CN109963560A

CN109963560A - 用于除去酪氨酸硫酸化抗体变体的纯化方法、经纯化的组合物

Info

Publication number: CN109963560A
Application number: CN201780066847.1A
Authority: CN
Inventors: J.赵; S.里奥斯; S.D.舒斯勒
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2019-07-02
Also published as: JP2023011753A; EP3532046A1; MX2019004957A; US20200123251A1; AU2017347809A1; EP3532046A4; WO2018081329A1; RU2019116216A3; KR20190067898A; CA3039667A1; JP2019535676A; JP7229157B2; KR102617873B1; BR112019007856A8; RU2019116216A; BR112019007856A2

Abstract

本发明涉及纯化的抗体和抗原结合片段组合物，其缺乏在免疫球蛋白链的一个或多个酪氨酸残基上的硫酸化酪氨酸。还提供了用于从抗体和抗原结合片段组合物除去硫酸化酪氨酸变体的纯化方法。

Description

用于除去酪氨酸硫酸化抗体变体的纯化方法、经纯化的组合物

发明领域

本发明涉及包含缺乏酪氨酸硫酸化的抗体及其抗原结合片段的组合物以及用于制备组合物的纯化方法。

发明背景

酪氨酸硫酸化是一种翻译后修饰(PTM)，其中三氧化硫(SO₃)基团共价地结合至氨基酸酪氨酸基团的侧链上的羟基。该PTM发生在转运高尔基体网络中且由两种酶酪氨酰蛋白磺基转移酶(TPST)催化。该分子机制包含活化的硫酸从3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸至酪氨酸的转移，且已经在多种蛋白和肽上发现。最近的发现指示，酪氨酰蛋白磺基转移酶2会识别侧接酸残基的酪氨酸用于硫酸化。该PTM负责强化蛋白之间的相互作用且发生在分泌的蛋白和跨膜蛋白上。已经证实一些趋化因子受体被酪氨酸硫酸化诸如在CCR5（基本的HIV-1和几种糖蛋白激素受体）的N-端细胞外结构域处。例如，水蛭-衍生的凝血酶抑制肽水蛭素的天然形式被酪氨酸硫酸化。令人感兴趣的是，用于治疗多种血液凝固障碍的水蛭素的两种重组形式(Revasc和Refludan)没有硫酸化。硫酸化会使生物分子的质量增加80 Da，这是与三氧化磷部分(PO₃)相同的质量差。不同于PO₃，（其形成相当稳定的P-O键），SO₃是非常不稳定的且容易在高温和低pH条件下分解。

不同的PTM变体在治疗性抗体制品中的存在会导致异质性，根据修饰的位置，这可以导致抗体效能、生物利用度或免疫原性的变化。这样的问题也会在管理机构面前造成问题。尽管已经描述了在趋化因子受体和其它蛋白中的酪氨酸硫酸化，需要鉴别这样的修饰是否发生在抗体制品中，且如果鉴别出的话则除去它们。

发明概述

本发明提供了包含抗-LAG3抗体或其抗原结合片段(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9)的组合物，例如，其包含：

轻链可变结构域，其包含：

CDR-L1，其包含氨基酸序列：KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO: 38)；

CDR-L2，其包含氨基酸序列：GASNLES (SEQ ID NO: 39)；和

CDR-L3，其包含氨基酸序列：QQSTEDPRT (SEQ ID NO: 40)；和/或

重链可变结构域，其包含：

CDR-H1，其包含氨基酸序列：DYNVD (SEQ ID NO: 33)；

CDR-H2，其包含氨基酸序列：

DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 59)；

DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 60)；

DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 61)；

DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 62)；

DINPNGGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 63)；或

DINPNX₁GGTIYX₂QKFX₃X₄ (SEQ ID NO: 64)，其中，X₁= D、N、S或Q, X₂= A或S, X₃= Q或K和X₄= E或G；和

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO: 35)；其缺乏可检测水平的在CDR-L1上的硫酸化酪氨酸。

例如，在本发明的一个实施方案中，所述组合物中的抗体或片段进一步缺乏在选自以下的一个或多个成员中可检测水平的的硫酸化酪氨酸：FR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3、FR-L4、FR-H1、CDR-H1、FR-H2、CDR-H2、FR-H3、CDR-H3、FR-H4和恒定结构域。在本发明的一个实施方案中，所述抗体或片段包含经工程改造的酵母或CHO N-连接的聚糖。在本发明的一个实施方案中，含有抗-LAG3抗体(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9)的组合物包含一种或多种缺乏酪氨酸硫酸化且具有约148590 Da、148752 Da和/或148914 Da的分子量(例如，具有G0F和/或G1F聚糖种类，例如，如在表1中所示，将N-端重链谷氨酰胺转化成焦谷氨酸和/或将C-端重链赖氨酸除去)的抗体种类。

本发明也提供了一种从水性混合物除去酪氨酸硫酸化的抗体或其抗原结合片段(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9)的方法，所述水性混合物包含含有一个或多个硫酸化酪氨酸(例如，在CDR-L1上)的抗体或抗原结合片段以及缺乏硫酸化酪氨酸的抗体或抗原结合片段，所述方法包括：将所述混合物的pH调至约6.5至约7.0或约6.5至约7.5，使所述混合物与阴离子交换树脂接触，和除去并保留经过所述树脂的所述混合物的非树脂结合的水性级分。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括用水性组合物洗涤所述柱，例如，在等度条件下，和除去并保留经过所述树脂的所述洗涤组合物。在本发明的一个实施方案中，所述树脂是在柱中，且所述方法包括将所述混合物加入所述柱和从所述柱收集流通级分。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括用25 mM磷酸钠pH 6.5平衡在色谱柱中的包含二甲基氨基丙基阴离子交换配体的色谱树脂，将所述混合物的pH调至约6.5，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用25 mM磷酸钠pH 6.5洗涤所述柱中的树脂，和从所述洗液收集流通级分。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括用25 mM磷酸钠pH 7.0和任选的5 mM NaCl平衡在色谱柱中的包含季铵化的聚乙烯亚胺阴离子交换配体的色谱树脂；将所述混合物的pH调至约7.0，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用25 mM磷酸钠pH 7.0和任选的5 mM NaCl洗涤所述柱中的树脂；和从所述洗液收集流通级分。在本发明的一个实施方案中，监测阴离子交换色谱法流通液的A₂₈₀吸光度，并当A₂₈₀第一次达到至少约2.5吸光度单位/cm时收集并保留；且当A₂₈₀下落至低于约1.0吸光度单位/cm时不收集或保留。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法进一步包括通过阳离子交换色谱法、其它阴离子交换色谱法（以结合-洗脱模式）、疏水相互作用色谱法、蛋白-A色谱法、蛋白-L色谱法、蛋白-G色谱法、羟磷灰石色谱法、尺寸排阻色谱法、分级沉淀、过滤、离心或病毒灭活来纯化所述抗体或抗原结合片段。在本发明的一个实施方案中，在中国仓鼠卵巢细胞中表达所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链和/或重链。在本发明的一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含：

轻链可变结构域，其包含：

CDR-L1，其包含氨基酸序列：KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO: 38)；

CDR-L2，其包含氨基酸序列：GASNLES (SEQ ID NO: 39)；和

CDR-L3，其包含氨基酸序列：QQSTEDPRT (SEQ ID NO: 40)；和/或

重链可变结构域，其包含：

CDR-H1，其包含氨基酸序列：DYNVD (SEQ ID NO: 33)；

CDR-H2，其包含氨基酸序列：

DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 59)；

DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 60)；

DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 61)；

DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 62)；

DINPNGGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 63)；或

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO: 35)。

作为这样的方法的产品的组合物也是本发明的部分。在本发明的一个实施方案中，通过AEX色谱法纯化抗-LAG3抗体(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9)，其中所述抗体缺乏硫酸化酪氨酸，具有约148590 Da、148752 Da和/或148914 Da的分子量(例如，具有G0F和/或G1F聚糖种类，例如，如在表1中所示，将N-端重链谷氨酰胺转化成焦谷氨酸和/或将C-端重链赖氨酸除去)。

附图说明

图1. AEX进料(粗迹线)、剥离(浅迹线)和库级分(虚迹线)的IEX-HPLC UV分析概况的叠加。

图2. AEX进料、库和剥离样品的完整质谱图。

图3. AEX库和剥离样品的还原轻链质谱图。

图4A-B. AEX库和剥离级分的还原LysC肽作图（mapping）的UV迹线。

图5A-C. (A)在400-1800 m/z的轻链AA25-43+80 Da的CID片段化谱，(B)在m/z300-1100放大，(C)在m/z 1200-2000放大。

图6. 轻链肽AA25-43+80 Da的ETD片段化。标记了80Da的附着片段离子。

图7A-B. (A)有和没有碱性磷酸酶处理的AEX剥离级分的解卷积完整质谱图。(B)有和没有碱性磷酸酶处理的鸡卵白蛋白的解卷积完整质谱图。

图8A-B. (A)对归一化浓度的mAb AEX库和剥离进行还原SDS-PAGE，通过蛋白杂交针对人重链(HC)和轻链(LC)进行探测(上图)，然后剥离并针对抗硫代酪氨酸重新探测(下图)。参见在最右侧关于HC和LC的指示。(B)对归一化浓度的不同CHO-衍生的mAb（除了AEX剥离和库以外）进行还原SDS PAGE，通过蛋白杂交针对人HC和LC进行探测，然后剥离并针对抗硫代酪氨酸重新探测。关于(A)和(B)，使用MagicMark XP作为蛋白分子量标准，并分析等量的HEK293和EGF-处理过的A431细胞提取物作为对照。

