% 및 피드 분획 (굵은 트레이스)에서 33%와 비교 시 스트립 분획 (얇은 트레이스)에서 ~65% 산 변이체. 추가적인 차이는 산성 프리-주요 피크에서 주지되었다. 이러한 피크는 더 높은 수준으로 AEX 피드에 존재하였으며, 여기서 AEX 풀에서, 이러한 피크는 최소였다. 스트립 분획은 산성 프리-주요 피크로 강화하였다. AEX 크로마토그래피를 또한 상기 기재된 바와 동일한 완충제 및 염 조건으로 pH 7.0 또는 7.5에서 수행하였다. pH 7.0에서, 산성 프리-주요 피크의 유사한 환원이 또한 AEX 풀에서 관찰되었다.
질량 분광측정법에 의한 무손상 및 환원된 단백질의 분석
불순물을 특징화하기 위해, 모든 3개의 분획 (AEX 로드, 풀 및 스트립)을 Q-TOF MS를 사용하여 무손상 및 환원된 LC/MS에 의해 분석하였다. 도 2는 무손상 분자의 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 제시한다. 3개의 주요 당형태가 각각 148591 Da, 148751 Da 및 148912 Da의 질량을 갖는 모든 3개의 분획: G0F/G0F, G0F/G1F 및 G1F/G1F에서 관찰되었다. G0F/G0F를 갖는 이러한 분자의 계산된 무손상 질량은 148590 Da이다. 무손상 질량 측정에 대한 질량 오차는 모두 25 ppm 이내에 있다. 추가적인 종은 단지 AEX 스트립 분획에서만 검출되었다. 이들 종은 3개의 주요 당형태 (G0F/G0F, G1F/G0F, G1F/G1F)의 80 Da 질량 증가 (148668, 148830, 148991 Da)에 상응한다. 변형을 위치결정하기 위해, 환원제 DTT에 의한 디술피드 결합 절단 후에 경쇄 및 중쇄 질량을 측정하였다. 스트립 분획 및 풀 분획의 중쇄 질량에 대해 어떠한 차이도 검출되지 않았으며, 이는 변형이 중쇄 상에 위치하지 않는다는 것을 시사한다 (데이터는 제시되지 않음). 도 3에 제시된 바와 같이, 경쇄 아포 형태 질량 (23674 Da) 및 당화 경쇄 질량 (23836 Da)은 양쪽 분획 (스트립 및 풀 분획)에서 검출되었다. 경쇄의 80 Da 증가를 갖는 피크는 단지 AEX 스트립 분획에서 23754 Da에서 관찰되었다. 환원된 질량 측정의 질량 오차는 20 ppm 이내에 있다. 이들 데이터는 80 Da 변형이 Ab6의 경쇄 상에 위치한다는 것을 시사한다.
펩티드 맵핑에 의한 mAb 항체의 분석
변형 부위를 추가로 위치결정하기 위해, AEX 스트립 및 풀 분획을 환원시키고, 알킬화시키고, 이어서 LysC 효소에 의해 소화시켰다. 펩티드 혼합물을 Q-TOF MS에 의해 질량 맵핑하였다. 이들 2개 분획의 UV 트레이스를 비교하는 경우에, 2개의 차이가 주지되었다. 도 4 (a) 및 (b)에 제시된 바와 같이, 2개의 새로운 피크가 AEX 스트립 분획에서 체류 시간 37.6분 및 65.2분에서 검출되었다. 새로운 피크에서 관찰된 m/z는 37.6분에서 1165.4796 (2+) 및 65.2분에서 1476.7372 (4+) Da이다. 관찰된 질량은 각각 6.4 ppm 및 9.8 ppm의 질량 오차로 경쇄 펩티드 AA25-43+80Da 및 AA25-78 +80 Da에 상응한다. 경쇄 펩티드 AA25-78은 하나의 미스-절단 부위를 함유한다. 경쇄 펩티드 AA25-43 및 AA25-78의 변형된 및 비변형된 형태를 도 4에 표지하였다. 이러한 변형된 펩티드의 수준은 추출된 이온 크로마토그램 (SIC)의 피크 면적을 기반으로 하여 그의 아포 형태와 비교 시 AA25-43 및 AA25-78에 대해 20.9% 및 21.6%인 것으로 추정되었다.
