CN108283631B - 一种肠道病毒的抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肠道病毒的抑制剂及其应用，本发明涉及一类具有如下分子式I所示结构的化合物NZY602，及NZY602类似物或其药学上可接受的盐用于体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒。实验表明化合物NZY602可抑制肠道病毒3C蛋白活性，并可有效抑制肠道病毒的生长或繁殖。

Description

一种肠道病毒的抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种肠道病毒的抑制剂及其应用。

背景技术

手足口病病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)。手足口病病毒呈20面体结构，直径大约24-30nm，为裸露病毒，遗传物质为单链的核糖核酸，对各种抗生素、常见抗病毒药、去污剂有抵抗作用。不同肠道病毒可引起相同的症状，同一种病毒可引起不同临床表现。肠道病毒多见隐性感染，可引起轻微上感、腹部不适和腹泻等症状。偶尔侵犯中枢神经系统，引起弛缓型麻痹。

肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16(CA16)、柯萨奇病毒A6(CA6)以及柯萨奇病毒A10(CA10)等是引起亚太地区婴幼儿手足口病的主要病原体。中国大陆地区仅2015到2016年两年的手足口病病例就高达44万例，其中死亡病例324例。手足口病的常见症状包括发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，少数患儿可能会出现中枢神经系统、呼吸系统损害，引发无菌性脑膜炎、脑炎、急性驰缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别患儿容易发生死亡。在引起手足口病的若干病原体中，EV71是引起重症手足口病的主要病原体。手足口病的预防及治疗目前仍然亟待解决的公共卫生问题，虽然基于灭活病毒的EV71疫苗已经上市，但临床上依然没有治疗EV71感染的药物，因此寻找抗病毒药物迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠道病毒的抑制剂及其应用。

技术方案：

一种肠道病毒的抑制剂，所述的抑制剂选自NZY602和/或NZY602类似物；

所述的NZY602的结构式如下：

本发明所述的一种肠道病毒的抑制剂，抑制剂通过抑制病毒3C蛋白的活性来抑制所述肠道病毒的生长或繁殖。

本发明提供NZY602和/或NZY602类似物或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的应用，所述试剂或药物用于：

(i)抑制病毒的生长或繁殖；和/或

(ii)抑制病毒的3C蛋白的活性。

本发明提供NZY602和/或NZY602类似物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防肠道病毒性疾病药物中的应用；所述肠道病毒性疾病包括但不限于由肠道病毒感染引起的手足口病、无菌性脑膜炎、脑膜炎、脊髓灰质炎、急性呼吸道疾病、急性心肌炎、新生儿多器官衰竭或急性弛缓性麻痹。

作为优选方案，以上所述的肠道病毒包括人肠道病毒A、人肠道病毒B、人肠道病毒C和/或人肠道病毒D。

作为优选方案，所述药物包括但不限于口服制剂、外用制剂等。

一种体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒的方法，包括步骤：在需要处理的场所施用权利要求1所述的肠道病毒的抑制剂或其药学上可接受的盐。

作为优选方案，所述肠道病毒的抑制剂中NZY602的施用浓度为≥0.224μM，优选地，也可以为0.5μM，0.6μM，0.7μM，0.8μM，1μM。

一种复合物，所述复合物由A和B结合而成；

其中，A为NZY602和/或NZY602类似物；B为肠道病毒的3C蛋白。

一种筛选药物的方法，其特征在于，所述方法包括将待筛选药物与肠道病毒或者肠道病毒的3C蛋白接触，并检测是否形成权利要求7所述的复合物。

本发明提供一种检测肠道病毒的试剂盒，该试剂盒包括NZY602和/或NZY602类似物。NZY602和/或NZY602类似物可以与肠道病毒的3C蛋白结合进行检测。

有益效果说明：本发明提供的肠道病毒的抑制剂对3C蛋白具有明显的抑制活性，并且对EV71等病毒具有很好的杀灭活性。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为化合物NZY602对3C蛋白的半数抑制浓度(IC₅₀)的测定结果的曲线图。图中X轴表示NZY602浓度的Log值，Y轴代表NZY602对3C蛋白的抑制率，抑制率的计算如下:Inhibition％＝(V_maxctrl–V_maxNZY602)/V_maxctrl，其中V_maxctrl代表阴性对照组的最大反应速率，V_maxNZY602代表NZY602组的最大反应速率。经GraphPad Prism作图后，确定NZY602对3C蛋白的IC₅₀为10.1μM。

