KR20240054338A - 시아노 화합물, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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시안그루이 지앙
예춘 쑤
레이케 창
하이시아 수
치우멍 장
웬펭 짜오
웨이주안 샹
징샨 셴
젱푸 샤오
후아리앙 지앙
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상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈
우한 인스티튜트 오브 바이럴러지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언스
하이난 심시어 파마슈티컬 씨오., 엘티디.
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Abstract

식 I로 표시되는 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 코로나바이러스 및/또는 피코르나바이러스 감염으로 인한 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 이의 용도를 제공한다.

I

Description

시아노 화합물, 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 2021년 9월 30일자로 중국지식재산권국에 제출된 특허출원 번호가 202111168232.4이고, 발명의 명칭이 “시아노 화합물, 이의 제조 방법 및 용도” 및 2022년 8월 15일자로 중국지식재산권국에 제출된 특허출원 번호가 202210973184.4이며, 발명의 명칭이 “시아노 화합물, 이의 제조 방법 및 용도”인 중국 특허 출원의 우선권을 주장한다. 상기 선출원의 모든 내용은 참조로서 본 발명에 원용된다.
본 발명은 약화학 및 화학 합성분야에 속하고, 구체적으로, 본 발명은 시아노 화합물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
코로나바이러스는 단일 가닥 양성 RNA 바이러스로, 일부 코로나바이러스는 사람들 사이에서 널리 퍼지고 심각한 증상을 유발할 수 있다. 현재 인간을 감염시킬 수 있는 코로나바이러스는 7가지로 알려져있고, 각각 HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2이다. 코로나바이러스의 대부분의 기능성 단백질은 ORF1ab 유전자에 의해 코딩되는데, 먼저 다단백질로 번역된 후, 다시 3CL 프로테아제 및 PL프로테아제에 의해 다수의 활성 단백질로 절단되므로, 3CL 프로테아제 활성을 억제하면 바이러스의 복제를 효과적으로 억제할 수 있다. 상이한 코로나바이러스 3CL 프로테아제는 구조적 상동성이 높으므로, 3CL 프로테아제 억제제는 광범위한 항코로나바이러스 활성을 갖는다.
코로나바이러스 외에도, 3CL 프로테아제는 피코르나바이러스에 의해 코딩된 폴리프로테아제의 가수분해에서도 중요한 역할을 하므로, 3CL 프로테아제 억제제는 피코르나바이러스 복제를 효과적으로 억제할 수 있다. 엔테로바이러스 71은 수족구병을 일으키는 흔한 바이러스 중 하나인 피코르나바이러스로, 뇌수막염, 뇌간뇌염, 심근염 등 여러가지 질환을 일으킬 수도 있다. 최근 몇년 동안, 엔테로바이러스 71은 영유아 사이에서 여려 차례 발생하였고, 아직 임상적으로 효과적인 치료 약물이 부족한 실정이다.
따라서, 여전히 코로나바이러스/엔테로바이러스 71 등을 포함하는 RNA/피코르나바이러스를 억제할 수 있는 화합물이 필요하다.
발명자는 3CL 프로테아제의 결정 구조를 기반으로, 코로나바이러스 및/또는 피코르나바이러스의 3CL 프로테아제 활성을 효과적으로 억제할 수 있고, 체외에서 엔테로바이러스 71을 포함한 여러 피코르나바이러스의 3CL 프로테아제 활성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 세포 수준에서 피코르나바이러스의 복제를 효과적으로 억제할 수 있는 시아노 화합물을 합리하게 설계하여, 코로나바이러스 및/또는 피코르나바이러스에 의해 유발된 질활의 약물을 제조하는데 사용될 수 있다. 발명자는 이의 기초상에서 본 출원을 완성하였다.
본 발명의 첫 번째 목적은 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 3CL 프로테아제 억제제의 제조에서 상기 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 코로나바이러스 및/또는 피코르나바이러스에 의해 유발된 질환을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에서 상기 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 구현하기 위해, 본 발명에서 사용하는 기술적 해결수단은 하기와 같다.
일 양태에서, 본 발명은 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
I
다른 양태에서, 본 발명은 일반식 I의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 기술적 해결수단은 적어도 하기 기술적 효과를 갖는다.
본 발명의 화합물은 3CL 프로테아제 억제 활성을 갖고, 코로나바이러스 및 피코르나바이러스의 유전자에서 발현되는 단백질 복합체의 가수분해를 억제할 수 있으며, 나아가 바이러스 복제 및 발전을 억제하여, 코로나바이러스 또는 피코르나바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이며,
I
상기 식 I에서,
R1은 -COR8 및 -SO2 R9로부터 선택되고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, D, C1~C10 알킬, 아다만틸 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 3~8원 탄소 고리를 형성하며;
X는 O, S, S(=O)2 및 S=O로부터 선택되고;
Y는 부재 또는 O, S, S(=O)2 및 S=O로부터 선택되며;
R4는 H, C1~C10 알킬, C3~C8 시클로알킬, C6~C20 아릴, C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, C1~C10 알콕시로 치환된 C6~C20 아릴 및 할로겐화 C6~C20 아릴로부터 선택되고;
R5는 H, C1~C10 알킬 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나;
또는, R4 와 R5가 서로 연결되어 공동으로 C2-C6 알킬렌을 형성함으로써, X와 Y를 연결하며;
R6은 및 로부터 선택되고;
R7은 H 및 D로부터 선택되며;
R8은 H, C1~C10 알킬, C1~C10 알콕시, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C10 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR13R14, C6~C20 아릴, 할로겐화 C6~C20 아릴, C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 할로겐화 C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 5~20원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~20원 헤테로아릴로부터 선택되고;