변형된 펩티드의 MS/MS 단편화
질량에서의 80 Da 증가를 갖는 변형의 2개의 가능성이 있다: 인산화 (+79.9663 Da) 및 황산화 (+79.9568 Da). 이들 2개 변형의 이론적 질량 차이는 단지 0.0095 Da이며, 이는 질량 단독에 의해 구별되는 것을 어렵게 만든다. 처음에, 표적 펩티드 AA25-78을 충돌 유도 해리 (CID)에 의해 단편화하였고, 생성된 단편을 LTQ-오비트랩 MS에 의해 분석하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 전구체 이온으로부터의 변형 기 (80Da)의 완전 손실이 관찰되었다. 단지 펩티드 백본으로부터의 단편이 검출되었으며, 이는 LC25-43의 펩티드 서열을 확증한다. 한편 CID 단편화로부터 어떠한 부위 특이적 정보도 수득되지 않았다. 황산화된 티로신 (sY)이 매우 불안정성이고 표준 CID 조건 하에 용이하게 손실될 수 있는 것으로 보고된 바 있다 (Nemeth-Cawley JF1, K.S., Rouse JC., Analysis of sulfated peptides using positive electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom., 2001. 36(12): p. 1301-11). 원래 전구체 이온 중 어떤 것도 펩티드 백본 단편화 시에 존재하지 않았으므로 양이온 CID MS/MS를 사용하여 술페이트 모이어티의 위치에 대한 부위-특이적 정보를 수득하는 것은 가능하지 않았다. 대조적으로, 인산화된 펩티드는 CID 하에 지속하는 경향이 있고, 펩티드 백본 단편화는 변형의 부위-특이적 확인을 허용한다 (Nemeth-Cawley JF1, K.S., Rouse JC., Analysis of sulfated peptides using positive electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom., 2001. 36(12): p. 1301-11). 도 5에서, 전구체 이온으로부터의 80 Da의 중성 손실이 관찰되었다. 인산화에 대한 특징적인 중성 손실 이온은 -H3PO4 (-98 Da)이고 특징적인 단편 이온은 PO3 - (-79 Da)인 것으로 알려져 있다. 한편 황산화의 경우에, 특징적인 중성 손실 이온 및 단편 이온은 둘 다 80 Da를 갖는 -SO3 이온이다 (Monigatti F, H.B., Steen H., Protein sulfation analysis--A primer. Biochim Biophys Acta., 2006. 1764(12): p. 1904-13). CID MS2 데이터는 80 Da 변형이 황산화라는 것을 시사한다.
또 다른 광범위하게 사용된 단편화 메카니즘은 전자 전달 해리 (ETD)이다. 이는 전자를 다중 양성자화된 펩티드/단백질에 전달하며, 이는 N-Cα 백본 결합의 절단을 유도하고 PTM 국재화의 정보의 손실 없이 c- 및 z-유형 단편 이온을 생성할 수 있다 (Mikesh LM, U.B., Chi A, Coon JJ, Syka JE, Shabanowitz J, Hunt DF., The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis. Biochim Biophys Acta., 2006. 1764(12): p. 1811-22). ETD는 CID와의 상보적 정보를 제공할 수 있으며: ETD 프로세스는 SO3 기를 보유하는 것 및 이에 따라 아미노산 국재화를 허용하는 한편, CID는 바람직하게는 단편 불안정성 변형을 허용한다. 본 발명의 경우에, 표적 펩티드를 ETD 단편화 및 고해상도 질량 검출과 LTQ-오비트랩에 의해 분석하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 80 Da 변형의 부분적 손실이 전구체 이온 상에서 관찰되었다. 부착된 SO3 기 (80 Da)를 갖는 단편 이온은 표지화된다. SO3 부착된 단편 이온 (c9, c11, c12-16)의 검출을 기반으로 하여, 변형 부위는 mAb 분자의 CDR1 영역 내에 있는 경쇄 상에서의 티로신 31인 것으로 확인된다.