图2为荧光淬灭实验验证3C蛋白与NZY602的结合作用曲线图。测定不同波长下，NZY602在不同浓度时的荧光读值。其中X轴表示的是不同的波长，Y轴表示测定的荧光值RFU。图中从上之下的8条曲线代表采用浓度为0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM及80μM的不同浓度NZY602的波长吸收测试曲线，结果显示不同浓度的NZY602均在350nm波长时，有最大的RFU值。

图3图为NZY602荧光淬灭K值拟合图。在最大吸收波长下，以ΔF为Y轴，以ΔF/I为X轴作图，确定NZY602与3C的结合常数K_D值为7.99μM。其中ΔF＝F-F0，F0为在NZY602浓度为0μM时读取的荧光值，I为NZY602的浓度。

图4为NZY602细胞毒性检测及抗病毒活性检测结果曲线图。在该实验中，NZY602三倍倍比稀释八个浓度梯度，其中最高测试浓度为100μM。通过检测细胞活性，计算出NZY602的抗病毒活性及细胞毒性。图中，X轴表示NZY602的不同浓度，左Y轴表示NZY602抗病毒活性(Activity％)，右Y轴表示NZY602对RD细胞的毒性(Viability％)。通过作图，确定NZY602对EV71的半数抑制剂量(EC₅₀)为0.224μM，NZY602对RD细胞的半数毒性剂量(CC₅₀)为3.498μM。

具体实施方式

本发明通过大量实验筛选，发现化合物NZY602可以体外抑制肠道病毒的复制，下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。

本发明所述的肠道病毒：

肠道病毒(enterovirus)在分类上属于小核糖核酸(RNA)病毒科(picomaviridae)，肠道病毒的代表性种类包括(但并不限于)：

人肠道病毒A，包括21种血清型：柯萨奇病毒Coxsackievirus A2(CV-A2)，CV-A3，CV-A4，CV-A5，CV-A6，CV-A7，CV-A8，CV-A10，CV-A12，CV-A14，CV-A16；肠道病毒EnterovirusA71(EV-A71)，EV-A76，EV-A89，EV-A90，EV-A91，EV-A92，EV-A114，EV-A119，EV-A120，EV-A121。

人肠道病毒B，包括59种血清型:Coxsackievirus B1(CV-B1)，CV-B2，CV-B3，CV-B4，CV-B5，CV-B6，CV-A9；埃可病Echovirus1(E-1)，E-2，E-3，E-4，E-5，E-6，E-7，E-9，E-11，E-12，E-13，E-14，E-15，E-16，E-17，E-18，E-19，E-20，E-21，E-24，E-25，E-26，E-27，E-29，E-30，E-31，E-32，E-33；Enterovirus B69(EV-B69)，EV-B73，EV-B74，EV-B75，EV-B77，EV-B78，EV-B79，EV-B80，EV-B81，EV-B82，EV-B83，EV-B84，EV-B85，EV-B86，EV-B87，EV-B88，EV-B93，EV-B97，EV-B98，EV-B100，EV-B101，EV-B106，EV-B107，EV-B111。

人肠道病毒C，包括23种血清型：人脊髓灰质炎病毒Poliovirus1(PV-1)，PV-2，PV-3；Coxsackievirus A1(CV-A1)，CV-A11，CV-A13，CV-A17，CV-A19，CV-A20，CV-A21，CV-A22，CV-A24，EV-C95，EV-C96，EV-C99，EV-C102，EV-C104，EV-C105，EV-C109，EV-C113，EV-C116，EV-C117和EV-C118。

人肠道病毒D，包括4种血清型：EV-D68，EV-D70，EV-D94，EV-D111。

肠道病毒感染的临床表现多样，包括但不限制于脑炎、病毒性心肌炎、流行性肌痛、疱疹性咽峡炎、出疹性疾病、腹泻、手足口病甚至死亡。

本发明所述的3C蛋白：

3C蛋白在小RNA病毒的生活史中发挥着重要作用，能够切割病毒本身多聚蛋白、酶解宿主蛋白及参与病毒复制，3C蛋白的相对分子量约为22kD。

在本发明的一个优选地实施方式中，3C蛋白的氨基酸序列如下：

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro ArgGly Ser His Met Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn ValArg Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp Arg LeuAla Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp Ile Glu His Lys LeuVal Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu LeuThr Leu Ile Thr Leu Asp Thr Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile ProGlu Asn Ile Ser ThrAla Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met ProSer Met Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser GlyLys Pro Thr Gly Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala Gly Gln Cys GlyGly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly Ile His Ile Gly Gly Asn Gly ArgGln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln。