图9A-C. (A)来自AEX剥离级分的LC25-43+80 Da、(B)合成肽XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (SEQ ID NO: 65)+磷酸化和(C)合成肽XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (SEQID NO: 65)+硫酸化的SIC。

图10. 在带状图中显示重链和轻链的CDR环的mAb酪氨酸(Y31)位点。

图11. 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO N-连接的聚糖)中和在经工程改造的酵母细胞(经工程改造的酵母N-连接的聚糖)中生产的单克隆抗体的占优势的N-连接的聚糖：正方形：N-乙酰基葡糖胺(GlcNac)；圆形：甘露糖(Man)；菱形：半乳糖(Gal)；三角形：岩藻糖(Fuc)。

发明详述

在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的某些抗体和其它蛋白被硫酸化酪氨酸变体污染。这样的变体的质谱分析的特征在于约+80 Da的加成化合物，其对应于添加的硫酸基团的质量。这样的加合物也是碱性磷酸酶抗性的且可与抗-硫酸化酪氨酸抗体反应。本发明提供了用于纯化包括这样的污染物酪氨酸硫酸化变体的组合物的方法以及基本上不含所述变体的抗体组合物。

根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。除非在本文中另外定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文有其它规定，否则单数形式的术语应当包括复数，且复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文记载相关使用的命名，以及本文记载的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学及杂交技术是本领域中众所周知且普遍使用的那些。本发明的方法和技术通常按照本技术领域中众所周知的以及如贯穿本说明书中所引用和讨论的各种一般性的以及更具体的参考文献中所记载的常规方法进行，除非另外指出。参见，例如，James M. Cregg (编), PichiaProtocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010), Sambrook等人.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel等人, Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, 和至2002年的增刊);Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Taylor和Drickamer, Introduction toGlycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry:Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry:Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), Animal Cell Culture (R.I.Freshney, 编(1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)。

硫酸化酪氨酸包括具有添加的硫酸基团的酪氨酸，例如，其具有以下结构：

。

色谱法

本发明提供了用于从组合物除去包含硫酸化酪氨酸的污染物变体抗体或其抗原结合片段(例如，Ab1-Ab9)的方法，所述组合物是例如包含抗体或片段的混合物的组合物，其中一些具有硫酸化酪氨酸且其中一些缺乏硫酸化酪氨酸以产生包含不可检测水平的酪氨酸硫酸化变体(例如，酪氨酸硫酸化的CDR-L1，例如，Ab1或Ab6的)的组合物。在本发明的一个实施方案中，通过阴离子交换(AEX)色谱法以流通模式处理所述组合物以除去酪氨酸硫酸化变体。在本发明的一个实施方案中，所述AEX树脂具有二甲基氨基丙基配体(即，包括二甲基氨基丙基部分的配体)。例如，在本发明的一个实施方案中，进行AEX色谱法的组合物是先前蛋白-A色谱纯化的产物。在本发明的一个实施方案中，在AEX处理(例如，具有二甲基氨基丙基配体)之前将所述组合物的pH调至约6.5的pH，例如，用Tris (例如，0.5M、0.725M或1M)。在本发明的一个实施方案中，平衡AEX柱(例如，具有二甲基氨基丙基配体)，例如，用磷酸钠，例如，25 mM，例如，pH 5、6.2或6.5的磷酸钠。在本发明的一个实施方案中，可以用缓冲液(例如，用磷酸钠，例如，25 mM，例如，pH 6.5的磷酸钠)洗涤所述柱(例如，具有二甲基氨基丙基配体)以回收所述柱内的抗体或片段，但是不会紧密地结合AEX树脂。将没有紧密地结合AEX树脂的流通液收集(例如，在级分中)，和例如合并。在本发明的一个实施方案中，在使用以后，将所述柱剥离，例如，用1M NaCl。

AEX流通物的质谱分析揭示在CDR-L1上缺乏酪氨酸硫酸化的Ab6的几种糖基化种类。这些种类总结在下面表1中。这些理论质量表示Ab6分子的计算质量，其中在重链上的N-端谷氨酰胺被转化成N-端焦谷氨酸(pE1)且在重链上的C-端赖氨酸被除去(-K)。

本发明包括一种组合物，其包含缺乏可检测水平的酪氨酸硫酸化（例如，在CDR-L1上）的抗-LAG3抗体(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9；优选地Ab6)，包含具有约148590、148749和/或148915的一种或多种分子量的种类；和/或包含聚糖种类G0F和/或G1F。

流通模式表示通过不包括洗脱步骤（用于回收多肽）的方法使用色谱树脂纯化多肽。在这样的方法中，目标多肽不会紧密地结合树脂，但是要从目标多肽除去的污染物物质却紧密地结合树脂。例如，在一种方法中以流通模式使用AEX树脂，所述方法包括将包含具有酪氨酸硫酸化的污染物变体抗体和缺乏酪氨酸硫酸化的抗体的组合物加载到含有AEX树脂的柱上，和将所述抗体或片段收集并保留在所述柱的流通液中。在不会导致洗脱的条件（例如，等度条件）下，可以将未结合的缺乏硫酸化的抗体从所述柱洗掉(和保留)。在这样的方法中，污染物保持结合至柱且缺乏酪氨酸硫酸化的抗体会保留在流通液中。

结合/洗脱模式表示通过包括洗脱步骤的方法使用色谱树脂纯化多肽。在这样的方法中，目标多肽紧密地结合树脂，但是要从目标多肽除去的污染物物质不会紧密地结合树脂。使用色谱柱，污染物流动穿过柱并且大部分保持未结合至树脂。在任选的洗涤后，当暴露于造成从树脂脱离的洗脱缓冲液时，结合的抗体不再结合并且被收集和保留。

色谱树脂配体是被固定至固定相颗粒(例如，琼脂糖颗粒)的物质，其可逆地结合存在于多组分流动相中的期望分子(例如，抗体或污染物)。

在本发明的一个实施方案中，所述AEX树脂具有配体季铵化的聚乙烯亚胺(即，包括季铵化的聚乙烯亚胺部分的配体)。在本发明的一个实施方案中，用1M NaCl预平衡所述树脂(例如，具有季铵化的聚乙烯亚胺配体)。在本发明的一个实施方案中，用磷酸钠（例如，25 mM）和NaCl（例如，5 mM）pH约7.0平衡所述树脂(例如，具有季铵化的聚乙烯亚胺配体)。在本发明的一个实施方案中，给所述柱(例如，具有季铵化的聚乙烯亚胺配体)加载进料，并用磷酸钠（例如，25 mM）和NaCl（例如，5 mM）pH约7.0洗涤；并将流通液收集，例如，在级分中，例如，并且合并。在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括用约10-50 mM磷酸钠（pH约6.5-7.5）平衡在色谱柱中的包含阴离子交换配体的色谱树脂，将所述混合物的pH调至约6.5-7.5，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用约10-50 mM磷酸钠（pH约6.5-7.5）洗涤所述柱中的树脂，和从所述洗液收集流通级分。在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括用约10-50 mM磷酸钠（pH约6.5-7.0）平衡在色谱柱中的包含阴离子交换配体的色谱树脂，将所述混合物的pH调至约6.5-7.0，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用约10-50 mM磷酸钠（pH约6.5-7.0）洗涤所述柱中的树脂，和从所述洗液收集流通级分。

可以将任何合适量的抗体或抗原结合片段加载到色谱树脂上，例如，色谱柱(例如，具有季铵化的聚乙烯亚胺配体或二甲基氨基丙基配体的AEX)。例如，在本发明的一个实施方案中，每升树脂(例如，具有季铵化的聚乙烯亚胺配体或二甲基氨基丙基配体的AEX)加载约100、110、120、130、140、150、100-150、160、170、180、190、200、300、150-200、100-200、250-350或280-320克物质（例如，抗体或片段）。

如果使用色谱柱(例如，含有具有季铵化的聚乙烯亚胺配体或二甲基氨基丙基配体的AEX树脂)，可以使用任何可接受的尺寸。例如，在本发明的一个实施方案中，柱直径或高度是约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30cm。

流速表示在一段时间中穿过柱(例如，含有具有季铵化的聚乙烯亚胺配体或二甲基氨基丙基配体的AEX树脂)的流动相的体积。在本发明的一个实施方案中，流速是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215升/小时。

在本发明的一个实施方案中，监测所述柱(例如，含有具有季铵化的聚乙烯亚胺配体或二甲基氨基丙基配体的AEX树脂)的流通液在280 nm (A₂₈₀)的吸光度。在本发明的一个实施方案中，收集并保留在流通液的主要A₂₈₀峰中的抗体或片段产物。在本发明的一个实施方案中，当A₂₈₀达到约1.0、1.5、2.0、2.5或3.0个A₂₈₀吸光度单位/cm (通道长度)时收集流通液，并当A₂₈₀下降至低于约1.0、1.5、2.0、2.5或3.0 A₂₈₀吸光度单位/cm (通道长度)时停止收集。