알칼리성 포스파타제 처리
티로신의 인산화 및 황산화는 동중원소성이므로, 이들 2개 변형을 구별하기 위해 알칼리성 포스파타제를 여기서 사용하였다 (Yu Y, H.A., Moore KL, Leary JA., Determination of the sites of tyrosine O-sulfation in peptides and proteins. Nat Methods, 2007. 4(7): p. 583-8). 알칼리성 포스파타제는 단백질로부터 인산화 기를 제거하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 닭 알부민은 이러한 단백질이 그의 인산화 및 글리코실화 형태로 광범위하게 알려져 있으므로 양성 대조군으로서 사용하였다. 닭 알부민 및 AEX 스트립 분획 내 mAb를 포스파타제로 처리하고 나란히 37℃에서 인큐베이션하였다. 도 7은 포스파타제 처리 전에 및 후에 mAb 및 닭 오브알부민의 측정된 무손상 질량을 제시한다. 도 7(a)에 제시된 바와 같이, mAb에 대해 어떠한 질량 변화도 관찰되지 않았다. 한편 닭 알부민의 경우에 (도 7 (b)), 160 Da의 명백한 질량 이동이 모든 주요 당형태에 대해 관찰되었다. 닭 알부민은 2개의 인산화 부위를 함유하므로, 160 Da의 손실은 알칼리성 포스포타제의 활성을 확증한다. 포스파타제 처리 전에 및 후에 어떠한 질량 변화도 관찰되지 않았으므로, 이는 AEX 스트립 내 이러한 mAb가 인산화되지 않았다는 것을 시사한다.
웨스턴 블롯
이제까지, LC/MS 분석은 경쇄 CDR 상에서의 티로신 31에 대한 천연 80 Da 부가물을 조사하는데 사용되어 왔다. 포스파타제-처리 후에 mAb AEX 스트립 분획의 MS2 분석 및 질량 분석은 80 Da 부가물이 티로신 31에 대한 황산화라는 것을 시사한다. 그러나, 티로신-황산화 및 인산화 사이를 직접적으로 구별하는 이들 질량 분석-기반 기술의 능력은 이들 2개 기의 유사한 분자 질량으로 인해 문제가 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 항-술포티로신-특이적 모노클로날 항체로의 웨스턴 블롯팅을 적용하여 mAb AEX 스트립 분획 내 티로신 황산화의 존재를 확증하였다 (Xu J, D.X., Tang M, Li L, Xiao L, Yang L, Zhong J, Bode AM, Dong Z, Tao Y, Cao Y., Tyrosylprotein sulfotransferase-1 and tyrosine sulfation of chemokine receptor 4 are induced by Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1 and associated with the metastatic potential of human nasopharyngeal carcinoma. PLoS One., 2013. 8(3): p. e56114). 도 8a에서 (상부 패널), mAb AEX 풀 및 스트립 분획의 정규화된 농도를 환원된 SDS PAGE에 적용하고, 웨스턴 혼성화에 의해 인간 중쇄 및 경쇄에 대해 프로빙하였다. 이어서 풀 및 스트립으로부터의 중쇄 및 경쇄의 증가된 농도를 제1 검출 항체로 "스트리핑하고", 항-술포티로신-특이적 모노클로날 항체로 재프로빙하였다 (하부 패널). 도 8a에 제시된 바와 같이 (하부 패널), 양성 신호는 단지 스트립 분획의 경쇄 상에서 검출되었으며, 이는 이것이 티로신 황산화를 함유한다는 것을 시사한다. 인산화와의 교차 반응성에 대한 대조군으로서, 레인 1을 인산화된 단백질로 강화된 EGF-처리된 A431 세포 추출물의 상업적 공급원으로 로딩하였다. 하부 패널의 레인 1에서의 양성 신호의 결여는 항-술포티로신 모노클로날 항체가 인산화와의 강한 교차 반응성을 갖지 않는다는 것을 제시한다 (도 8a, 하부 패널). 추가로, 항-술포티로신 모노클로날 항체에 대해 양성 대조군으로서 제조업체에 의해 시사되었던 HEK 293 추출물을 레인 2에 로딩하였다. 저부-20 KDa 미만의 양성 신호는 제조업체의 분석에 부합한다 (도 8a, 하부 패널). 도 8b에서, AEX 스트립 및 풀 이외의 상이한 CHO-유래된 mAb (mAb1, 2 및 3)의 정규화된 농도를 환원된 SDS PAGE에 적용하고, 웨스턴 혼성화에 의해 인간 중쇄 및 경쇄에 대해 프로빙하고 (상부 패널), 이어서 스트리핑하고 항술포티로신에 대해 재프로빙한다 (하부 패널). 도 8a와 일치하게, 항-술포티로신 항체로 프로빙된 경우에 단지 AEX mAb 스트립만이 경쇄 위치에서 양성 신호를 제시한다. 유사한 양의 단백질이 분석된 경우에 다른 3개의 CHO-유래된 머크(Merck) mAb에 대해 어떠한 양성 신호도 티로신 황산화에 대해 관찰되지 않았다. 이는 AEX 산성 피크 또는 티로신 황산화 핫스팟의 어떠한 증가된 수준도 이들 3개 mAb에 대해 검출되지 않았다는 본 발명의 관찰에 부합한다 (데이터는 제시되지 않음).