NZY602及其类似物

术语“NZY602及其类似物”包括NZY602及其类似物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

NZY602类似物优选其苯环分子结构中的氯离子、羟基和氢被其它基团取代，如烷基、烯烃、含氮基团、炔烃、羰基、酯基、醛基或芳香基团等取代。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明NZY602化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。本发明所述药学上可接受的盐也可以是阴离子与本发明活性成分上带正电荷的基团形成的盐。合适的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲基磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、苹果酸根、甲苯磺酸根、酒石酸根、富马酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、乳酸根、戊二酸根和马来酸根。类似地，可以由阳离子与本发明活性成分的带负电荷的基团(例如羧酸根)形成盐。合适的阳离子包括但不限于钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子。

施用方法：

本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：外用、口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂等。

在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物(如抗生素)联合给药。

实验实施例1：测定化合物NZY602对3C蛋白的半数抑制浓度(IC₅₀)

本实施例中，利用荧光共振能量转移技术(FRET)，测定化合物NZY602对3C蛋白的IC₅₀为10.1μM。

1.实验原理

荧光共振能量转移技术(FRET)：首先修饰多肽底物，在其两端分别加上荧光供体和受体，供体与受体光谱必须有一定的重叠，两者之间的距离在

范围时，可以发生荧光淬灭。在没有蛋白酶的切割作用时，供体荧光分子受到一定波长的光激发，发射出的荧光能量被受体特异性吸收发生荧光淬灭，当蛋白酶切割底物断裂时，多肽底物荧光供体与受体发生分离，此时可以检测到荧光，不会发生淬灭现象。本发明中采用的EV713C的荧光底物为多肽N’-Dabcyl-RTATVQGPSLDFE(Edans)-C’，这段多肽序列与EV71的2C-3A之间自切位点序列一致，其中3C蛋白切割位点是Q-G。多肽的N端连接荧光集团Dabcyl，C端连接荧光集团Edans，Dabcyl-Edans属于荧光淬灭对。在该荧光底物被EV713C蛋白切开以后，Dabcyl与Edans分离，荧光强度随多肽水解程度增加而增强。其中，该底物的激发光是340nm，发射光是500nm。

2.实验材料和方法

EV71的3C蛋白是用原核细胞大肠杆菌诱导表达的，N端带有His-tag标记。利用镍柱亲和层析法，通过咪唑浓度梯度洗脱达到蛋白分离纯化的目的。随后，利用HiTrapdesalting除去咪唑。最后，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达与纯化的情况。

荧光底物N’-Dabcyl-RTATVQGPSLDFE(Edans)-C’在大连美仑生物公司合成。

IC₅₀测定方法：

NZY602的IC50测定在96孔板中进行反应检测。首先将终浓度为8μM EV71 3C蛋白与不同浓度的NZY602(100μM、80μM、50μM、25μM、20μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM)混合，在酶活反应缓冲液中于30℃孵育30min，再加入终浓度为底物150μM的荧光多肽底物启动反应，保证反应体系为100μL。每个浓度梯度三个复孔。然后在酶标仪SpectraMax M5(温度设定为30℃)中读取反应初始10min荧光值，反应初速V即以荧光值为纵轴，反应时间为横轴，作图拟合所得直线的斜率。在速率测定的反应中，以0.1％DMSO组作为阴性对照组，通过如下公式分析化合物对EV713C的抑制活性：Inhibiton％＝(V_maxctrl–V_maxNZY602)/V_maxctrl，其中V_maxctrl代表阴性对照组的最大反应速率，V_maxNZY602代表NZY602组的最大反应速率。以抑制率为纵坐标，以NZY602的不同浓度为横坐标，利用GraphPad Prism作图确定IC₅₀。

3.实验结果

结果如图1所示，随着化合物NZY602浓度的降低，其对3C蛋白所产生的抑制率也在降低。在NZY602浓度为10.1μM时，可以抑制半数的3C蛋白活性。

实验实施例2：荧光淬灭实验验证EV713C蛋白与NZY602的结合作用

本发明在大肠杆菌BL21中表达并分离纯化获得EV71的3C蛋白，测试了NZY602与3C蛋白的结合活性。荧光淬灭实验表明，NZY602可以浓度依赖性的与3C结合。