为了保护色谱柱(例如，含有具有季铵化的聚乙烯亚胺配体或二甲基氨基丙基配体的AEX树脂)免于由于流动相中的颗粒物而堵塞，可以使用柱前过滤器。在本发明的一个实施方案中，所述过滤器是聚醚砜膜。并且，可以使用柱后过滤器从流通液滤出任何微粒。在本发明的一个实施方案中，所述过滤器具有0.2或0.5 μm孔径。

可以证实具有硫酸化酪氨酸的变体的存在，例如，通过流通级分的质谱分析。硫酸化变体将具有比非硫酸化变体更高的质量。例如，在本发明的一个实施方案中，所述硫酸化变体比缺乏硫酸化的变体重约80 Da。在本发明的一个实施方案中，所述硫酸化耐受磷酸酶消化，且硫酸化的肽通过电子转移解离(ETD)具有与磷酸化的肽不同的片段化模式。

在本发明的一个实施方案中，包含缺乏酪氨酸硫酸化的抗体(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9；优选地Ab6)的组合物表示缺乏可检测的酪氨酸硫酸化(例如，在CDR-L1)的组合物。包含不可检测水平的酪氨酸硫酸化(例如，在CDR-L1)的组合物具有通过所述组合物的质谱分析不可观察到的水平。例如，在本发明的一个实施方案中，通过所述组合物的免疫球蛋白肽的完整和还原质量测量和还原肽作图，执行所述组合物的质谱分析。在本发明的一个实施方案中，所述还原肽作图包括抗体免疫球蛋白二硫键的变性和还原以及游离半胱氨酸的烷基化，继之以酶消化(例如，使用LysC、胰蛋白酶或GluC)。通过质谱法分析酶消化肽。在本发明的一个实施方案中，“不可检测的”水平表示与所述组合物中的未修饰的种类相比，小于约0.5%(小于约0.4%、0.3%、0.2%、0.1%)的酪氨酸硫酸化的种类(例如，在CDR-L1上)。

可以计算多肽的分子量，例如，基于已知的氨基酸(修饰的或未修饰的/硫酸化的或未硫酸化的)的重量和已知的修饰(例如氧化、脱酰胺化、糖基化、C和N末端修饰)。通过质谱分析可以测量分子量，例如，当与液相色谱法偶联时。在本发明的一个实施方案中，所述质谱法是四极飞行时间(quadrupole time-of-flight ，Q-TOF)质谱法或轨道阱质谱法。

术语“色谱法”表示通过使物质接触充当吸附剂的树脂将目标溶质（例如，组合物中的物质）与组合物中的其它物质分离的过程。由于例如溶质的性质，诸如pI、疏水性、大小和结构，在所述过程的特定缓冲条件下，吸附剂大致上强烈地吸附或保留物质。通过使组合物渗滤穿过色谱树脂床（例如，穿过含有树脂的柱）的传统方法，可以执行色谱法。分批色谱法纯化包括制备树脂的浆和使含有抗体或片段的组合物与所述浆接触以将要分离的物质吸附至所述树脂。将包含没有结合至树脂的物质的溶液从所述浆分离，例如，通过使所述浆沉降和除去上清液，并可以将未结合的物质保留或抛弃。对所述浆任选地进行一个或多个洗涤步骤。如果需要的话，可以使所述浆与适当的洗脱缓冲液接触以将树脂结合的物质从所述树脂解吸。可以将解吸的物质保留或抛弃。在本发明的一个实施方案中，使组合物中的抗体的硫酸化酪氨酸变体结合阴离子交换树脂，而非-硫酸化酪氨酸变体不会显著地结合所述树脂。

在本发明的一个实施方案中，通过蛋白-A或蛋白-G色谱法纯化抗体或其抗原结合片段。蛋白-G和蛋白-A分别是来自G群链球菌（Group G Streptococci）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的细菌蛋白。蛋白-G和蛋白-A对IgG-型抗体的Fc区的亲和力形成了IgG、含有Fc区的IgG片段和IgG亚类的纯化基础。可以将蛋白-A或蛋白-G偶联至可以用于蛋白-A或蛋白-G色谱法的固相诸如琼脂糖。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和蛋白-A和/或蛋白-G的方法来纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过多模态色谱法(混合模式)纯化抗体或其抗原结合片段。多模态或混合模式蛋白色谱法是基于已经用能够实现多种相互作用（例如，离子交换、羟磷灰石、亲和、尺寸排阻和/或疏水相互作用）模式的配体官能化的树脂。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和混合模式色谱法的方法来纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过蛋白-L色谱法纯化抗体或其抗原结合片段。蛋白L是通过免疫球蛋白轻链结合免疫球蛋白的大消化链球菌（Peptostreptococcus magnus）蛋白。蛋白L结合所有抗体种类的代表，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。重组蛋白L结合免疫球蛋白和免疫球蛋白片段的κ轻链的可变区。蛋白L结合人类的4个κ轻链亚型中的3个(1、3和4)和小鼠的κ1。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和蛋白-L色谱法的方法来纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过疏水相互作用色谱法(HIC)纯化抗体或其抗原结合片段。HIC分离具有疏水性差异的蛋白。分离是基于蛋白和色谱介质的疏水表面之间的可逆相互作用。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和HIC的方法来纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化抗体或其抗原结合片段。SEC分离具有分子大小差异的蛋白。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和SEC色谱法的方法来纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，对所述抗体或抗原结合片段进行病毒灭活。例如，在本发明的一个实施方案中，通过包括抗体或其抗原结合片段的组合物的pH处理，完成病毒灭活。具体地，组合物向极端pH的直接暴露可以用于病毒清除。例如，在本发明的一个实施方案中，pH处理是低pH处理(例如，pH 3.0-3.6)。在本发明的一个实施方案中，对所述抗体或抗原结合片段进行高pH处理。在本发明的一个实施方案中，用包括抗体或其抗原结合片段的组合物的溶剂或去污剂执行病毒灭活。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和病毒灭活的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

“离子交换”基于分子的净表面电荷的差异来分离所述分子。分子在它们的电荷性质上显著不同，且根据它们的总电荷、电荷密度和表面电荷分布的差异表现出与带电荷的色谱树脂的不同相互作用程度。在本发明的一个实施方案中，通过离子交换色谱法纯化抗体或其抗原结合片段。“离子交换色谱法”包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式色谱法。

短语“离子交换”树脂表示带负电荷的(即，阳离子交换)或带正电荷的(即，阴离子交换)的固相。

在本发明的一个实施方案中，通过阳离子交换色谱法纯化抗体或其抗原结合片段。“阳离子交换”树脂表示这样的固相：其是带负电荷的，且其具有游离阳离子用于与流过或穿过所述固相的水溶液中的阳离子交换。可以使用任何带负电荷的配体，其连接至适合形成阳离子交换树脂的固相。阳离子交换材料包括、但不限于具有以下配体的那些：磺丙基(SP) -CH₂-CH₂-CH₂-SO₃-；甲基磺酸根(S) -CH₂-SO₃ ^-；或羧甲基(CM) -CH₂-COO^-。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或用于通过包括AEX色谱法（以流通模式）和阳离子交换色谱法的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过阴离子交换色谱法纯化抗体或其抗原结合片段。“阴离子交换”树脂表示这样的固相：其是带正电荷的，因而具有一个或多个与其连接的带正电荷的配体。可以使用任何带正电荷的配体，其连接至适合形成阴离子交换树脂的固相。阴离子交换材料包括、但不限于具有以下配体的那些：季铵(Q) -CH₂-N+-(CH₃)₃；二乙基氨基乙基(DEAE) -CH₂-CH₂-N+-(CH₂-CH₃)₂；或二乙基氨基丙基(ANX) -CH₂-CHOH-CH₂-N+-(CH₂-CH₃)₂。GoPure D 50µm柱具有二甲基氨基丙基官能团。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括AEX色谱法（以流通模式）和AEX色谱法（以结合/洗脱模式）色谱法的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

术语“固相”或“固定相”用于指一种或多种配体（例如，阴离子交换配体或阳离子交换配体）可以附着的任何非水性基质，或可替换地，在尺寸排阻色谱法的情况下，它可以表示树脂的凝胶结构。流动相是液体，例如，在固相上携带抗体或抗原结合片段的水性物质是色谱纯化。流动相可以包括应用于柱的加载缓冲液。可以用于形成固相的材料的例子包括多糖（诸如琼脂糖和纤维素）和其它机械上稳定的基质诸如硅胶（例如，可控孔度玻璃）、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和这些中的任一种的衍生物。

在为了纯化加载含有抗体或抗原结合片段的混合物之前，使用“平衡”缓冲液或溶液来调节色谱树脂的pH和电导率。可以用于此目的的合适缓冲液或溶液是本领域众所周知的，例如，诸如上述的缓冲液，且包括在其pH与用于纯化目标蛋白的色谱步骤中所用的选定树脂相容的任何缓冲液。

