CN108285931B - 一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒 - Google Patents
一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明方法包括如下步骤：提取待测样本DNA，使用cccDNA引物对和探针(SEQ ID NO.1‑3所示)对PSAD酶消化后的DNA样本进行cccDNA定量，使用管家基因引物对和探针对未经PSAD酶消化的DNA样本进行管家基因定量标化肝细胞数目。本发明试剂盒包含用于扩增HBV cccDNA和管家基因的引物对和探针，阴性质控品和阳性质控品，ddPCR试剂和PSAD酶消化试剂。本发明检测全过程操作简单、省时，为临床患者的多种来源标本的cccDNA定量检测提供了一种新的高灵敏度方法和试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒。
背景技术
全球范围内，每年都有超过75万名患者被诊断为肝细胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)，其发病率在所有肿瘤中排第四位，死亡率位于第三(CHEN W,ZHENG R,BAADE P D,et al.2016.Cancer statistics in China,2015.CA Cancer J Clin[J],66:115-132)。60岁以下的癌症患者中，肝癌发病人数位居第二、死亡人数高居第一。在中国，每年有45万多患者被诊断为肝癌，超过40万名患者因肝癌而死亡。目前发现肝癌的主要病因有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的慢性感染、丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus,HCV)感染、酒精以及黄曲霉素B1的暴露(FORNER A,LLOVET J M,BRUIX J2012.Hepatocellular carcinoma.Lancet[J],379:1245-1255.)，在中国80％以上肝癌患者均存在HBV感染。由于缺乏有效的早期诊断措施，HCC确诊时大多数患者为终末期或发生远端转移，5年生存期不到10％。目前临床肝癌的诊断主要依赖血清标志物甲胎蛋白(AFP)和医学影像学检查，血清AFP的正常参考范围为0.89～8.78ng/mL，以AFP>20ng/mL为cut-off值，诊断肝癌的灵敏度为49％～71％，特异度为49％～86％，难以实现早期诊断(OMATAM,LESMANA L A,TATEISHI R,et al.2010.Asian Pacific Association for the Studyof the Liver consensus recommendations on hepatocellular carcinoma.HepatolInt[J],4:439-474.)；临床上肝癌的治疗措施以手术切除为主，取得满意疗效的关键在于早期诊断。
HBV属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，正嗜肝DNA病毒属(Hepadnavirus)。HBV通常只感染肝细胞，在肝胞内复制增殖。病毒颗粒大小约为42nm，外部包膜镶嵌有3种包膜蛋白，内部为3.2kb的病毒DNA。HBV基因组是带有部分缺口的松弛环状双链DNA(relaxedcircular DNA,rcDNA)分子，含有部分单链区。HBV病毒颗粒在受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的帮助下，进入肝细胞，rcDNA在肝细胞核内被修复闭环，形成共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA)。
在宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ的作用下，cccDNA作为转录模板形成3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb大小的4种mRNA，其中最长的3.5kb mRNA被称为前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，这些mRNA编码相应蛋白，并组装形成HBV子代病毒(HONG X,KIM E S,GUO H2017.Epigenetic Regulation of Hepatitis B Virus Covalently Closed CircularDNA:Implications for Epigenetic Therapy against Chronic HepatitisB.Hepatology[J])。
目前临床上最常用的抗HBV药物主要是核苷(酸)类似物(nucleos(t)ideanalogues,NAs)，NAs针对HBV病毒的聚合酶Poly蛋白，抑制病毒的反转录而降低HBV DNA载量，但无法清除肝细胞内cccDNA，而cccDNA的存在是HBV持续感染和复发的主要原因，在HBV介导的肝癌发生发展过程中起重要作用(GAO Y,FENG J,YANG G,et al.2017.Hepatitis Bvirus X protein-elevated MSL2 modulates hepatitis B virus covalently closedcircular DNA by inducing degradation of APOBEC3B to enhancehepatocarcinogenesis.Hepatology[J],66:1413-1429.)。研究发现肝癌病人肝组织内cccDNA含量高于非肝癌病人(WONG D K,YUEN M F,POON R T,et al.2006.Quantificationof hepatitis B virus covalently closed circular DNA in patients withhepatocellular carcinoma.J Hepatol[J],45:553-559.)