CN108303483B - 曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的hplc检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学检测领域，具体涉及一种曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，包括（1）色谱条件与系统适用性试验（2）溶液制备（3）测定等步骤。本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，该方法操作简单，检测效率高，误差小，专属性强，检验方法较稳定，受影响的因素较少，适用性广；该方法的准确度、精密度、专属性、检出限等均符合方法学验证要求，具有很强的实用性，采用该方法对各个企业生产的曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分进行检测，能够快速准确的检测出硫酸新霉素各组分含量，从而有利于对各个企业生产的曲咪新乳膏样品进行判定。
Description
技术领域
本发明属于化学检测领域，具体涉及一种曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法。
背景技术
曲咪新乳膏为皮肤外用复方制剂，具有很强的抗真菌作用，在临床上主要用于治疗皮肤湿疹、接触性皮炎、脂溢性皮炎、体癣、股癣以及手足癣等，曾用名有脚癣净霜剂、皮康霜。曲咪新乳膏为我国自主研发产品，属于非基本药物，最早由广东华润顺峰药业有限公司研发生产，1985年获得批文上市销售。由于其治疗效果显著，目前在临床上已被广泛使用，其主成分为：硝酸咪康唑、醋酸曲安奈德和硫酸新霉素。
硫酸新霉素（Neomycin sulfate）是曲咪新乳膏的主成分之一，是多组分氨基糖苷类抗生素，对葡萄球菌属、棒状杆菌属有良好的抑菌作用，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属等肠杆菌科细菌亦有良好作用。硫酸新霉素是首个被发现的氨基糖苷类抗生素，它是1949年Waksman等从新霉素链霉菌代谢产物中分离得到的混合物，其主要成分为新霉素B和C，新霉素A（新霉胺）是新霉素B、C的降解产物之一。曲咪新乳膏的现行标准中，《国家药品标准》化学药品地方标准上升国家标准第二册，不控制硫酸新霉素的含量；国家食品药品监督管理局标准YBH16902004和YBH20102006采用效价法测定硫酸新霉素的含量，然而采用效价法测定曲咪新乳膏中硫酸新霉素的含量较为费时费力，而且这两个标准中效价法的适用性还需进一步考察。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足而提供的一种曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，采用该方法对曲咪新乳膏中硫酸新霉素的组分进行测定，操作简单，检测效率高，误差小，专属性强，检验方法较稳定，适用性广，能有效的控制曲咪新乳膏的质量。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件与系统适用性试验：
用亲水性十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters Xselect HSS T3柱，4.6×250mm，5μm或等效柱，流动相：0.15mol/L的三氟乙酸溶液，流速：1ml/min，进样量：20μl，柱温：30℃，检测器雾化温度：45℃，新霉素C相对于新霉素B的保留时间为0.85-0.95（约为0.9），新霉素C与主峰新霉素B之间的分离度不低于3.0；
（2）溶液制备：
①供试品溶液制备：称取本品0.5g，精密称定，置分液漏斗中，加二氯甲烷25ml，振摇使乳膏基质分散，再精密加水20ml，振摇提取三分钟后静置分层，吸取上层水溶液，7000转/min离心10分钟后，用0.45μm的滤膜过滤，即得供试品溶液；
②标准曲线溶液的制备：精密称取硫酸新霉素标准品约25mg，置50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液，精密量取对照品储备液1、1.5、2、2.5、3ml，分别置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得标准曲线溶液1～5；
（3）测定:分别精密量取供试品溶液和标准曲线溶液各20ul注入液相色谱仪，照上述的色谱条件测定，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，按标准品组分，用标准曲线法计算各组分相对含量。
上述的曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，所述的检测器为电喷雾检测器（CAD）。
所述的曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，用HPLC法检测曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分将新霉素B与新霉素C分离，可单独测定这两个组分的含量。
以下为本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法的方法学验证情况：
1、专属性试验