使用“加载”缓冲液或溶液将含有抗体或抗原结合片段的混合物加载到纯化树脂(例如，阴离子交换树脂或阳离子交换树脂)上。任何适当的溶液可以用作加载缓冲液。在本发明的一个实施方案中，从源自以前纯化步骤的经缓冲的混合物（诸如洗脱缓冲液）制备加载缓冲液。

术语“洗涤”缓冲液或溶液是用于在洗脱抗体或抗原结合片段之前从纯化树脂（例如，阴离子交换树脂或阳离子交换树脂）洗脱一种或多种杂质的组合物。术语“洗涤”描述了适当的组合物在色谱树脂中或上面的穿过。在本发明的一个实施方案中，所述洗涤是等度的。在等度洗涤条件下，色谱法的流动相保持基本上相同。

尽管酪氨酸硫酸化变体抗体和抗原结合片段是污染物，但是本发明包括包含这样的变体的组合物，例如，结合至AEX色谱树脂或在没有未-酪氨酸硫酸化的变体存在下未结合。通过从未-酪氨酸硫酸化的抗体和片段除去后从AEX柱洗脱，可以得到未结合的变体。

“洗脱”缓冲液会解离结合至色谱树脂的分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。

上游处理

通过宿主细胞表达，可以产生要纯化除去污染物酪氨酸硫酸化变体的抗体和抗原结合片段。例如，在一个实施方案中，本发明的一种方法包括，在除去变体之前，在有利于抗体或抗原结合片段从宿主细胞和/或培养基的表达和分离的条件下，在培养基内的宿主细胞中表达重和/或轻免疫球蛋白链。本发明包括用于制备组合物的方法，所述组合物包含缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段，或通过包括宿主细胞表达和AEX色谱法（以流通模式）的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

本发明的范围包括生产组合物的方法，所述组合物包含不含有酪氨酸硫酸化(例如，在其CDR-L1上)的抗体或抗原结合片段，所述方法包括：(i)将编码所述抗体或片段的免疫球蛋白轻链和/或重链的多核苷酸引入宿主细胞(例如，CHO细胞)，和(ii)在有利于所述免疫球蛋白链在所述细胞中的表达的条件下培养所述宿主细胞，例如，其中具有免疫球蛋白链的抗体或抗原结合片段从所述宿主细胞分泌进培养基中，和(iii)通过包括阴离子交换色谱法（以流通模式，如本文中讨论的）的方法从宿主细胞和/或培养基分离所述免疫球蛋白链多肽。

例如，通过裂解，例如，方法诸如碾磨/磨损(例如，用玻璃珠)、弗氏压碎器细胞裂解、酶消化或超声处理，可以从宿主细胞释放抗体或片段。经裂解的细胞（包括源自它的可溶物和不溶物）形成细胞裂解物。本发明包括用于制备缺乏硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段的方法，或用于通过包括细胞裂解和AEX色谱法（以流通模式）的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过包括离心的方法纯化抗体或抗原结合片段。细胞裂解物或其它混悬液的离心会从含有抗体或片段的水性级分除去大部分颗粒物，诸如细胞碎片。例如，在本发明的一个实施方案中，在约40,000-50,000 X g执行离心(例如，在细胞裂解物上，包括抛弃裂解物的裂解物固体级分) 15-30分钟。在本发明的一个实施方案中，通过离心从液体细胞培养基除去细胞。例如，使用在约8,000 X g至约15,000 X g的范围内的重力(例如，约8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000)的离心，例如，其特征在于在约0.9 X 10^-8至2.8x 10⁹的范围内的Q/SIGMA比率。在本发明的一个实施方案中，将液体离心分离液深度过滤(例如，用0.1至约0.2 μm的孔径)。本发明包括用于制备缺乏硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段的方法，或用于通过包括离心和AEX色谱法（以流通模式）的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，在宿主细胞中表达与分泌信号序列融合的免疫球蛋白重链和轻链并从宿主细胞分泌进宿主细胞的培养基中。

在本发明的一个实施方案中，通过过滤来纯化抗体或抗原结合片段(例如，在AEX色谱纯化之前或之后)。例如，在本发明的一个实施方案中，将包含抗体或抗原结合片段的水性组合物过滤以除去固体微粒物质，例如，穿过具有约1 μm、0.45 μm或0.22 μm的孔径的过滤器。在本发明的一个实施方案中，所述过滤器由醋酸纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)制成。本发明包括用于制备缺乏硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段的方法，或用于通过包括AEX色谱法（以流通模式）和过滤的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，通过分级沉淀来纯化抗体或抗原结合片段。增加的盐浓度可以增强蛋白之间的疏水相互作用并导致选择性沉淀。在本发明的一个实施方案中，在有硫酸铵、硫酸葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷、聚乙二醇(PEG；例如，PEG4000)、丙酮、聚乙烯亚胺、硫酸鱼精蛋白、硫酸链霉素或辛酸存在下，沉淀包含抗体或片段的水性组合物。本发明包括用于制备缺乏硫酸化酪氨酸变体的抗体或其抗原结合片段的方法，或用于通过包括AEX色谱法（以流通模式）和分级沉淀的方法纯化抗体或其抗原结合片段以除去硫酸化酪氨酸变体的方法。

在本发明的一个实施方案中，在其中表达免疫球蛋白链的宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、杂交瘤细胞或真菌或酵母细胞，例如，毕赤酵母属（Pichia）诸如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞（例如，CHO细胞）缺乏谷氨酰胺合酶。

在本发明的一个实施方案中，编码免疫球蛋白重链和/或轻链的多核苷酸可操作地连接至一个或多个表达控制序列诸如启动子。例如，所述免疫球蛋白是在表达载体中。为了实现高水平的抗体或抗原结合片段表达，可以使用强启动子/增强子诸如巨细胞病毒(CMV)启动子和/或延伸因子α(EF1α)启动子来驱动免疫球蛋白重链和/或轻链表达。

在本发明的一个实施方案中，在启动子/增强子后面包括在5'非翻译区中的内含子序列以增加转录的mRNA从细胞核向细胞质的输出，且包括一个或多个3' 多腺苷酸化信号序列以使mRNA水平最大化。在本发明的一个实施方案中，多腺苷酸化信号序列是SV40晚期或早期多腺苷酸化信号序列或牛生长激素多腺苷酸化序列。在本发明的一个实施方案中，通过将GCC GCC(A/G)CC (SEQ ID NO: 69)放在第一个翻译起始密码子前面紧邻处来建立共有Kozak序列以增强翻译起始。在本发明的一个实施方案中，将信号肽序列放在免疫球蛋白链前面紧邻处来指导抗体或片段分泌。

可以监测细胞培养的条件并根据需要进行调节。例如，可以监测和调节条件诸如pH、细胞计数、细胞生存力和温度。在本发明的一个实施方案中，调节细胞培养的温度，例如，在接种后48小时从37℃调至30-35℃。在本发明的一个实施方案中，监测溶解氧和/或调节至设定点诸如20-50%。在本发明的一个实施方案中，监测溶解的CO₂和/或调节至例如不大于约120-150 mm Hg。在本发明的一个实施方案中，监测渗透压和/或调节至例如约270-330 mOsm/kg。

抗体

本发明提供了组合物，其包含缺少可检测水平的硫酸化酪氨酸的抗体及其抗原结合片段，以及分离包含这样的抗体和片段的组合物的方法。例如，在本发明的一个实施方案中，所述抗体或片段包含硫酸化酪氨酸并结合选自以下的抗原：PD1、CD27、LAG3、CTLA4、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2 CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17或TSLP。

就本发明的抗体和抗原结合片段所结合的多肽而言，术语“LAG3”表示人和食蟹猴（例如，食蟹猴（Macaca fascicularis）或恒河猴（Macaca mulatta））LAG3及其片段诸如它们的缺乏信号肽的成熟片段。

缺乏酪氨酸硫酸化的抗-LAG3抗体(例如，在WO2016028672中公开的Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9)的免疫球蛋白链的例子包括在下面总结的那些。例如，其中所述抗体或片段包含如下所述的CDR和/或免疫球蛋白链中的一个或多个。在本发明的一个实施方案中，所述污染物抗体或抗原结合片段包含具有氨基酸序列KASQSLDYEGDSDMN (SEQID NO: 38)的CDR-L1，其中Y (粗体和标有下划线)被硫酸化。

在本发明的一个实施方案中，所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含4A10重链免疫球蛋白和/或轻链免疫球蛋白；V_H和/或V_L链或轻链CDR和/或重链CDR (例如，4A10 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。

在本发明的一个实施方案中，对于Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9中的任一种，将任何N-端重链谷氨酰胺转化成焦谷氨酸和/或将任何C-端重链赖氨酸除去。

4A10- V_H序列

(SEQ ID NO: 1；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 2；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

4A10- V_L序列

(SEQ ID NO: 6；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 7；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

在本发明的一个实施方案中，所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含19E8重链免疫球蛋白和/或轻链免疫球蛋白; V_H和/或V_L链或轻链CDR和/或重链CDR (例如，19E8 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)：

19E8- V_H序列

(SEQ ID NO: 11；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 12；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

19E8- V_L序列

(SEQ ID NO: 16；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 17；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

在本发明的一个实施方案中，所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含11C9重链免疫球蛋白和/或轻链免疫球蛋白; V_H和/或V_L链或轻链CDR和/或重链CDR (例如，11C9 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)：