황산화 또는 인산화를 수반하는 합성 펩티드로의 체류 시간의 비교
인산화 및 황산화를 추가로 구별하기 위해, Y31에 대한 인산화 또는 황산화로 변형된 LC AA25-43 (XSXSXDYEGDSDXXXXXXX) (서열식별번호: 65)의 동일한 서열을 갖는 합성 펩티드를 LC/MS에 의해 분석하였다. 도 9는 합성 펩티드 XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)+인산화, XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)+황산화 및 AEX 스트립 내 AA25-43+80Da의 SIC를 제시한다. 황산화를 수반하는 합성 펩티드는 AEX 스트립과 함께 동일한 체류 시간에서 용리하는 한편, 인산화를 수반하는 합성 펩티드는 AEX 스트립보다 먼저 용리한다. 이는 경쇄 상에서의 Y31이 황산화된다는 본 발명의 관찰을 추가로 확증한다.
티로신 황산화 부위의 구조
단백질 티로신 황산화 반응은 티로실프로테인 술포트랜스퍼라제라 불리는 골지 효소에 의해 촉매된다. 이전 연구는 TPST가 통상적으로 -5 내지 +5 위치 이내의 여러 산성 잔기에 의해 둘러싸여 있는 접근가능한 티로신 잔기를 인식한다는 것을 나타낸다 (Hortin G, F.R., Gordon JI, Strauss AW., Characterization of sites of tyrosine sulfation in proteins and criteria for predicting their occurrence. Biochem Biophys Res Commun., 1986. 141(1): p. 326-33; Rosenquist GL, N.H.J., Analysis of sequence requirements for protein tyrosine sulfation. Protein Sci., 1993. 2(2): p. 215-22; Teramoto T1, F.Y., Kawaguchi Y, Kurogi K, Soejima M, Adachi R, Nakanishi Y, Mishiro-Sato E, Liu MC, Sakakibara Y, Suiko M, Kimura M, Kakuta Y, Crystal structure of human tyrosylprotein sulfotransferase-2 reveals the mechanism of protein tyrosine sulfation reaction. Nat Commun., 2013. 4: p. 1572). 수용자 티로신은 TPST2 기질 결합 부위 내 양으로 하전된 잔기의 인식을 가능하게 하기 위해 인근 산성 잔기를 가질 필요가 있다. 수용자 티로신은 또한 TPST2의 깊은 틈새에 피팅하기 위해 본질적 가요성 영역 내에 있을 필요가 있다. 그러나, 티로신 황산화 부위에 대한 어떠한 일반적인 컨센서스 서열도 정의된 바 없다. 황산화된 티로신을 둘러싸는 서열을 기재하는 가장 공통의 특색은 티로신의 2개의 잔기 이내의 1개의 산성 아미노산의 존재; 5개의 잔기 이내의 적어도 3개의 산성 아미노산의 존재 및 인근의 턴-유도 아미노산의 존재 등을 포함한다 (Monigatti F, H.B., Steen H., Protein sulfation analysis--A primer. Biochim Biophys Acta., 2006. 1764(12): p. 1904-13). 도 10은 mAb 티로신 부위의 구조를 리본 다이아그램으로의 CDR 루프의 맥락에서 제시하며, 이는 MOE 소프트웨어 (케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group), 캐나다 몬트리올)에 의해 생성되었다. 이러한 mAb 상에서의 경쇄 Y31에 가까운 서열은 XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (서열식별번호: 65)이다. 이러한 서열에서, Y31의 인접한 잔기는 둘 다 산성이다: 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E). 총 4개의 산성 잔기는 Y31의 5개의 잔기 이내에 있다: 3개의 D 및 1개의 E. 4개의 턴 유도 잔기는 Y31에 가깝다: 3개의 세린(S) 및 1개의 글리신(G). 이웃 산성 아미노산 및 국부 2차 구조의 요소를 갖는 Y31의 독특한 구조는 이러한 변형이 발생하도록 만드는 필수적인 역할을 한다.