，无病生存期与肝组织内的cccDNA含量相关，cccDNA含量高的病人无病生存期显著低于cccDNA含量低的患者(HOSAKAT,SUZUKI F,KOBAYASHI M,et al.2010.HBcrAg is a predictor of post-treatmentrecurrence of hepatocellular carcinoma during antiviral therapy.Liver Int[J],30:1461-1470.)。因此，近年来越来越多的研究致力于开发cccDNA靶向性抗病毒药物。干扰素类药物可通过多种途径来降解病毒的mRNA或阻断病毒翻译起始来控制HBV的复制，如高剂量的干扰素α通过上调肝细胞核内的APOBEC3脱氨酶降解cccDNA，并且不具有肝细胞毒性。淋巴毒素β也具有和干扰素α类似的功能，降解肝细胞内cccDNA(LUCIFORA J,XIA Y,REISINGER F,et al.2014.Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclearhepatitis B virus cccDNA.Science[J],343:1221-1228.)。同时，各种siRNA、CRISPR/Cas9等靶向cccDNA的新技术也相继问世，并逐步推向临床(YANG H C,KAO J H2014.Persistence of hepatitis B virus covalently closed circular DNA inhepatocytes:molecular mechanisms and clinical significance.Emerg MicrobesInfect[J],3:e64.)。正因如此，临床上迫切需要新方法针对cccDNA评价这些新药物的抗HBV治疗效果。
cccDNA在体内的含量很低：在慢性HBV感染的鸭肝内cccDNA大约是10copies/cell(ZHANG Y Y,ZHANG B H,THEELE D,et al.2003.Single-cell analysis of covalentlyclosed circular DNA copy numbers in a hepadnavirus-infected liver.Proc NatlAcad Sci USA[J],100:12372-12377.)；在慢性HBV感染的小鼠肝细胞内和人肝脏穿刺组织中，cccDNA拷贝数更低，约为0.01～1copy/cell(ALLWEISS L,VOLZ T,LUTGEHETMANN M,etal.2014.Immune cell responses are not required to induce substantialhepatitis B virus antigen decline during pegylated interferon-alphaadministration.J Hepatol[J],60:500-507.；WERLE-LAPOSTOLLE B,BOWDEN S,LOCARNINIS,et al.2004.Persistence of cccDNA during the natural history of chronichepatitis B and decline during adefovir dipivoxil therapy.Gastroenterology[J],126:1750-1758)。这些研究表明只有部分肝细胞感染HBV病毒，并在核内形成稳定的cccDNA池。当这些HBV感染的肝细胞破坏后，核内的cccDNA池释放入血，导致血清cccDNA的出现(YUEN M F,WONG D K,SUM S S,et al.2005.Effect of lamivudine therapy on theserum covalently closed-circular(ccc)DNA of chronic hepatitis B infection.AmJ Gastroenterol[J],100:1099-1103.)。而且，血清cccDNA含量与肝组织的cccDNA含量具有很好的相关性(WONG D K,YUEN M F,YUAN H,et al.2004.Quantitation of covalentlyclosed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis Bpatients.Hepatology[J],40:727-737.)，证实血清cccDNA可以反应肝组织内cccDNA的含量。更重要的是，血清样本不仅易于获得、创伤性小，而且是匀相检测、结果稳定，可广泛应用于临床检测。相对于血清标本，目前临床推行的肝脏穿刺样本取材创伤性大，患者依从性差，对技术要求高，而且cccDNA在肝细胞内分布不均一，部分肝细胞中不含有cccDNA，部分肝细胞中含有大量的cccDNA，不同的取材部位可能导致检测结果不一致。
HBV病毒的rcDNA与cccDNA的序列高度同源，特异性地检测cccDNA仍是一个亟待解决的难题。Southern blot被认为是cccDNA检测的金标准，虽可以有效的区分cccDNA和rcDNA，但是由于其灵敏度低、所需样本量大，不适用于临床标本检测(NASSAL M 2015.HBVcccDNA:viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronichepatitis B.Gut[J],64:1972-1984)。近年来，针对rcDNA和cccDNA的结构不同，设计跨缺口的引物，通过PCR方法检测cccDNA，但是由于肝细胞内rcDNA含量较cccDNA高近1000倍，且序列结构类似，存在假阳性结果。