11C9- V_H序列

(SEQ ID NO: 21；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 22；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

11C9- V_L序列

(SEQ ID NO: 26；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 27；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

在本发明的一个实施方案中，所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含22D2重链免疫球蛋白和/或轻链免疫球蛋白; V_H和/或V_L链或轻链CDR和/或重链CDR (例如，22D2 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)：

22D2- V_H序列

(SEQ ID NO: 31；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 32；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

22D2- V_L序列

(SEQ ID NO: 36；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

(SEQ ID NO: 37；其中CDR标有下划线且其中信号序列呈粗体字体)

在本发明的一个实施方案中，所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9重链免疫球蛋白和/或轻链免疫球蛋白; V_H和/或V_L链或轻链CDR和/或重链CDR (例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8或Ab9 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)：

· Ab1: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链53AHH人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6) IgG1/κ(PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 41)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 42)；或

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 41的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 42的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab2: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链56AHH人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55S) IgG1/κ(PX) (或其可变结构域)；例如，包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 43)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 44)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 43的氨基酸1-111(CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 44的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab3: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链54AHH人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55D) IgG1/κ(PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 45)

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 46)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 45的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 46的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab4: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链52AHH人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55Q) IgG1/κ(PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 47)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 48)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 47的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 48的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab5: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链57AHH人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6) IgG4 S228P (PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 49)；和

(SEQ ID NO: 50)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 49的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 50的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab6: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链73AHD人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55D/VL3) IgG4 S228P/κ(PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 51)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 52)；或

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 51的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 52的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab7: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链21AHG人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55S/VL3) IgG4 S228P/κ(PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 53)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 54)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 53的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 54的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

· Ab8: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链80AHG人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55Q/VL3) IgG4 S228P/κ(PX) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 55)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 56)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 55的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 56的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

或者

· Ab9: 人源化的轻链45AGX人源化的x [LAG3_H] mAb (LB145.22D2.E1.D1 (VL3))κ(PX) (或其可变结构域)和人源化的重链72AHD人源化的x [LAG3_H] mAb(LB145.22D2.E1.D1 VH6 N55G/VL3) IgG4 S228P/κ(PX)) (或其可变结构域)；例如包含：

轻链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 57)；和

重链免疫球蛋白，其包含氨基酸序列：

(SEQ ID NO: 58)；或者

轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 57的氨基酸1-111 (CDR标有下划线))；和

重链免疫球蛋白可变结构域，其包含氨基酸序列:

(SEQ ID NO: 58的氨基酸1-119 (CDR标有下划线))

；或包含CDR：

和

。

在本发明的一个实施方案中，本发明的任何抗-LAG3抗体或其抗原结合片段的CDR-H2包含氨基酸序列：

其中，

X₁= D、N、S或Q

X₂= A或S

X₃= Q或K

X₄= E或G。

本发明包括包含N-连接的聚糖的抗体及其抗原结合片段(例如，4A10、19E8、11C9和/或22D2；例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8和/或Ab9)，所述N-连接的聚糖通常添加至在中国仓鼠卵巢细胞（CHO N-连接的聚糖）或经工程改造的酵母细胞（例如，巴斯德 毕赤酵母）（经工程改造的酵母N-连接的聚糖）中生产的免疫球蛋白。例如，在本发明的一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含在图11中所示的“经工程改造的酵母N-连接的聚糖”或“CHO N-连接的聚糖”中的一种或多种(例如，G0和/或G0-F和/或G1和/或G1-F和/或G2-F和/或Man5)。在本发明的一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含经工程改造的酵母N-连接的聚糖，即，G0和/或G1和/或G2，任选地，进一步包括Man5。在本发明的一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含CHO N-连接的聚糖，即，G0-F、G1-F和G2-F，任选地，进一步包括G0和/或G1和/或G2和/或Man5。在本发明的一个实施方案中，在抗体或抗原结合片段免疫球蛋白链上的所有N-连接的聚糖中的约80%至约95%(例如，约80-90%、约85%、约90%或约95%)是经工程改造的酵母N-连接的聚糖或CHO N-连接的聚糖。参见Nett等人.Yeast. 28(3): 237-252 (2011)；Hamilton等人. Science. 313(5792): 1441-1443(2006)；Hamilton等人. Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-392 (2007)。例如，在本发明的一个实施方案中，经工程改造的酵母细胞是GFI5.0或YGLY8316或在美国专利号7,795,002或Zha等人. Methods Mol Biol. 988:31-43 (2013)中所述的菌株。也参见国际专利申请公开号WO2013/066765。

抗-LAG3抗体的酪氨酸硫酸化变体(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8和/或Ab9)包含约148670 Da、148832 Da和/或148994 Da的分子量。缺乏酪氨酸硫酸化的变体包含约148590 Da、148752 Da和/或148914 Da的分子量。

“分离的”抗体或其抗原结合片段至少部分地不含有来自用于生产它们的细胞或细胞培养物的其它生物分子。这样的生物分子包括核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其它材料诸如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体或抗原结合片段还可以至少部分地不含有表达系统组分诸如来自宿主细胞的生物分子或其生长培养基的生物分子。通常，术语“分离的”不意图表示这样的生物分子的完全缺失，或水、缓冲液或盐的缺失，或包括抗体或片段的药物制剂的组分。

抗体的抗原结合片段是抗体的部分，其保留特异性地结合被全长抗体结合的抗原的能力。抗原结合片段的例子包括、但不限于，Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；纳米抗体（nanobodies）和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。

一般而言，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每个对具有一个“轻”链和一个“重”链。通常参见，Fundamental Immunology第7章(Paul,W., 编, 第2版Raven Press, N.Y. (1989)。

单克隆抗体是基本上同质的抗体，即，除了可以以微量存在的可能的天然发生的突变，构成该群体的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。参见Kohler等人(1975) Nature256: 495；美国专利号4,816,567; Clackson等人(1991) Nature 352: 624-628; Marks等人(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597；和Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731。

嵌合抗体是具有来自一级抗体的可变结构域和来自二级抗体的恒定结构域的抗体，其中所述一级抗体和二级抗体来自不同的种类(美国专利号4,816,567；和Morrison等人, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855)。通常，所述可变结构域得自来自实验动物（诸如啮齿动物）的抗体(“亲本抗体”)，且所述恒定结构域序列得自人抗体，使得得到的嵌合抗体在人受试者中引起不利免疫应答的可能性低于亲本(例如，小鼠)抗体。

人源化抗体含有来自人和非人（例如，小鼠或大鼠）抗体的序列。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且所有的或基本上所有的框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些。所述人源化抗体可以任选地包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)。

可以将免疫球蛋白分配至不同的类别，取决于它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列。存在至少五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几类可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4; IgA-1和IgA-2。本发明包含这些抗体类别或亚类中的任意种的抗体和抗原结合片段(例如，抗-LAG3)。

在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段(例如，抗-LAG3)包含重链恒定区，例如人恒定区，诸如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段(例如，抗-LAG3)包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，诸如λ或κ人轻链区域或其变体。作为例子，且非限制，所述人重链恒定区可以是γ4且所述人轻链恒定区可以是κ。在一个替代实施方案中，所述抗体的Fc区是具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman, J等人, Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001)。

实施例

这些实施例例证本发明且无意对其限制。

实施例1: 抗体酪氨酸硫酸化变体的鉴别和纯化方法。在该实施例中，鉴别Ab6的酪氨酸硫酸化抗体变体的存在，并开发了除去所述变体的纯化方法。

材料和方法

碱性磷酸酶可得自New England Biolabs (Ipswich, MA)。抗-酪氨酸硫酸化抗体可得自Millipore (Billerica, MA)。合成肽购自AnaSpec (Fremont, CA)。

阴离子交换(AEX)色谱法

使用GE Akta Avant系统使用POROS GoPure D预填充柱（0.5 x 5 cm, 1 mL）以流通模式执行AEX色谱法。将蛋白-A色谱法纯化的mAb的pH用1M Tris调至pH 6.5并加载到所述柱上。在蛋白加载之前，将所述柱用25 mM磷酸钠pH 6.5平衡，在加载后，将所述柱用25 mM磷酸钠pH 6.5洗涤并用1M NaCl剥离。在运行过程中监测在280 nm的吸光度。收集并分析级分、库和剥离（strip）和AEX负载。

离子交换HPLC

使用Agilent 1600系列系统在环境温度在MabPac SCX-10柱(4×250 mm, 3.14 ml)上执行离子交换HPLC。流动相B是30 mM磷酸钠pH 8.0，且流动相A是25 mM MES, pH 5.8。首先在1.0 mL/min的流速用14%流动相B平衡柱10 min。然后使用流动相B的梯度(在18 min中14%至80%)从所述柱洗脱mAb蛋白。然后将所述柱用100%流动相B清洁3 min，并在14%流动相B中重新平衡用于下一次样品分析。在LC运行中监测洗脱液在280 nm的吸光度。