본 발명자들은 CHO 생산된 항체에서의 예상외의 O-연결된 티로신 황산화의 존재를 암시하는 증거를 여기에 기재한다. 이러한 불안정성 변형의 위치는, ETD 단편화로 질량 분광측정법에 의해 확인된 바와 같이, 경쇄의 CDR1 영역에서 발견되었다. 이러한 티로신 황산화는 포스파타제 처리, 항-티로신 황산화 항체를 사용한 웨스턴 블롯 실험 및 합성 황산화된 펩티드와의 체류 시간 상관관계에 의해 추가로 확증되었다. CDR 티로신의 구조적 분석은 황산화에 대한 산성 잔기의 영향을 확증한다. 이웃 산성 아미노산 잔기 및 국부 2차 구조의 요소는 Y31을 황산화에 대한 핫스팟으로 만드는 필수적인 역할을 할 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적 실시양태에 의해 범주에서 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본 발명의 범주는 본원에 구체적으로 제시된 실시양태 및 본원에 구체적으로 제시되지 않은 다른 실시양태를 포함하며; 본원에 구체적으로 제시된 실시양태가 반드시 망라적인 것으로 의도되지는 않는다. 본원에 기재된 것들 이외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될것이다. 이러한 변형은 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
특허, 특허 출원, 공개, 제품 설명, 및 프로토콜은 본 출원 전체에 걸쳐 인용되며, 그의 개시내용은 모든 목적상 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 출원은 전체가 참조로 포함된 미국 가출원 번호 62/414,209에 대한 우선권을 주장한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별적인 공개, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 유전자ID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된다고 나타낸 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 참조로 포함된다는 이러한 진술은, 심지어 이러한 인용이 참조로 포함된다는 전용 진술에 바로 인접하지 않은 경우에도, 각각이 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 확인된 각각의 및 모든 개별적인 공보, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 유전자ID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허에 관한 것으로, 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 본 출원인에 의해 의도된다. 명세서 내에서, 존재하는 경우에, 참조로 포함된다는 전용 진술의 포함은 참조로 포함된다는 이러한 일반적 진술을 어떠한 방식으로도 약화시키지 않는다. 본원에서 참고문헌의 인용은 참조가 선행 기술과 관련있다는 것을 인정하는 것으로 의도되지 않거나, 또는 이들 공개 또는 문헌의 내용 또는 일자에 관해 어떠한 승인도 구성하지 않는다. 참고문헌이 본 명세서에 제공된 정의와 충돌하는 청구된 용어에 대한 정의를 제공하는 경우에, 본 명세서에 제공된 정의가 청구된 발명을 해석하는데 사용될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Merck Sharp & Dohme Corp.