目前用于cccDNA检测的方法有免疫印迹方法(Southern Blot)和滚环扩增联合荧光定量PCR(RCA-qPCR)方法，这两种方法均存在检测灵敏度低，耗时长(>24小时)等不足，而且只适用于培养的肝细胞或肝组织样本，无法定量检测人体血清cccDNA含量，因此其临床应用受限。微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)是新一代的PCR技术，它能够不依靠标准曲线而达到绝对定量。ddPCR的主要原理是通过对反应液的有限稀释，将包含PCR反应体系的反应液制备成～20000个油包水的独立小微滴，这些小微滴之间彼此独立进行PCR反应，微滴阅读器检测每个小微滴中的荧光信号值，并给出阴性和阳性微滴结果，随后软件采用泊松分布原理，通过阳性微滴数和总微滴数来计算初始反应液中的靶分子浓度和拷贝数(BELGRADER P,TANNER S C,REGAN J F,et al.2013.Droplet digital PCRmeasurement of HER2 copy number alteration in formalin-fixed paraffin-embedded breast carcinoma tissue.Clin Chem[J],59:991-994.)。近些年来，ddPCR由于其极高灵敏度和特异度，越来越多地被应用于实验研究和临床实践，尤其是痕量核酸的检测，如病毒核酸、循环肿瘤DNA等低拷贝数样本的检测(RUELLE J,YFANTIS V,DUQUENNE A,et al.2014.Validation of an ultrasensitive digital droplet PCR assay for HIV-2plasma RNA quantification.J Int AIDS Soc[J],17:19675 WAN J C M,MASSIE C,GARCIA-CORBACHO J,et al.2017.Liquid biopsies come of age:towardsimplementation of circulating tumour DNA.Nat Rev Cancer[J],17:223-238；)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种用于临床定量检测HBV cccDNA含量的微滴式数字PCR(ddPCR)方法。基于该方法，本发明的目的还在于提供实施该方法的试剂盒(HBV cccDNA检测ddPCR试剂盒)。本发明的另一目的在于提供一种用于肝癌诊断的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于定量检测HBV cccDNA的ddPCR方法，包括如下步骤：提取待测样本DNA；应用PSAD(Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase,PSAD)酶消化一部分样本DNA；使用cccDNA引物对和cccDNA-probe探针对消化后的样本DNA进行ddPCR扩增，使用管家基因的引物对和探针对未经PSAD酶消化的样本DNA进行ddPCR扩增；对ddPCR产物进行微滴荧光信号分析扫描；根据微滴荧光信号分析扫描结果定量HBV cccDNA，并以管家基因进行标化。
其中，cccDNA引物对用于定量检测HBV cccDNA含量，为提高cccDNA扩增的特异性，针对HBV直接重复序列(DR1、DR2)位点，设计跨HBV rcDNA双缺口的cccDNA引物对，以及相应的荧光探针：
cccDNA-F：5’-TTCTCCGTCTGCCGTTCC-3’，
cccDNA-R：5’-CACAGCTTGGAGGCTTGA-3’，
cccDNA-probe：5’-荧光基团-CACCAAATATTGCCCAAGGT-淬灭基团-3’；
所述的管家基因优选为β-actin基因，β-actin引物对和β-actin-probe探针用于定量检测管家基因β-actin含量，其序列为：
β-actin-F：5’-CCTCGCTGTCCACCTTCCA-3’，
β-actin-R：5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，
β-actin-probe：5’-荧光基团-AGATGAGATTGGCATGGCTTT-淬灭基团-3’。
上述引物通过如下方法设计得到：首先采用Primer Premier 5.0软件，针对HBV基因组序列，以跨rcDNA双缺口DR1、DR2设计cccDNA引物和探针；针对β-actin基因序列设计β-actin引物和探针。然后，通过NCBI BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行比对。最后，通过反复试验筛选和验证，得到扩增效率高、特异性好的引物和探针。
一种HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒，包含上述cccDNA引物对和cccDNA-probe探针，以及管家基因的引物对和探针，优选为上述β-actin引物对和β-actin-probe探针。
所述的试剂盒还包含cccDNA阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为不含cccDNA的pMD18-T空白质粒，阳性质控品为插入有cccDNA片段的pMD18-T阳性质粒。所述的试剂盒还包含ddPCR试剂(2×ddPCR Supermix for Probes)，PSAD酶(Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase)消化试剂(10U/μL PSAD酶，10×PSAD缓冲液，ATP)和无菌水等。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本DNA；PSAD酶对样本DNA进行消化；配制ddPCR反应体系，制备油包水微滴；对微滴进行ddPCR扩增；对ddPCR产物进行微滴荧光信号分析扫描。
所述PSAD酶对样本DNA进行消化的体系优选为：PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL。消化的条件优选为：37℃60min；70℃30min。
所述的ddPCR反应体系优选为：ddPCR Supermix for Probes(2×)10μL，上游引物(F)1μL，下游引物(R)1μL，探针1μL，ddH2O 2μL，DNA样本5μL。
所述的ddPCR反应的条件优选为：95℃5min；94℃30s，60℃1min，45cycles；98℃10min。