通过问卷调查，了解到曲咪新乳膏各个厂家的处方工艺，综合各个厂家的处方情况，制备空白辅料（按各厂家提供的最大处方量称取）。称取曲咪新乳膏的空白辅料约0.5g，置分液漏斗中，按前述检测方法中供试品溶液的制备方法制备空白辅料溶液，进样测定，同时取曲咪新乳膏样品按前述测定法中供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，进样测定；记录色谱图（见图1、图2）。从图1-图2中可见，空白基质在硫酸新霉素出峰的位置无对应的色谱峰，空白辅料对测定无干扰，说明本发明方法的专属性良好。
2、线性关系考察
按前述检测方法中标准曲线溶液的制备方法制备得标准曲线溶液，取制备得到的标准曲线溶液，进样测定，以浓度x（mg/ml）对峰面积y进行线性回归，结果：新霉素B在0.04127mg/ml～0.1238mg/ml范围内线性关系良好，线性方程为y = 34.457x + 0.3847，相关系数r为0.999（见图3），新霉素C在0.00821mg/ml～0.02463mg/ml范围内线性关系良好，线性方程为y = 31.809x + 0.0142，相关系数r为0.999（见图4）。
3、溶液稳定性考察
取国药集团三益药业(芜湖)有限公司的一批样品（批号161204）制备供试品溶液，分别在放置0、2、4、8、10、16、20、24小时后进样测定，测定新霉素B和新霉素C的峰面积，结果表明供试品溶液在24小时内稳定，新霉素B峰面积的RSD为1.2%，新霉素C峰面积的RSD为1.5%，测定结果见下表1。
4、进样精密度试验
取前述制备得到的标准曲线溶液3，连续进样6针，分别以新霉素B和新霉素C的峰面积考察仪器的精密度，结果新霉素B峰面积的RSD为0.7%，新霉素C峰面积的RSD为1.8%（见下表2），表明仪器精密度良好。
5、重复性试验
取广东恒健制药有限公司的样品（批号170305），按前述检测方法中供试品溶液的制备方法制备成6份供试品溶液，进样20μl，计算其平均含量及RSD，结果见下表3，结果表明该方法重复性良好。
6、回收试验
（1）模拟回收率实验
称取缺主药的空白基质（广东华润顺峰药业有限公司提供）0.5g，置分液漏斗中，精密加入新霉素B浓度为3.5825mg/ml，新霉素C浓度为1.1857mg/ml的储备溶液0.4ml、0.5ml、0.6ml，按前述检测方法中供试品溶液的制备方法配制成80%、100%、120%的回收率溶液，进样20μl，测定，结果见下表4。
（2）各厂家加样回收率实验
由于曲咪新乳膏各厂家用的辅料的类别和数量都相差较大，我们无法获得每个厂家的空白基质，采用加样回收率实验，验证该方法对其中20家生产企业的样品的适用性。
①取样品0.5g，精密称定，置分液漏斗中，精密加入新霉素B浓度为3.5825mg/ml，新霉素C浓度为1.1857mg/ml的储备溶液0.5ml，按前述检测方法中供试品溶液的制备方法配制成100%的回收率溶液，进样10μl（同时制备样品溶液，进样20μl），测定，结果见下表5，从测定结果可见，本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法操作简单，适用性广。
②提取效率的测定
取上述①项下其中一个厂家提取过一次的二氯甲烷液，再精密加水10ml，振摇提取3分钟后静置使分层，取上层水溶液，7000转/min离心10分钟后，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液测定，结果二氯甲烷的二次提取液中未检出新霉素B和新霉素C，说明萃取一次即可以完全将硫酸新霉素提取出来。
7、定量限及检出限
取硫酸新霉素标准品11.09mg，置10ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取0.2ml，置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，进样20μl测定。（浓度：含新霉素B17.148μg/ml，含新霉素C 3.412μg/ml）。结果：结果表明新霉素B定量限为6.75μg/ml（0.14μg），检出限为2.10μg/ml（0.04μg）；新霉素C定量限为8.32μg/ml（0.17μg），检出限为2.50μg/ml（0.05μg）。
本发明的有益效果为：
本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，该方法操作简单，检测效率高，误差小，专属性强，检验方法较稳定，受影响的因素较少，适用性广；本发明方法的准确度、精密度、专属性、检出限等均符合方法学验证要求，具有很强的实用性。
附图说明
图1为曲咪新乳膏空白辅料的液相色谱图；
图2为曲咪新乳膏供试品溶液的液相色谱图；
图3为本发明制备的标准曲线溶液中新霉素B的浓度x（mg/ml）与峰面积y的线性关系图；
图4为本发明制备的标准曲线溶液中新霉素C的浓度x（mg/ml）与峰面积y的线性关系图；
图5为采用本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法对20家企业生产的曲咪新乳膏样品进行测定得出的曲咪新乳膏中新霉素B的含量分布图；
图6为采用本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法对20家企业生产的曲咪新乳膏样品进行测定得出的曲咪新乳膏中新霉素C的含量分布图。
具体实施方式
实施例1
一种曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，包括以下步骤：
（1）色谱条件与系统适用性试验：
用亲水性十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters Xselect HSS T3柱，4.6×250mm，5μm或等效柱，流动相：0.15mol/L的三氟乙酸溶液，流速：1ml/min，进样量：20μl，柱温：30℃，CAD检测器雾化温度：45℃，新霉素C相对于新霉素B的保留时间为0.85-0.95（约为0.9），新霉素C与主峰新霉素B之间的分离度不低于3.0；