完整的和还原的LC/MS

将20 μg样品用50 mM Tris缓冲液pH 8.0稀释至0.5 mg/mL。使用Waters AcquityUPLC H-Class执行RP-HPLC分离。使用的柱是Acquity UPLC BEH300 C4, 1.7 μm, 1.0 x100 mm (Waters, Milford, MA; -O-(Si)(CH₃)₂-C₄H₉配体)。流动相是，在水中的0.1%甲酸(FA)作为流动相A和在乙腈(ACN)中的0.1%FA作为流动相B。LC流速是0.08 mL/min，并将柱温度维持在80℃。使用4 - 15 min的30%- 90%B的梯度洗脱抗体。在Waters Xevo G2 Q-TOF系统上在m/z 800–4000的范围内扫描获得MS波谱。

通过还原缓冲液(50 mM Tris pH 8.0，含有6 M盐酸胍)将20 μg样品稀释至100 μL的终体积。将2微升1M二硫苏糖醇(DTT) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)溶液加入每个样品，随后在56℃温育20分钟。在Waters Acquity UPLC H-Class上执行RP-UPLC分离。使用的柱是Acquity UPLC, BEH300 C4, 2.1 x 100mm, 1.7um (Waters)。在Waters Xevo G2Q-TOF系统上在m/z 600 - 3000的范围内扫描获得MS波谱。通过MassLynx 4.1的MaxEnt1分析MS数据。

肽作图LC/MS

将100 μg样品缓冲液交换至100 uL含有50 mM Tris pH 8.0、6 M盐酸胍和5 mM EDTA的变性缓冲液。用20 mM DTT溶液在56℃进行还原反应30分钟。将所述样品用50 mM碘乙酰胺在黑暗中在室温烷基化30分钟。通过加入1 μL 500 mM DTT溶液，终止烷基化反应。将还原的和烷基化的样品用消化缓冲液(50 mM Tris pH 8.0)稀释至300 μL的终体积，然后以1:20 (w:w)的酶:底物比加入Lys-C酶(Wako, Richmond, VA)。将溶液在37℃温育4小时。使用HALO Peptide ES-C18, 2.1 x 150 nm, 2.7 μm柱(MAC-MOD Analytical, Inc.,Chadds Ford, PA)，通过Waters Acquity UPLC H-Class上的RP-HPLC分离肽。在WatersXevo G2 Q-TOF系统上在m/z 100 - 2000的范围内扫描获得MS波谱。通过BiopharmaLynx1.3 (Waters)分析MS数据。

靶MS/MS

在LTQ-Orbitrap MS系统(Thermo Fisher, Waltham, MA)上进行靶肽的LC/MS/MS。为MS/MS获取应用FT模式的17500的分辨率。使用HALO Peptide ES-C18柱, 2.1X150 mm, 2.7µm，通过Waters Acquity UPLC H-Class分离肽。在m/z范围内扫描MS/MS，取决于前体离子的m/z值。将归一化的片段化能量设定在35%（对于CID片段化）和35%（对于ETD片段化）。手工地解释MS2数据。

碱性磷酸酶处理

将10 ug在AEX剥离级分中的mAb蛋白在50uL磷酸酶反应缓冲液中稀释。加入1uL (10单位)来自小牛肠的碱性磷酸酶(New England Biolabs, Ipswish, MA)在37℃温育1小时。并行处理鸡卵白蛋白(Sigma)作为阳性对照。将10uL溶液注射给LC/MS用于质量分析。

蛋白质印迹法

将Magic Mark XP Western Standard (Invitrogen)和特定浓度的单克隆抗体(mAb)和对照细胞提取物(HEK293全细胞提取物和EGF刺激的A431细胞裂解物(Millilpore))用β-巯基乙醇还原，并在95℃加热，然后使用4-20%梯度凝胶(Novex)通过基于Tris-甘氨酸的SDS PAGE进行拆分。随后将拆分的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上并在Tris-缓冲盐水+0.5%吐温20 (TBST) (Sigma)中在摇振下在4℃洗涤过夜。然后将膜在Tris-缓冲盐水+ 1%BSA(TBS-BSA) (Sigma)中在室温在连续摇振下封闭1小时。将一级抗体(抗-硫代酪氨酸/抗-酪氨酸硫酸化(Millipore)或抗-人IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch LabratoriesInc.))稀释进TBS-BSA中并与膜一起在室温温育2 h。用TBST洗涤以后，将HRP-缀合的二级抗体(山羊-抗-小鼠或山羊-抗-兔(Thermo Scientific))稀释进5%脱脂乳蛋白+0.5%吐温20-磷酸缓冲盐水(Invitrogen)中并在室温温育1小时。用TBST最终洗涤以后，将化学发光底物(Thermo Scientific)用于显色；通过向胶卷(GE Healthcare Life Sciences)曝光和随后处理来回收信号。如以前指示的(Kaufmann SH, E.C., Shaper JH., The erasableWestern blot. Anal Biochem., 1987. 161(1): 第89-95页)，进行一级抗体之间的硝酸纤维素膜剥离。

结果和讨论

mAb分子的分离

在单克隆抗体纯化过程中通常将阴离子交换色谱法(AEX)用作精制步骤。该步骤通常以流通模式运行，其中mAb流动穿过柱并且过程中杂质(HCP, DNA)结合柱。在AEX发展过程中，注意到加载到柱上的mAb的一部分结合树脂，这会影响蛋白回收。蛋白结合级分洗脱在AEX色谱法的剥离级分中。为了表征与AEX柱结合的mAb，分析了AEX色谱法的级分：“加载”表示AEX纯化之前的样品；“库”表示样品的流通部分，且“剥离”表示样品的结合级分。最初通过IEX-HPLC色谱法分析来自AEX色谱法的加载、库和剥离级分。图1显示了在AEX加载、库和剥离级分中的mAb的IEX-HPLC分析概况。如在图1中所示，剥离级分具有与加载和库相比显著更高的量的酸性变体：在剥离级分中为~65%酸变体(浅迹线)，与此相比，在库级分中为23%(虚迹线)和在进料级分中为33%(粗迹线)。在酸性前-主峰注意到另外的差异。该峰以较高水平存在于AEX进料中，而在AEX库中，该峰最小。剥离级分富含酸性前-主峰。还用如上所述的相同缓冲液和盐条件在pH 7.0或7.5执行AEX色谱法。在pH 7.0，也在AEX库中观察到酸性前-主峰的类似减少。

通过质谱法分析完整的和还原的蛋白

为了表征杂质，使用Q-TOF MS通过完整的和还原的LC/MS分析了所有三种级分(AEX加载、库和剥离)。图2显示了完整分子的解卷积质谱图。在所有三种级分中观察到三种主要糖型：G0F/G0F、G0F/G1F和G1F/G1F，分别具有148591 Da、148751 Da和148912 Da的质量。含有G0F/G0F的该分子的计算的完整质量是148590 Da。完整质量测量的质量误差都在25 ppm内。另外的种类仅在AEX剥离级分中检测到。这些种类对应于三种主要糖型(G0F/G0F、G1F/G0F、G1F/G1F)的80 Da质量增加(148668、148830、148991 Da)。为了定位修饰，在用还原剂DTT切割二硫键以后测量轻链和重链质量。没有检测到剥离级分和库级分的重链质量的差异，从而提示修饰不位于重链上(数据未显示)。如在图3中所示，在两种级分(剥离和库级分)中检测到轻链apo形式质量(23674 Da)和糖化的轻链质量(23836 Da)。具有轻链的80Da增加的峰仅在AEX剥离级分的23754 Da中观察到。还原的质量测量的质量误差是在20ppm内。这些数据提示，80 Da修饰位于Ab6的轻链上。

通过肽作图来分析mAb抗体

为了进一步定位修饰位点，将AEX剥离和库级分还原、烷基化，并然后用LysC酶消化。将肽混合物通过Q-TOF MS进行质量作图。当对比这两种级分的UV迹线时，注意到两个差异。如在图4(a)和(b)中所示，在AEX剥离级分中在保留时间37.6 min和65.2 min处检测到两个新峰。在新峰中观察到的m/z是在37.6min的1165.4796 (2+) Da和在65.2 min的1476.7372(4+) Da。观察到的质量对应于轻链肽AA25-43+80Da和AA25-78 +80 Da，分别具有6.4 ppm和9.8 ppm的质量误差。轻链肽AA25-78含有一个错误切割位点。在图4中标记了轻链肽AA25-43和AA25-78的修饰的和未修饰的形式。基于在提取的离子色谱图(SIC)中的峰面积，相对于它们的apo形式，估计该经修饰的肽的水平是20.9%和21.6%（对于AA25-43和AA25-78）。