本发明的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒可以分为检测系统和监控系统两个部分。检测系统包括上述2种引物对和相应探针，可由其中的任意一种组合而成。监控系统则包括：①阴性质控品，不含cccDNA的pMD18-T空白质粒。正常情况下，所有阴性质控品均无cccDNA检出，若微滴扫描中该孔出现阳性微滴，则表明加样过程中存在污染。②阳性质控品，包含有cccDNA目的片段的pMD18-T阳性质粒；正常情况下，阳性质控品应出现阳性微滴而阴性质控品不出现阳性微滴，可作为判断阳性的标准；若阳性质控品不出现阳性微滴则说明实验失败。
一种用于肝癌诊断的试剂盒，包含上述HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒中的试剂和定量检测HBV DNA拷贝数的试剂。
本发明提供的试剂盒具有如下优点：①检测灵敏度高，特异性强，可以检测单拷贝cccDNA，极大提升了现有方法的灵敏度；②小反应体系(20μL)，标本和试剂用量少；③采用检测样本为DNA，来源丰富，可支持单细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织、穿刺组织、血清等多种来源的标本；④反应迅速，4小时即可获得实验结果，便于临床大样本处理；⑤检测方法高通量(96孔板)，适于临床大样本。试验表明，本发明提供的ddPCR方法灵敏度高、特异性好(图1、图2)，可快速定量检测多种临床样本中cccDNA的含量(图3、图4、图5、图6)，联合血清HBVDNA拷贝数，可实现肝癌的早期诊断(图7)。本发明为临床患者的多种标本来源的cccDNA定量检测提供了一种新的高灵敏度方法和试剂盒，可用于临床指导乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、HBV介导的肝癌和肝移植病人的抗病毒治疗，评价药物疗效，以及肝癌的早期诊断。
附图说明
图1是实施例1ddPCR检测cccDNA阳性质控品的结果及标准曲线。阳性质控品稀释后利用试剂盒进行检测，并计算标准曲线。左图：X轴为微滴总数，Y轴为荧光信号强度；水平实线(紫色线)为荧光信号阈值(1176)；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴；F10、F08、F05、F03、E04、D09为样本号。右图：cccDNA阳性质控品采用10倍浓度倍比稀释后ddPCR检测结果所得标准曲线，X轴为实际检测拷贝数，Y轴为理论拷贝数；结果显示本发明试剂盒灵敏度高，可检测出1拷贝以上的样本。
图2是实施例2ddPCR特异性检测cccDNA的示意图及结果图。图A所示为cccDNA引物对及rcDNA引物扩增的靶基因片段区域，图B所示为PSAD酶对HepG2.2.15细胞DNA消化前后选择性引物和非选择性引物扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，图C为PSAD酶对临床血清样本DNA消化前后选择性引物(cccDNA引物对)和非选择性引物(rcDNA引物对)扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。结果显示PSAD酶消化前后cccDNA引物对的PCR产物含量没有改变(图B左，图C左)，表明PSAD酶对cccDNA无作用；然而，rcDNA引物对的PCR产物经PSAD酶消化后显著减少(图B右，图C右)，证实PSAD酶可以有效的消化rcDNA，提高检测结果特异性。
图3是实施例3ddPCR检测单个HepG2.2.15细胞cccDNA含量结果。X轴为微滴总数，Y轴为荧光信号强度；水平实线(紫色线)为荧光信号阈值，β-actin的阈值为712，cccDNA的阈值为3989；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴。图A为实验的流程图，图B为未经PSAD酶消化的HepG2.2.15细胞DNA样本的管家基因β-actin检测结果，图C为经过PSAD酶消化后的HepG2.2.15细胞DNA样本的cccDNA检测结果。
图4是实施例4ddPCR检测临床标本石蜡包埋组织cccDNA含量结果。X轴为微滴总数，Y轴为荧光信号强度；水平实线(紫色线)为荧光信号阈值(3895)；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴。G03、B06、D04、G07、H07为样本号，G07、H07分别是阳性对照和阴性对照检测结果。
图5是实施例5ddPCR检测临床标本血清cccDNA含量结果。X轴为微滴总数，Y轴为荧光信号强度；水平实线(紫色线)为荧光信号阈值(3490)；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴。C11、B04、B09、G11、H11为样本号，G11、H11分别是阳性对照和阴性对照检测结果。
图6是实施例6ddPCR检测临床标本肝脏穿刺组织cccDNA含量结果。X轴为微滴总数，Y轴为荧光信号强度；水平实线(紫色线)为荧光信号阈值(3666)；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴。D07、B07、F07、G07、H07为样本号，G07、H07分别是阳性对照和阴性对照检测结果。
图7是实施例8ROC曲线分析cccDNA和HBV DNA诊断肝细胞肝癌的效能。cccDNA+HBVDNA的曲线下面积(AUC)为0.847(95％CI：0.759-0.935，p<0.001)，灵敏度为74.5％，特异度为93.7％。诊断肝细胞肝癌的效能高于单独应用传统肝癌血清标志物AFP的检测能力(AUC：0.585，95％CI：0.468-0.701，p＝0.161，灵敏度：63.5％，特异度：58.5％)。此外，应用cccDNA+HBV DNA+AFP诊断肝细胞肝癌，ROC曲线显示其AUC(0.829，95％CI：0.735-0.923，p<0.001)较cccDNA+HBV-DNA略低，灵敏度为84.3％，特异度为75.0％。结果表明联合检测血清cccDNA+HBV DNA具有良好的早期诊断肝细胞肝癌的效能。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