Zhao, Jia
Rios, Sandra
Dukleska Schussler, Svetlana
<120> Purification Process for Removal of Tyrosine Sulfation Antibody
Variants; Purified Compositions
<130> 24380
<150> 62/414,209
<151> 2016-10-28
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 1
atgaaatgca gctgggtcat cttcttcctg atggcagtgg ttataggaat caattcagag 60
gttcagctgc tccagtctgg ggcagaactt gtgaggtcag gggcctcagt caagttgtcc 120
tgcacagcct ctggcttcaa cattgaagac tactatatgc actggatgaa acagaggcct 180
gaacagggcc tggagtggat tggatggatt gatcctgtga atggtgatac tgaatatgcc 240
ccgaagttcc agggcaaggc cactatgact gcagacacat cctccaacac agcctaccta 300
cacctcaaca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtaattt ctatgatggt 360
tacctctttg ctttctgggg ccaagggacc ctggtcactg tctctgca 408
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 2
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ile Asn Ser Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Glu Asp Tyr Tyr Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Val Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Asn Phe Tyr Asp Gly Tyr Leu Phe Ala Phe Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus
<400> 3
Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus
<400> 4
Trp Ile Asp Pro Val Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus
<400> 5
Tyr Asp Gly Tyr Leu Phe Ala Phe
1 5
<210> 6
<211> 396
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 6
atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60
gatattgtgc tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtgtcc 120
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtgatg gcaacactta tctgtattgg 180
ctcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 240
tcaggggtcc cagacaggtt cagcggcagt gggtcaggaa ctgttttcac actgagaatc 300
agcagactgg aggctgagga tgtgggtatt tattactgta tgcaacatct agaatatcct 360
ttcacgtttg gaggggggac caagctggaa ataaaa 396
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 7
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gln Arg
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe
85 90 95
Thr Leu Arg Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys
130
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus
<400> 8
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus
<400> 9
Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus
<400> 10
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 11
atgggatgga gctggatctt tcttttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccgttgccag 60
atccgactgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctgggtcctc cttcactgac tactatataa actgggtgaa gcagaagcct 180
ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tatcctggaa gcggtaattc tatctacaat 240
gagaacttca aggccaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300
catctcagca gcctgacatc tgaggacact gctgtctatt tctgtgcaag agaggctgat 360
tacgacgatg ctttggacta ctggggtcaa ggaacctcgg tcaccgtctc ctca 414
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 12
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
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Val Arg Cys Gln Ile Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe
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Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ser Ile Tyr Asn
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Glu Asn Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
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Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Asp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<213> Mus
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Gly Ser Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn
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<213> Mus
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Ala
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<213> Mus
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Glu Ala Asp Tyr Asp Asp Ala Leu Asp Tyr
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 17
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro
1 5 10 15
Ala Ser Arg Gly His Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn
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Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
100 105 110
Ser Trp Pro Thr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
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<213> Mus
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
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Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Thr Tyr Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 22
Met Arg Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Met
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Ala Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu
35 40 45
Thr Asp Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Ile Ser Asp Ser Tyr Ser Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser
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Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
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Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr Trp Met His
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Ala Ile Asp Ile Ser Asp Ser Tyr Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Gly
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Ser Pro Phe Tyr Asn Ser Arg Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
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<223> Humanized mouse
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Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
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<223> Humanized mouse
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 32
Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Leu Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
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35 40 45
Thr Asp Tyr Asn Val Asp Trp Val Lys Gln Arg His Gly Lys Gly Leu
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65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
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Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp
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Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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Asp Tyr Asn Val Asp
1 5
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<213> Mus
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Gly
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<213> Mus
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<213> Artificial Sequence
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<223> Humanized mouse
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 37
Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
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Leu Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Asp Met Asn
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Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
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Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Arg Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 42
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 42
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 43
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu
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Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 44
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 44
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
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Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
<210> 45
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Humanized mouse
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu
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Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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<220>
<223> Humanized mouse
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu
20 25 30
Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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<223> Humanized mouse
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Xaa
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Xaa Ser Xaa Ser Xaa Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Asp Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa
Claims (28)
- 서열식별번호: 52의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 51의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 림프구 활성화 유전자 3(hLAG3)에 특이적으로 결합하는(항-hLAG3) 항체를 포함하는 정제된 조성물로서,
여기서 항-hLAG3 항체는 차이니즈 햄스터 난소 세포로부터 발현되고;
정제된 조성물은 비-티로신 황산화 항-hLAG3 항체와 비교하여 CDR-L1 상의 황산화 티로신을 포함하는 항-hLAG3 항체를 0.5% 미만으로 갖는 것인
정제된 조성물. - 제1항에 있어서, 비-티로신 황산화 항-hLAG3 항체가 148590 Da, 148752 Da, 또는 148914 Da의 분자량을 갖는 글리코실화 항체 종인 정제된 조성물.