经修饰的肽的MS/MS片段化

具有80 Da的质量增加的修饰存在两种可能性：磷酸化(+79.9663 Da)和硫酸化(+79.9568 Da)。这两种修饰的理论质量差异仅为0.0095 Da，这使得难以仅通过质量来区分。最初，将靶肽AA25-78通过碰撞诱导解离(CID)片段化，并将产生的片段通过LTQ-OrbitrapMS进行分析。如在图5中所示，观察到修饰基团(80Da)从前体离子的完全丢失。仅检测到来自肽主链的片段，这证实了LC25-43的肽序列。然而从CID片段化没有得到位点特异性的信息。已经报道，硫酸化酪氨酸(sY)是非常不稳定的且在标准CID条件下容易丢失(Nemeth-Cawley JF1, K.S., Rouse JC., Analysis of sulfated peptides using positiveelectrospray ionization tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom., 2001. 36(12): 第1301-11页)。使用阳离子CID MS/MS不可能得到关于硫酸部分的位置的位点特异性信息，因为原始前体离子在肽主链片段化时都不存在。相反，磷酸化的肽倾向于在CID下持续，且肽主链片段化允许所述修饰的位点特异性鉴别(Nemeth-Cawley JF1, K.S.,Rouse JC., Analysis of sulfated peptides using positive electrosprayionization tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom., 2001. 36(12): 第1301-11页)。在图5中，观察到80 Da从前体离子的中性丢失。已知磷酸化的特征性中性丢失离子是-H₃PO₄ (-98 Da)，且特征性片段离子是PO₃ ^-(-79 Da)。而对于硫酸化，特征性中性丢失离子和片段离子都是具有80 Da的-SO₃离子(Monigatti F, H.B., Steen H., Proteinsulfation analysis--A primer. Biochim Biophys Acta., 2006. 1764(12): 第1904-13页)。CID MS2数据提示80 Da修饰是硫酸化。

另一种广泛使用的片段化机制是电子转移解离(ETD)。它将电子转移至多种质子化的肽/蛋白，这可以导致N-Cα主链键的切割和产生c-和z-型片段离子，而不损失PTM定位的信息(Mikesh LM, U.B., Chi A, Coon JJ, Syka JE, Shabanowitz J, Hunt DF., Theutility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis. Biochim BiophysActa., 2006. 1764(12): 第1811-22页)。ETD可以提供关于CID的补充信息：ETD过程允许保留SO₃基团并从而允许氨基酸定位，而CID优选地片段化不稳定的修饰。在我们的情况中，通过具有ETD片段化和高分辨率质量检测的LTQ-Orbitrap来分析靶肽。如在图6中所示，在前体离子上观察到80 Da修饰的部分丢失。将具有附带的SO₃基团(80 Da)的片段离子标记。基于附带SO₃的片段离子(c9、c11、c12-16)的检测，将修饰位点鉴别为轻链上的酪氨酸31，其在mAb分子的CDR1区域中。

碱性磷酸酶处理

由于酪氨酸的磷酸化和硫酸化是等比重的（isobaric），在这里使用碱性磷酸酶来区分这两种修饰(Yu Y, H.A., Moore KL, Leary JA., Determination of the sites oftyrosine O-sulfation in peptides and proteins. Nat Methods, 2007. 4(7): 第583-8页)。碱性磷酸酶已经被广泛地用于从蛋白除去磷酸化基团。将鸡白蛋白用作阳性对照，因为该蛋白被广泛已知它的磷酸化和糖基化形式。将鸡白蛋白和在AEX剥离级分中的mAb并行地用磷酸酶处理并在37℃温育。图7显示了在磷酸酶处理之前和之后测量的mAb和鸡卵白蛋白的完整质量。如在图7(a)中所示，没有观察到mAb的质量变化。而对于鸡白蛋白(图7 (b))，对所有主要糖型观察到160 Da的明显质量转移。由于鸡白蛋白含有两个磷酸化位点，160 Da的丢失证实了碱性磷酸酶的活性。由于在磷酸酶处理之前和之后没有检测到质量变化，它提示在AEX剥离中的该mAb未被磷酸化。

蛋白质印迹

迄今，LC/MS分析已经被用于研究向轻链CDR上的酪氨酸31的自然80 Da加成化合物。在磷酸酶处理以后mAb AEX剥离级分的MS2分析和质量分析已经提示，80 Da加成化合物在酪氨酸31上硫酸化。但是，由于这两种基团的类似分子质量，这些基于质量分析的技术直接区分酪氨酸-硫酸化和磷酸化的能力是有问题的。为了开始解决该问题，应用具有抗-硫代酪氨酸-特异性的单克隆抗体的蛋白质印迹法来证实酪氨酸硫酸化在mAb AEX剥离级分中的存在(Xu J, D.X., Tang M, Li L, Xiao L, Yang L, Zhong J, Bode AM, Dong Z, TaoY, Cao Y., Tyrosylprotein sulfotransferase-1 and tyrosine sulfation ofchemokine receptor 4 are induced by Epstein-Barr virus encoded latentmembrane protein 1 and associated with the metastatic potential of humannasopharyngeal carcinoma. PLoS One., 2013. 8(3): 第e56114页)。在图8a (上图)中，对mAb AEX库和剥离级分的归一化浓度进行还原SDS PAGE，通过蛋白杂交探测人重链和轻链。然后将来自库和剥离的增加的重链和轻链浓度“剥离”第一检测抗体并用抗-硫代酪氨酸-特异性的单克隆抗体重新探测(下图)。如在图8a (下图)中所示，仅在剥离级分的轻链上检测到阳性信号，从而提示其含有酪氨酸硫酸化。作为与磷酸化的交叉反应性的对照，给泳道1加载EGF-处理过的A431细胞提取物的商业来源，其富含磷酸化的蛋白。阳性信号在下图的泳道1中的缺乏表明抗-硫代酪氨酸单克隆抗体不具有与磷酸化的强交叉反应性(图8a, 下图)。进一步，将HEK 293提取物（其被生产商提议作为抗-硫代酪氨酸单克隆抗体的阳性对照）加载在泳道2中。在底部下面的阳性信号-20 KDa与生产商的分析一致(图8a, 下图)。在图8b中，对除了AEX剥离和库以外的不同的CHO-衍生的mAb (mAb1、2和3)的归一化浓度进行还原SDS PAGE，通过蛋白杂交探测人重链和轻链(上图)，然后剥离并重新探测抗硫代酪氨酸(下图)。与图8a一致，当用抗-硫代酪氨酸抗体探测时，仅AEX mAb剥离显示出在轻链位置处的阳性信号。对于其它三种CHO-衍生的Merck mAb，当分析类似的量的蛋白时，没有观察到酪氨酸硫酸化的阳性信号。这与我们的以下观察一致：在这三种mAb上没有检测到增加的水平的AEX酸性峰或酪氨酸硫酸化热点(数据未显示)。

具有硫酸化或磷酸化的合成肽的保留时间的对比

为了进一步区分磷酸化和硫酸化，通过LC/MS分析了具有LCAA25-43的相同序列(XSXSXDYEGDSDXXXXXXX) (SEQ ID NO: 65)的合成肽，其在Y31上用磷酸化或硫酸化修饰。图9显示了在AEX剥离中的合成肽XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (SEQ ID NO: 65)+磷酸化、XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (SEQ ID NO: 65)+硫酸化和AA25-43+80Da的SIC。具有硫酸化的合成肽在与AEX剥离相同的保留时间洗脱，而具有磷酸化的合成肽比AEX剥离更早地洗脱。这进一步证实了我们的观察：在轻链上的Y31被硫酸化。

酪氨酸硫酸化位点的结构

蛋白酪氨酸硫酸化反应由被称作酪氨酰蛋白磺基转移酶的高尔基酶催化。以前的研究指示，TPST会识别可接近的酪氨酸残基，该残基经常被在-5至+5位置内的几个酸性残基包围(Hortin G, F.R., Gordon JI, Strauss AW., Characterization of sites oftyrosine sulfation in proteins and criteria for predicting their occurrence.Biochem Biophys Res Commun., 1986. 141(1): 第326-33页; Rosenquist GL, N.H.J.,Analysis of sequence requirements for protein tyrosine sulfation. ProteinSci., 1993. 2(2): 第215-22页; Teramoto T1, F.Y., Kawaguchi Y, Kurogi K,Soejima M, Adachi R, Nakanishi Y, Mishiro-Sato E, Liu MC, Sakakibara Y, SuikoM, Kimura M, Kakuta Y, Crystal structure of human tyrosylproteinsulfotransferase-2 reveals the mechanism of protein tyrosine sulfationreaction. Nat Commun., 2013. 4: 第1572页)。受体酪氨酸需要具有在附近的酸性残基以实现在TPST2底物结合位点中的带正电荷的残基的识别。受体酪氨酸也需要是在固有柔性区域中以适应进TPST2的深裂缝。但是，尚未定义酪氨酸硫酸化位点的一般共有序列。描述硫酸化酪氨酸的序列环境的最常见特征包括一个酸性氨基酸在酪氨酸的2个残基内的存在；至少三个酸性氨基酸在5个残基内的存在，和附近的转角诱导氨基酸的存在等(Monigatti F, H.B., Steen H., Protein sulfation analysis--A primer. BiochimBiophys Acta., 2006. 1764(12): 第1904-13页)。图10显示了在剥离状图中在CDR环的背景下mAb酪氨酸位点的结构，其由MOE软件(Chemical Computing Group, 蒙特利尔, 加拿大)产生。在该mAb上在轻链Y31附近的序列是：XSXSXDYEGDSDXXXXXXX (SEQ ID NO: 65)。在该序列中，Y31的邻近残基都是酸性的：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。共4个酸性残基在Y31的5个残基内：3个D和1个E。4个转角诱导残基接近Y31:3个丝氨酸(S)和1个甘氨酸(G)。具有邻近酸性氨基酸的Y31的独特结构和局部二级结构的要素在使该修饰发生中起重要作用。