一种HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒，通过联合应用选择性ddPCR技术和PSAD酶消化特异性对HBV cccDNA进行定量检测，包含cccDNA引物对和cccDNA-probe探针，以及β-actin引物对和β-actin-probe探针。还包含cccDNA阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为不含cccDNA的pMD18-T空白质粒，阳性质控品为插入有cccDNA片段的pMD18-T阳性质粒。所述的试剂盒还包含ddPCR试剂(2×ddPCR Supermix for Probes，Bio-Rad，USA)，PSAD酶消化试剂(10U/μL PSAD酶(Epicentre，USA)、10×PSAD缓冲液、ATP)和无菌水等。
其中，cccDNA引物对和cccDNA-probe探针用于定量检测HBV cccDNA含量，其序列：
cccDNA-F：5’-TTCTCCGTCTGCCGTTCC-3’，
cccDNA-R：5’-CACAGCTTGGAGGCTTGA-3’，
cccDNA-probe：5’-FAM-CACCAAATATTGCCCAAGGT-TAMRA-3’；
β-actin引物对和β-actin-probe探针用于定量检测管家基因β-actin含量，其序列为：
β-actin-F：5’-CCTCGCTGTCCACCTTCCA-3’，
β-actin-R：5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，
β-actin-probe：5’-FAM-AGATGAGATTGGCATGGCTTT-TAMRA-3’。
实施例1
ddPCR检测cccDNA阳性质控品
(1)PSAD酶消化：取试剂盒中的阳性质控品，利用ddH2O进行10倍梯度稀释后，PSAD酶消化，反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。
(2)ddPCR反应体系配制：将PSAD消化后的DNA样本，按照如下表1所示体系配制ddPCR体系进行微滴发生。
表1 ddPCR反应体系
(3)制备微滴：将配制好的ddPCR反应液，转入DG8微滴发生卡中，每孔加70μL微滴发生油(Bio-Rad,USA)，将微滴发生卡放入微滴发生器中，制备微滴。
(4)ddPCR扩增：将制备好的微滴加入96孔PCR反应板中，并用铝膜热封(180℃，5sec)，于Bio-Rad T100 PCR仪中进行ddPCR扩增。为了保证每个微滴的稳定性，样本的升温速率设定不高于2℃/S，反应程序如下表2所示：
表2 ddPCR扩增
(5)微滴阅读和结果计算分析：待扩增完成后，将96孔板小心放入配套的微滴阅读器中，以绝对定量(Absolute quantification,ABS)模式对样本中靶基因进行定量，QuantaSoft软件利用泊松分布原理，分析计算阳性微滴和阴性微滴数，得到靶基因的拷贝数。根据实际检测结果和理论计算结果制备标准曲线。如图1所示，ddPCR方法提供了高灵敏度的检测方法，对cccDNA的检测限可达到1copy。
实施例2
ddPCR特异性检测cccDNA
(1)取HepG2.2.15细胞DNA和肝炎患者血清DNA样本两份。
(2)cccDNA检测特异性验证：取5μL待测DNA样本，经过PSAD酶消化后用于cccDNA和rcDNA检测；另取5μL待测DNA样本直接扩增检测cccDNA和rcDNA。PSAD酶消化反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。
rcDNA检测引物对为：rcDNA-F，5’-CACTCTATGGAAGGCGGGTA-3’；rcDNA-R，5’-TGCTCCAGCTCCTACCTTGT-3’。
cccDNA和rcDNA检测反应体系如下表3所示：
表3 cccDNA和rcDNA检测反应体系
PCR扩增反应条件如表4所示：
表4 PCR扩增反应
(3)将步骤(2)的PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳，观察PSAD酶对rcDNA的消化结果。如图2B左和图2C左所示，PSAD酶消化前后cccDNA PCR产物含量没有改变，而消化后rcDNAPCR产物(图2B右和图2C右)显著下降，表明PSAD酶可以特异性消化rcDNA，而对cccDNA无影响。
实施例3
ddPCR检测单个HepG2.2.15细胞cccDNA含量
(1)收集细胞：当培养瓶中细胞覆盖率达到70％～80％时，对细胞进行消化收集。弃培养液，加入1mL PBS洗涤细胞2次，加入0.25％胰酶溶液1mL，室温消化3分钟，弃去胰酶溶液，加入含有血清的培养基1mL终止消化，轻柔吹打，收集细胞至1.5mL EP管，1000rpm离心5min。弃去上清液，用PBS溶液重悬细胞，将浓度调整为104细胞/mL。
(2)获取单个细胞并裂解：吸取10μL细胞悬液于TransferMan NK2的载物台上，利用CellTram显微注射仪和VacuTip吸针，分别挑取1、2、4、8个细胞放入不同的PCR管中，并设置4个平行管，2管供cccDNA检测，2管供β-actin检测。随后将PCR管于90℃孵育10min，加入1μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)后，58℃孵育消化1h，再放于95℃金属浴中15min以灭活蛋白酶K。离心后上清即为待测DNA样本。
(3)待测DNA样本前处理：用于cccDNA定量检测的待测DNA样本，须经PSAD酶消化，反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。用于β-actin定量检测的待测DNA样本则不需要经过PSAD酶消化，β-actin拷贝数用于计算肝细胞数。
(4)ddPCR反应体系制备：按照如下表5所示配制ddPCR反应体系，其中PSAD酶消化后DNA用于cccDNA定量，未经PSAD酶消化的DNA样本用于β-actin定量。
表5 ddPCR反应体系
(5)制备微滴：将配制好的ddPCR反应液，转入DG8微滴发生卡中，每孔加70μL微滴发生油，将微滴发生卡放入微滴发生器中，制备微滴。
(6)ddPCR扩增：将制备好的微滴加入96孔PCR反应板中，并用铝膜热封(180℃，5sec)，于Bio-Rad T100 PCR仪中进行扩增。为了保证每个微滴的稳定性，样本的升温速率设定不高于2℃/S，反应程序同上述表2。