- 제1항에 있어서, 항-hLAG3 항체가 피로글루타메이트로 전환된 N-말단 중쇄 글루타민, 또는 제거된 C-말단 중쇄 리신, 또는 둘 다를 갖는 것인 정제된 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-hLAG3 항체가 G0, G0-F, G1, G1-F, G2-F, 및 Man5 중 1종 이상의 차이니즈 햄스터 난소(CHO) N-연결된 글리칸을 포함하는 것인 정제된 조성물.
- 티로신 황산화 및 비-티로신 황산화 항체를 포함하는 수성 혼합물로부터 티로신 황산화 항체를 제거하기 위한 방법으로서,
혼합물의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하고,
수성 혼합물을 음이온 교환 수지와 접촉시키고,
수지로부터의 혼합물의 비-수지 결합된 수성 분획을 보유하는 것
을 포함하고;
여기서 티로신 황산화 항체 또는 비-티로신 황산화 항체는, 서열식별번호: 52의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 51의 경쇄 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 서열식별번호: 52의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 51의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 N-말단 중쇄 글루타민이 피로글루타메이트로 전환되고/거나 C-말단 중쇄 리신이 제거된 것인, 항-인간 LAG3 항체이고;
여기서 티로신 황산화는 CDR-L1 영역 내에 있는 것인, 방법. - 제5항에 있어서, 혼합물의 pH를 조정하는 단계가 혼합물의 pH를 6.5 내지 7.0으로 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서,
크로마토그래피 칼럼 내 음이온 교환 리간드를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 10 내지 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5 내지 7.5로 평형화시키고,
수성 혼합물의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하고,
혼합물을 칼럼에 적용하고,
유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고,
칼럼 내 수지를 10 내지 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5 내지 7.5로 세척하고,
유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것
을 포함하는 방법. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
등용매 조건 하에 수지를 수성 조성물로 세척하고,
세척 조성물을 수지로부터 제거 및 보유하는 것
을 추가로 포함하는 방법. - 제5항에 있어서,
크로마토그래피 칼럼 내 디메틸아미노프로필 음이온 교환 리간드를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5로 평형화시키고,
수성 혼합물의 pH를 6.5로 조정하고,
혼합물을 칼럼에 적용하고,
유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고,
칼럼 내 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5로 세척하고,
유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것
을 포함하는 방법. - 제5항에 있어서,
크로마토그래피 칼럼 내 4급화된 폴리에틸렌이민 음이온 교환 리간드를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 및 5 mM NaCl pH 7.0로 평형화시키고,
수성 혼합물의 pH를 7.0으로 조정하고,
혼합물을 칼럼에 적용하고,
유동-관통 분획을 칼럼으로부터 수집하고,
칼럼 내 수지를 25 mM 나트륨 포스페이트 및 5 mM NaCl pH 7.0으로 세척하고,
유동-관통 분획을 세척액으로부터 수집하는 것
을 포함하는 방법. - 제7항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 유동-관통물의 A280 흡광도가, A280이 적어도 2.5 흡광도 단위/cm에 처음 도달할 때 수집되고, A280이 1.0 흡광도 단위/cm 미만으로 떨어질 때까지 계속 수집되는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 항체를 양이온 교환 크로마토그래피, 결합-용리 모드의 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 단백질-A 크로마토그래피, 단백질-L 크로마토그래피, 단백질-G 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 분별 침전, 여과, 원심분리, 또는 바이러스 불활성화에 의해 정제하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 항체의 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄가 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 발현되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 비-티로신 황산화 항체가 148590 Da, 148752 Da, 또는 148914 Da의 분자량을 갖는 항체인 방법.
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