（2）溶液制备：
①供试品溶液制备：称取本品0.5g，精密称定，置分液漏斗中，加二氯甲烷25ml，振摇使乳膏基质分散，再精密加水20ml，振摇提取三分钟后静置分层，吸取上层水溶液，7000转/min离心10分钟后，用0.45μm的滤膜过滤，即得供试品溶液；
②标准曲线溶液的制备：精密称取硫酸新霉素标准品25mg，置50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液，精密量取对照品储备液1、1.5、2、2.5、3ml，分别置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得标准曲线溶液1～5；
（3）测定:分别精密量取供试品溶液和标准曲线溶液各20ul注入液相色谱仪，照上述的色谱条件测定，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，按标准品组分，用标准曲线法计算各组分相对含量。
应用效果
选择20家企业的曲咪新乳膏样品，采用上述HPLC-CAD检测方法的方法步骤对曲咪新乳膏样品进行检测，测定曲咪新乳膏样品中新霉素组分情况， 测定结果如下：
①20家企业的曲咪新乳膏样品，其新霉素B的含量在0.8556mg/g～3.8317mg/g范围，含量差距较大。经统计分析，所有样品含量均值为3.3399mg/g，标准偏差为0.301，经正态分布检验（K-S检验），服从正态分布（见图5）。
对20家企业样品中新霉素B的含量进行分析（见表6），其中江西德成、遂成药业的偏差较大，其原料均来源于四川省长征药业股份有限公司。重庆科瑞的样品中新霉素B的含量显著低于其他厂家。
②20家企业的曲咪新乳膏样品的新霉素C的含量在0.3047mg/g～1.6680mg/g范围，含量差距较大。经统计分析，所有样品含量均值为1.0093mg/g，标准偏差为0.269, 经正态分布检验（K-S检验），服从正态分布（见图6）。
对20家企业的样品中新霉素C的含量进行分析（见表7，其中广州白云山、特一药业和新乡琦宁药业的偏差较大，其原料均来源于宜昌三峡制药有限公司；三明天泰、华润顺峰、江西德成、辰欣弗都、遂成药业的样品中新霉素C的含量较低，其原料均来源于四川省长征药业股份有限公司。重庆科瑞的样品中新霉素C的含量显著低于其他厂家。
③综合分析
由于曲咪新乳膏中油相基质比较多，受基质的影响样品的取样量受到限制，不能过大，否则回收率偏低，因此在该样品浓度下，样品只能检测出新霉素B和新霉素C，其他杂质无法检测到。而通过发明人对硫酸新霉素原料组分研究得知，新霉素B含量越高，效价就越大，新霉素C和其他杂质的含量对效价影响不大。因此我们可以采用新霉素B的含量对样品的质量进行初步的分析。通过对中检院提供的硫酸新霉素标准品（批号130309-201512，本品为硫酸新霉素，供抗生素微生物效价测定用，含量以新霉素单位计，每毫克相当于652单位）和部分批次厂家提供的硫酸新霉素原料中新霉素B的含量和效价换算（见表8），我们将新霉素B的含量限定于不少于2.8mg/g为可接受范围。
根据上述对20家企业的曲咪新乳膏样品进行测定的结果，按上述限度对20家企业的曲咪新乳膏样品进行判定，发现江西德成制药有限公司有5批样品、重庆科瑞制药(集团)有限公司有3批样品均不符合规定；分别按拟定的效价方法测定上述8批样品的效价，效价也均低于90.0%。
上述可见，采用本发明曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，操作简单，检测效率高，误差小，适用性广；采用该方法对各个企业生产的曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的进行检测，能够快速准确的检测出硫酸新霉素含量，从而有利于对各个企业生产的曲咪新乳膏样品进行判定。
Claims (1)
1.一种曲咪新乳膏中硫酸新霉素组分的HPLC检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：Waters Xselect HSS T3柱，4.6×250mm，5μm，流动相：0.15mol/L的三氟乙酸溶液，流速：1ml/min，进样量：20μ l ，柱温：30℃，检测器雾化温度：45℃，新霉素C相对于新霉素B的保留时间为0.85-0.95，新霉素C与主峰新霉素B之间的分离度不低于3.0；
（2）溶液制备：
①供试品溶液制备：称取本品0.5g，精密称定，置分液漏斗中，加二氯甲烷25ml，振摇使乳膏基质分散，再精密加水20ml，振摇提取三分钟后静置分层，吸取上层水溶液，7000转/min离心10分钟后，用0.45μm的滤膜过滤，即得供试品溶液；
②标准曲线溶液的制备：精密称取硫酸新霉素标准品25mg，置50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液，精密量取对照品储备液1、1.5、2、2.5、3ml，分别置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得标准曲线溶液1～5；
（3）测定:分别精密量取供试品溶液和标准曲线溶液各20μ l 注入液相色谱仪，照上述的色谱条件测定，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，按标准品组分，用标准曲线法计算各组分相对含量；
所述的检测器为电喷雾检测器CAD；
还采用HPLC法单独测定新霉素B与新霉素C这两个组分的含量。
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