1.实验原理

荧光淬灭技术是利用蛋白质本身氨基酸荧光性的特点来检测小分子化合物与蛋白质的相互作用的方法。大多数蛋白质分子中都有酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)等氨基酸，它们均具有荧光性，可以利用该特性来检测其与小分子之间的结合，通常只是利用荧光特性最好的Trp来研究蛋白质分子与小分子化合物之间的结合作用，EV713C蛋白活性中心有1个Trp残基，可以通过检测不同浓度的小分子化合物对3C蛋白Trp残基荧光的影响来确定小分子化合物和EV713C蛋白之间的结合。

2.实验材料及方法

荧光光谱的测定使用SpectraMax M5，取1mL样品放入厚度为1cm的石英比色杯中。激发光为280nm，波宽为5nm；波谱检测范围为300-400nm，扫描速率设定为60nm/min。具体地，在该体系中，不同浓度的NZY602(0μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM及100μM)分别与3C蛋白冰上孵育30min；然后加入1mL蛋白化合物混合液至比色杯中，黑暗平衡5min；最后在25℃读取荧光值F，以峰值为特征分析淬灭现象。根据如下公式判断小分子与蛋白结合强度：

其中ΔF＝F-F0，F0为在NZY602浓度为0μM时读取的荧光值。[I]为NZY602的浓度。以ΔF为纵轴，以ΔF/[I]为横轴，利用GraphPad Prism作图，确定NZY602与3C的结合常数。

3.实验结果

如图2所示，在波长约为350nm时候，3C蛋白与NZY602形成的复合物有最大的吸收峰。如图3所示，通过GraphPad Prism作图计算，3C蛋白与NZY602化合物结合的K_D值为7.99μM。

实验实施例3：NZY602细胞毒性测定及抗病毒活性检测

本实施例中通过检测不同处理条件下横纹肌瘤(RD)细胞活性，来确定NZY602体外抗EV71活性以及NZY602对RD细胞的毒性。

1.实验原理

检测细胞的活性主要通过CCK8细胞活力检测试剂盒完成。该试剂盒中的主要试剂为WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐))，该试剂在电子耦合试剂存在的条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原成高度水溶性的橙黄色甲度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

2.实验材料及方法

横纹肌瘤(RD)细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞培养时使用添加10％FBS,1×NEAA,2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液。检测时添加2％FBS,1×NEAA,2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液用做实验培养基。

病毒：EV71/shenzheng/12F1/09病毒株由厦门大学赠与。

CCK-8细胞活力检测试剂盒购买自Biolite公司.

测试方法：将RD细胞以3,000细胞/孔的密度种入384孔板，随后置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。将NZY602三倍倍比稀释八个浓度梯度，其中最高测试浓度为100μM，双复孔。细胞培养基中DMSO的终浓度为0.5％。随后在抗病毒活性测试孔及病毒对照孔中加入每孔100TCID50 EV71病毒稀释液。对于细胞毒性测试孔，培养基对照孔和细胞对照孔中不加病毒，加入相同体积的实验培养基。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养3天。之后使用细胞活力检测试剂盒CCK8测定每孔的细胞活力。加入CCK8前和加入CCK8孵育3h后的吸光值由酶标仪SPECTRA max 340PC(Molecular device)检测。用加入CCK8后的吸光值减去加入CCK8前的吸光值作为每孔的信号值用于化合物抗病毒活性和细胞活力计算。

NZY602抗病毒活性公式如下

细胞毒性检测公式如下

其中CPD:NZY602化合物孔的信号值

CC(Cell control):细胞对照孔信号值平均值；

VC(Virus control):病毒对照孔信号值平均值；

MC(Medium control):培养基对照孔信号值平均值；

将相关数据分别导入GraphPad Prism软件进行处理，得出化合物对应的剂量依赖性拟合曲线及对EV71病毒的半数有效抑制浓度(EC50)和半数细胞毒性浓度(CC50)。

3.实验结果

如图4所示，随着NZY602浓度的升高，EV71病毒的活性降低，最后测得NZY602对EV71病毒的半数有效抑制浓度(EC₅₀)为0.224μM。随着NZY602浓度的降低，RD细胞的活性上升，最后测得NZY602对RD细胞的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)为3.498μM。综上，NZY602的选择指数SI(CC₅₀/EC₅₀)为15。

以上实验结果表明，NZY602化合物可以结合EV71的3C蛋白，并且抑制其功能。同时NZY602化合物也可以在体外有效地抑制EV71病毒的生长和繁殖，所以NZY602可以作为一种治疗肠道病毒的药物，可以但不限于被开发为外用制剂或口服制剂等。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.NZY602或其药学上可接受的盐在制备肠道病毒EV71病毒抑制剂中的应用，所述的NZY602的结构式如下：

。

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