(7)微滴阅读和结果计算分析：待扩增完成后，将96孔板小心放入配套的微滴阅读器中，以绝对定量(Absolute quantification,ABS)模式对样本中靶基因进行定量，QuantaSoft软件利用泊松分布原理，分析计算阳性微滴和阴性微滴数，得到靶基因的拷贝数。为保证实验结果的准确性，在实验过程中，每孔制备微滴的数目需超过10000个。阳性对照孔中阳性微滴数需要超过10个，阴性对照孔中不出现阳性微滴，表明实验成功。随后对检测样本进行判读，将cccDNA拷贝数定义为A，β-actin拷贝数定义为B，样本cccDNA含量计算公式为(A*DNA样本稀释倍数)/(B/2)，单位为copy/cell。公式中的2是指每个细胞中含有2个拷贝的β-actin。
(8)检测结果：ddPCR检测的1、2、4、8个HepG2.2.15细胞中的cccDNA含量如表6所示，β-actin拷贝数与细胞数相吻合。
表6单个HepG2.2.15细胞cccDNA检测结果
实施例4
ddPCR检测临床标本石蜡包埋组织cccDNA含量
(1)组织切片：将组织蜡块标本切成5μm切片，每例切5片，装入1.5mL EP管。每切1例将切片刀换一个位置，待切片刀位置更换完毕后，用1M NaOH和流水充分洗涤，擦干后继续使用，以防交叉污染。
(2)核酸提取：采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒(QIAGEN公司)提取DNA(此步骤可以选用Takara等公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒)，按照说明书操作，以100μL ddH2O溶解DNA样本。
(3)待测DNA样本前处理：用于cccDNA定量检测的待测DNA样本，须经PSAD酶消化，反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。用于β-actin定量检测的待测DNA样本则不需要经过PSAD酶消化，β-actin拷贝数用于计算肝细胞数。
(4)ddPCR反应体系制备：按照如下表7所示配制ddPCR体系，其中PSAD酶消化后DNA用于cccDNA定量，未经PSAD酶消化的DNA样本用于β-actin定量。
表7 ddPCR反应体系
(5)制备微滴：将配制好的ddPCR反应液，转入DG8微滴发生卡中，每孔加70μL微滴发生油，将微滴发生卡放入微滴发生器中，制备微滴。
(6)ddPCR扩增：将制备好的微滴加入96孔PCR反应板中，并用铝膜热封(180℃，5sec)，于Bio-Rad T100 PCR仪中进行扩增。为了保证每个微滴的稳定性，样本的升温速率设定不高于2℃/S，反应程序同上述表2。
(7)微滴阅读和结果计算分析：待扩增完成后，将96孔板小心放入配套的微滴阅读器中，以绝对定量(Absolute quantification,ABS)模式对样本中靶基因进行定量，QuantaSoft软件利用泊松分布原理，分析计算阳性微滴和阴性微滴数，得到靶基因的拷贝数。为保证实验结果的准确性，在实验过程中，每孔制备微滴的数目需超过10000个。阳性对照孔中阳性微滴数需要超过10个，阴性对照孔中不出现阳性微滴，表明实验成功。随后对检测样本进行判读，将cccDNA拷贝数定义为A，β-actin拷贝数定义为B，样本cccDNA含量计算公式为(A*DNA样本稀释倍数)/(B/2)，单位为copy/cell。公式中的2是指每个细胞中含有2个拷贝的β-actin。
(8)检测结果：ddPCR检测21例临床FFPE肝组织的cccDNA含量结果如表8所示。
表8 FFPE肝组织cccDNA检测结果
实施例5
ddPCR检测临床标本血清cccDNA含量
(1)分离血清：抽取患者的新鲜静脉血，不加入抗凝剂放于37℃孵育1小时，室温离心(3500g，12min)，将上层血清转至新的EP管中，再次4℃离心去除细胞碎片(13500g，12min)，取离心后的上层新鲜血清200μL进行核酸提取。
(2)核酸提取：采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN公司)提取DNA(此步骤可以选用Takara等公司的血清核酸提取试剂盒)，按照说明书操作，最后以50μLddH2O溶解DNA。
(3)待测DNA样本前处理：取5μL待测DNA样本进行PSAD酶消化，用于cccDNA定量检测，反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。
(4)ddPCR反应体系制备：将消化后的DNA样本按照如下表9所示，配制ddPCR反应体系，采用cccDNA引物和探针进行cccDNA定量。
表9 ddPCR反应体系
(5)制备微滴：将配制好的ddPCR反应液，转入DG8微滴发生卡中，每孔加70μL微滴发生油，将微滴发生卡放入微滴发生器中，制备微滴。
(6)ddPCR扩增：将制备好的微滴加入96孔PCR反应板中，并用铝膜热封(180℃，5sec)，于Bio-Rad T100 PCR仪中进行扩增。为了保证每个微滴的稳定性，样本的升温速率设定不高于2℃/S，反应程序同上述表2。
(7)微滴阅读和结果计算分析：待扩增完成后，将96孔板小心放入配套的微滴阅读器中，以绝对定量(Absolute quantification,ABS)模式对样本中靶基因进行定量，QuantaSoft软件利用泊松分布原理，分析计算阳性微滴和阴性微滴数，得到靶基因的拷贝数。为保证实验结果的准确性，在实验过程中，每孔制备微滴的数目需超过10000个。阳性对照孔中阳性微滴数需要超过10个，阴性对照孔中不出现阳性微滴，表明实验成功。随后对检测样本进行判读，将血清样本cccDNA拷贝数定义为C，则原始血清样本的cccDNA定量结果为2000*C(计算公式为(C*20/DNA模板体积*血清DNA样本稀释倍数)*1000)，单位为copy/mL血清。公式中的20为ddPCR反应总体积，1000为μL与mL之间的换算系数。
(8)检测结果：ddPCR检测147份临床血清cccDNA含量结果如表10所示。
表10临床血清样本cccDNA含量检测结果
实施例6
ddPCR检测临床标本肝脏穿刺组织cccDNA含量