我们在这里描述的证据指向意外的O-连接的酪氨酸硫酸化在CHO生产的抗体中的存在。在轻链的CDR1区域中发现了该不稳定的修饰的位置，如用ETD片段化通过质谱法鉴别的。通过磷酸酶处理、蛋白质印迹实验（使用抗-酪氨酸硫酸化抗体和与合成的硫酸化的肽的保留时间关联）进一步证实了该酪氨酸硫酸化。CDR酪氨酸的结构分析证实了酸性残基对硫酸化的影响。邻近的酸性氨基酸残基和局部二级结构的元件可能在使Y31成为硫酸化的热点中起重要作用。

本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，本发明的范围包括在本文中具体阐述的实施方案和在本文中没有具体阐述的其它实施方案；在本文中特别阐述的实施方案不必然地意图为穷尽性的。除了本文描述的那些以外，本领域技术人员从前述描述会明白本发明的不同改变。这样的改变意图落在权利要求书的范围内。

在本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，它们的公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。本申请要求美国临时申请号62/414,209（通过引用整体并入本文）的优先权。本文中引用的所有参考文献都通过引用并入，如同每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被明确地且单独地指出通过引用并入。申请人根据37 C.F.R. §1.57(b)(1)意图用该通过引用并入的声明来表示每个和每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，它们中的每一个按照37 C.F.R. §1.57(b)(2)清楚地鉴别，即使这样的引用不紧接于通过引用并入的专门声明。如果包含的话，在说明书中包含的通过引用并入的专门声明不以任何方式弱化该通过引用并入的一般声明。本文中对参考文献的引用无意承认：所述参考文献为有关的现有技术，其也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。就所述参考文献提供的声明的术语的定义与在本发明的说明书中提供的定义冲突而言，在本发明的说明书中提供的定义应当用于解释要求保护的发明。

Claims

1.一种包含抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段包含：

轻链可变结构域，其包含：

CDR-L1，其包含氨基酸序列：KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO: 38)；

CDR-L2，其包含氨基酸序列：GASNLES (SEQ ID NO: 39)；和

CDR-L3，其包含氨基酸序列：QQSTEDPRT (SEQ ID NO: 40)；和

重链可变结构域，其包含：

CDR-H1，其包含氨基酸序列：DYNVD (SEQ ID NO: 33)；

CDR-H2，其包含氨基酸序列：

DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 59)；

DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 60)；

DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 61)；

DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 62)；

DINPNGGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 63)；或

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO: 35)；

所述组合物缺乏可检测水平的包含在CDR-L1上的硫酸化酪氨酸的抗体或片段。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段进一步在选自以下的一个或多个成员中的缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸：FR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3、FR-L4、FR-H1、CDR-H1、FR-H2、CDR-H2、FR-H3、CDR-H3、FR-H4和恒定结构域。

3.根据权利要求1-2中的任一项所述的组合物，其中所述抗体是包含SEQ ID NO: 52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 51的轻链氨基酸序列的Ab6。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含CHON-连接的聚糖。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的组合物，其中所述抗体是Ab6且包含一种或多种具有约148590 Da、148752 Da或148914 Da的分子量的种类。

6.根据权利要求1-5中的任一项所述的组合物，其中所述抗体是Ab6，其中N-端重链谷氨酰胺被转化成焦谷氨酸和/或C-端重链赖氨酸被除去。

7.一种用于从水性混合物除去酪氨酸硫酸化的抗体或其抗原结合片段的方法，所述水性混合物包含酪氨酸硫酸化的和非-酪氨酸硫酸化的抗体或其抗原结合片段，所述方法包括将所述混合物的pH调至约6.5至约7.0，使所述混合物与阴离子交换树脂接触，和保留经过所述树脂的所述混合物的非树脂结合的水性级分。

8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括在等度条件下用水性组合物洗涤所述树脂和除去并保留经过所述树脂的所述洗涤组合物。

9.根据权利要求7-8中的任一项所述的方法，其中使所述混合物与阴离子交换树脂接触包括将所述混合物加给包含所述阴离子交换树脂的色谱柱；且其中所述方法包括从所述柱收集流通级分。

10.根据权利要求7-9中的任一项所述的方法，所述方法包括用25 mM磷酸钠pH 6.5平衡在色谱柱中的包含二甲基氨基丙基阴离子交换配体的色谱树脂，将所述混合物的pH调至约6.5，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用25 mM磷酸钠pH 6.5洗涤所述柱中的树脂，和从所述洗液收集流通级分。

11.根据权利要求7-9中的任一项所述的方法，所述方法包括用25 mM磷酸钠、5 mMNaCl pH 7.0平衡在色谱柱中的包含季铵化的聚乙烯亚胺阴离子交换配体的色谱树脂，将所述混合物的pH调至约7.0，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用25 mM磷酸钠、5 mM NaCl pH 7.0洗涤所述柱中的树脂，和从所述洗液收集流通级分。

12.根据权利要求7-11中的任一项所述的方法，其中当A₂₈₀第一次达到至少约2.5吸光度单位/cm时收集阴离子交换色谱法流通液的A₂₈₀吸光度，且继续直到当A₂₈₀下落至低于约1.0吸光度单位/cm时。

13.根据权利要求7-12中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括通过阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法（以结合-洗脱模式）、疏水相互作用色谱法、蛋白-A色谱法、蛋白-L色谱法、蛋白-G色谱法、羟磷灰石色谱法、尺寸排阻色谱法、分级沉淀、过滤、离心或病毒灭活，纯化所述抗体或抗原结合片段。

14.根据权利要求7-13中的任一项所述的方法，其中在中国仓鼠卵巢细胞中表达所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链和重链。

15.根据权利要求7-14中的任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含：

轻链可变结构域，其包含：

CDR-L1，其包含氨基酸序列：KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO: 38)；

CDR-L2，其包含氨基酸序列：GASNLES (SEQ ID NO: 39)；和

CDR-L3，其包含氨基酸序列：QQSTEDPRT (SEQ ID NO: 40)；和/或

重链可变结构域，其包含：

CDR-H1，其包含氨基酸序列：DYNVD (SEQ ID NO: 33)；

CDR-H2，其包含氨基酸序列：

DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 59)；

DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 60)；

DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 61)；

DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 62)；

DINPNGGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 63)；或

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO: 35)。

16.根据权利要求7-15中的任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是抗体，且其中缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸的抗体是具有约148590 Da、148752 Da和/或148914 Da的分子量的种类。

17.根据权利要求7-16中的任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 51的轻链氨基酸序列。

18.根据权利要求7-16中的任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 51的轻链氨基酸序列，其中N-端重链谷氨酰胺被转化成焦谷氨酸和/或C-端重链赖氨酸被除去。

19.一种组合物，其是根据权利要求7-17中的任一项所述的方法的产物。

20.一种用于从水性混合物除去酪氨酸硫酸化的抗体或其抗原结合片段的方法，所述水性混合物包含酪氨酸硫酸化的和非-酪氨酸硫酸化的抗体或其抗原结合片段，所述方法包括将所述混合物的pH调至约6.5至约7.5，使所述混合物与阴离子交换树脂接触，和保留经过所述树脂的所述混合物的非树脂结合的水性级分。

21.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括在等度条件下用水性组合物洗涤所述树脂和除去并保留经过所述树脂的所述洗涤组合物。

22.根据权利要求20-21中的任一项所述的方法，其中使所述混合物与阴离子交换树脂接触包括将所述混合物加给包含所述阴离子交换树脂的色谱柱；且其中所述方法包括从所述柱收集流通级分。

23.根据权利要求20-22中的任一项所述的方法，所述方法包括用约10-50 mM磷酸钠（pH约6.5-7.5）平衡在色谱柱中的包含阴离子交换配体的色谱树脂，将所述混合物的pH调至约6.5-7.5，将所述混合物应用于所述柱，从所述柱收集流通级分，用约10-50 mM磷酸钠（pH约6.5-7.5）洗涤所述柱中的树脂和从所述洗液收集流通级分。

24.根据权利要求20-23中的任一项所述的方法，其中在中国仓鼠卵巢细胞中表达所述抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白轻链和重链。

25.根据权利要求20-24中的任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含：

轻链可变结构域，其包含：

CDR-L1，其包含氨基酸序列：KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO: 38)；

CDR-L2，其包含氨基酸序列：GASNLES (SEQ ID NO: 39)；和

CDR-L3，其包含氨基酸序列：QQSTEDPRT (SEQ ID NO: 40)；和/或

重链可变结构域，其包含：

CDR-H1，其包含氨基酸序列：DYNVD (SEQ ID NO: 33)；

CDR-H2，其包含氨基酸序列：

DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 59)；

DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 60)；

DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 61)；

DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 62)；

DINPNGGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO: 63)；或

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO: 35)。

26.根据权利要求20-25中的任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 51的轻链氨基酸序列。

27.根据权利要求20-25中的任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 52的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 51的轻链氨基酸序列，其中N-端重链谷氨酰胺被转化成焦谷氨酸和/或C-端重链赖氨酸被除去。

28.根据权利要求27所述的方法，其中缺乏可检测水平的硫酸化酪氨酸的抗体是具有约148590 Da、148752 Da和/或148914 Da的分子量的种类。