(1)核酸提取：将肝脏穿刺样本小心取出，利用QIAgen DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒(QIAGEN)提取肝脏组织DNA(此步骤可采用其他公司试剂盒提取组织DNA)，按照说明书操作。
(2)待测DNA样本前处理：用于cccDNA定量检测的待测DNA样本，须经PSAD酶消化，反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。用于β-actin定量检测的待测DNA样本则不需要经过PSAD酶消化，β-actin拷贝数用于计算肝细胞数。
(3)ddPCR反应体系制备：按照如下表11所示，配制ddPCR体系，其中PSAD酶消化后DNA用于cccDNA定量，未经PSAD酶消化的DNA样本用于β-actin定量。
表11 ddPCR反应体系
(4)制备微滴：将配制好的ddPCR反应液，转入DG8微滴发生卡中，每孔加70μL微滴发生油，将微滴发生卡放入微滴发生器中，制备微滴。
(5)ddPCR扩增：将制备好的微滴加入96孔PCR反应板中，并用铝膜热封(180℃，5sec)，于Bio-Rad T100 PCR仪中进行扩增。为了保证每个微滴的稳定性，样本的升温速率设定不高于2℃/S，反应程序同上述表2。
(6)微滴阅读和结果计算分析：待扩增完成后，将96孔板小心放入配套的微滴阅读器中，以绝对定量(Absolute quantification,ABS)模式对样本中靶基因进行定量，QuantaSoft软件利用泊松分布原理，分析计算阳性微滴和阴性微滴数，得到靶基因的拷贝数。为保证实验结果的准确性，在实验过程中，每孔制备微滴的数目需超过10000个。阳性对照孔中阳性微滴数需要超过10个，阴性对照孔中不出现阳性微滴，表明实验成功。随后对检测样本进行判读，将cccDNA拷贝数定义为A，β-actin拷贝数定义为B，样本cccDNA含量计算公式为(A*DNA样本稀释倍数)/(B/2)，单位为copy/cell。公式中的2是指每个细胞中含有2个拷贝的β-actin。
(7)检测结果：ddPCR检测8个临床肝穿组织的cccDNA含量结果如表12所示。
表12肝穿组织cccDNA检测结果
实施例7
ddPCR和qPCR检测临床标本石蜡包埋组织cccDNA含量比较
(1)组织切片：将组织蜡块标本切成5μm切片，每例切5片，装入1.5mL EP管。每切1例将切片刀换一个位置，待切片刀位置更换完毕后，用1M NaOH和流水充分洗涤，擦干后继续使用，以防交叉污染。
(2)核酸提取：采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒(QIAGEN公司)提取DNA(此步骤可以选用Takara等公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒)，按照说明书操作，以100μL ddH2O溶解DNA样本。
(3)待测DNA样本前处理：用于cccDNA定量检测的待测DNA样本，须经PSAD酶消化，反应体系为PSAD酶1μL，10×PSAD缓冲液1μL，ATP溶液2μL，DNA样本5μL和ddH2O 1μL；反应条件为37℃60min，70℃30min。用于β-actin定量检测的待测DNA样本则不需要经过PSAD酶消化，β-actin拷贝数用于计算肝细胞数。
(4)ddPCR/q-PCR反应体系制备：
按照如下表13所示，配制ddPCR反应体系，其中PSAD酶消化后DNA用于cccDNA定量，未经PSAD酶消化的DNA样本用于β-actin定量。
表13 ddPCR反应体系
按照如下表14所示，配制qPCR反应体系，其中PSAD酶消化后DNA用于cccDNA定量，未经PSAD酶消化的DNA样本用于β-actin定量。
表14 qPCR反应体系
(5)制备微滴：将配制好的ddPCR反应液，转入DG8微滴发生卡中，每孔加70μL微滴发生油，将微滴发生卡放入微滴发生器中，制备微滴。
(6)ddPCR扩增：将制备好的微滴加入96孔PCR反应板中，并用铝膜热封(180℃，5sec)，于Bio-Rad T100 PCR仪中进行扩增。为了保证每个微滴的稳定性，样本的升温速率设定不高于2℃/S，反应程序同上述表2。
(7)微滴阅读和结果计算分析：待扩增完成后，将96孔板小心放入配套的微滴阅读器中，以绝对定量(Absolute quantification,ABS)模式对样本中靶基因进行定量，QuantaSoft软件利用泊松分布原理，分析计算阳性微滴和阴性微滴数，得到靶基因的拷贝数。为保证实验结果的准确性，在实验过程中，每孔制备微滴的数目需超过10000个。阳性对照孔中阳性微滴数需要超过10个，阴性对照孔中不出现阳性微滴，表明实验成功。随后对检测样本进行判读，将cccDNA拷贝数定义为A，β-actin拷贝数定义为B，样本cccDNA含量计算公式为(A*DNA样本稀释倍数)/(B/2)，单位为copy/cell。公式中的2是指每个细胞中含有2个拷贝的β-actin。
(8)qPCR检测cccDNA含量：将配制好的qPCR体系加入qPCR管中，于Bio-RadC1000qPCR仪中进行扩增。反应程序如下表15所示：
表15 qPCR扩增
待扩增完成后，通过标准曲线对靶基因进行定量，得到靶基因的拷贝数。随后对检测样本进行判读，将cccDNA拷贝数定义为A，β-actin拷贝数定义为B，样本cccDNA含量计算公式为(A*DNA样本稀释倍数)/(B/2)，单位为copy/cell。公式中的2是指每个细胞中含有2个拷贝的β-actin。
(9)检测结果：ddPCR检测21例临床FFPE肝组织的cccDNA含量结果如表16所示。ddPCR检测阳性率(95.2％)显著高于qPCR方法(57.1％)。
表16 FFPE肝组织cccDNA检测结果
实施例8
ddPCR联合检测血清cccDNA和HBV-DNA可早期诊断肝癌
(1)收集慢性乙肝患者和肝癌患者新鲜血清，按照实施例5中的方法，检测血清cccDNA含量；同时应用罗氏COBAS HBV定量检测试剂盒检测血清的HBV DNA拷贝数，雅培i4000化学发光分析仪检测肝癌血清标志物AFP含量。检测结果如表17所示：
表17乙肝患者和肝癌患者血清cccDNA、HBV DNA拷贝数和AFP检测结果
(2)利用ROC曲线评价血清cccDNA含量联合血清HBV DNA拷贝数对肝癌早期诊断的特异性和灵敏度。
ROC曲线分析结果如图7所示，应用血清cccDNA+HBV DNA进行肝癌的早期诊断，曲线下面积(AUC)为0.847，95％可信区间：0.759-0.935，p<0.001，具有较高的灵敏度(74.5％)和特异度(93.7％)；其检测效果优于单独AFP作为HCC的诊断指标，单独应用AFP进行肝癌的早期诊断，AUC为0.585，95％可信区间：0.468-0.701，p＝0.162，灵敏度为63.5％，特异度为58.5％。此外，应用cccDNA+HBV-DNA+AFP诊断早期肝癌，AUC略低于cccDNA+HBV-DNA(0.829)，95％可信区间：0.735-0.923，p<0.001，灵敏度为84.3％，特异度为75.0％；应用HBV-DNA+AFP诊断早期肝癌，AUC低于cccDNA+HBV-DNA(0.771)，95％可信区间：0.671-0.870，p<0.001，灵敏度为90.4％，特异度为61.0％。
ROC曲线分析表明，将血清cccDNA的cut-off值设为211.9copy/mL，诊断肝癌的真阳性率为82.7％，明显优于目前临床使用的血清标志物AFP。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR方法及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctccgtct gccgttcc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacagcttgg aggcttga 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccaaatat tgcccaaggt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctcgctgtc caccttcca 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaccttcac cgttccagtt tt 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agatgagatt ggcatggctt t 21
Claims (6)
1.检测血清cccDNA含量和血清HBV DNA拷贝数的试剂在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于：血清cccDNA含量的cut-off值为211.9copy/mL；
检测血清cccDNA含量的试剂包含用于扩增HBV cccDNA的cccDNA引物对和探针，以及用于扩增管家基因的引物对和探针；
其中，用于扩增HBV cccDNA的cccDNA引物对和探针为：
cccDNA-F：5’-TTCTCCGTCTGCCGTTCC-3’，
cccDNA-R：5’-CACAGCTTGGAGGCTTGA-3’，
cccDNA-probe：5’-荧光基团-CACCAAATATTGCCCAAGGT-淬灭基团-3’。
2.一种肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于：包含HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒和HBV定量检测试剂盒；
所述的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒包含用于扩增HBV cccDNA的cccDNA引物对和探针，以及用于扩增管家基因的引物对和探针；
其中，用于扩增HBV cccDNA的cccDNA引物对和探针为：
cccDNA-F：5’-TTCTCCGTCTGCCGTTCC-3’，
cccDNA-R：5’-CACAGCTTGGAGGCTTGA-3’，
cccDNA-probe：5’-荧光基团-CACCAAATATTGCCCAAGGT-淬灭基团-3’；
所述的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒的cut-off值为211.9copy/mL；
所述的HBV定量检测试剂盒可检测HBV DNA拷贝数。
3.根据权利要求2所述的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒中的管家基因为β-actin基因，用于扩增β-actin基因的引物对和探针为：
β-actin-F：5’-CCTCGCTGTCCACCTTCCA-3’，
β-actin-R：5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，
β-actin-probe：5’-荧光基团-AGATGAGATTGGCATGGCTTT-淬灭基团-3’。
4.根据权利要求2所述的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒包含阴性质控品和阳性质控品。
5.根据权利要求4所述的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述的阴性质控品为pMD18-T空载质粒，所述的阳性质控品为插入有cccDNA片段的pMD18-T阳性质粒。
6.根据权利要求2所述的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于：所述的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒包含ddPCR试剂和PSAD酶消化试剂。
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Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| 乙型肝炎肝硬化患者HBV DNA和肿瘤标志物相关性分析;李亚威等;《广东医学》;20161227;第37卷(第23期);第3535-3537页 * |
| 乙肝患者血清HBV cccDNA 的临床意义;朱锦宏等;《实用医学杂志》;20131231;第29卷(第3期);参见第395页摘要和第397页结论部分 * |
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