R9는 C1~C10 알킬, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C10 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR15R16, C6~C20 아릴, 할로겐화 C6~C20 아릴, C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 할로겐화 C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 5~20원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~20원 헤테로아릴로부터 선택되며;
R13 및 R14는 각각 독립적으로 H 및 C1~C10 알킬로부터 선택되고;
R15 및 R16은 각각 독립적으로 H 및 C1~C10 알킬로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, D, C1~C6 알킬, 아다만틸 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 3~8원 탄소 고리를 형성한다.
일부 실시 형태에서, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 이소프로필, tert-부틸, 시클로펜틸 및 아다만틸로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로프로필 및 시클로펜틸을 형성한다.
일부 실시 형태에서, R2 및 R3 중 하나는 H로부터 선택되고, 다른 하나는 이소프로필, tert-부틸, 시클로펜틸 및 아다만틸로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로프로필 및 시클로펜틸을 형성한다.
일부 실시 형태에서, R4는 H, C1~C6 알킬, C3~C8 시클로알킬, C6~C10 아릴, C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, C1~C6 알콕시로 치환된 C6~C10 아릴 및 할로겐화 C6~C10 아릴로부터 선택되고;
R5는 H, C1~C6 알킬 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나;
또는, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 C2-C6 알킬렌을 형성함으로써, X와 Y를 연결한다.
일부 실시 형태에서, X는 O, S, S(=O)2 및 S=O로부터 선택되고; Y는 부재 또는 O, S 및 S=O로부터 선택되며; R4는 C1~C6 알킬 및 C6~C10 아릴로부터 선택되고, R5는 H로부터 선택되거나; 또는, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 C2~C6 알킬렌을 형성함으로써, X와 Y를 연결한다.
일부 실시 형태에서, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2 및 CH2CH2CH2를 형성함으로써, X와 Y를 연결한다.
일부 실시 형태에서, X, Y는 각각 독립적으로 O, S 및 S=O로부터 선택되고, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2 및 CH2CH2CH2를 형성함으로써, X와 Y를 연결한다.
일부 실시 형태에서, X, Y는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2를 형성함으로써, X와 Y를 연결한다.
일부 실시 형태에서, X, Y는 모두 S로부터 선택되거나, X, Y는 모두 O로부터 선택되고, R4 및 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2를 형성함으로써, X와 Y를 연결한다.
일부 실시 형태에서, X는 S로부터 선택되고, Y는 부재하며, R4는 페닐 및 이소프로필로부터 선택되고, R5는 H로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R6은 로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R7은 H로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R8은 H, C1~C6 알킬, C1~C6 알콕시, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C6 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR13R14, C6~C10 아릴, 할로겐화 C6~C10 아릴, C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 5~10원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~10원 헤테로아릴로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R8은 C1~C6 알킬, 할로겐화 C1~C6 알킬, C1~C6 알콕시, -NR13R14, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, 페닐, 할로겐화 페닐, C1~C6 알킬로 치환된 페닐, 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 페닐 및 5~6원 헤테로아릴로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R9는 C1~C6 알킬, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C6 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR15R16, C6~C10 아릴, 할로겐화 C6~C10 아릴, C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 5~10원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~10원 헤테로아릴로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R9는 C1~C6 알킬, C3~C7 시클로알킬, 페닐, C1~C6 알킬로 치환된 페닐 및 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 페닐로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H 및 C1~C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R15 및 R16은 각각 독립적으로 H 및 C1~C6 알킬로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R8은 CH3, CF3, CH2CF3, CF2CF3, 메톡시, , , 시클로프로필, , 페닐, , , 및 피리딘-3-일로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, R9는 CH3, 시클로프로필, 페닐, p-메틸페닐 및 p-트리플루오로메틸페닐로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물은 일반식 IA로 표시되는 시아노 화합물로부터 선택된다.
IA
상기 식 IA에서, R1, R2, R3, R4, R5, X 및 Y는 위에서 정의된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물은 일반식 IB로 표시되는 시아노 화합물로부터 선택된다.
IB
상기 식 IB에서, 각 치환기는 위에서 정의된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물은 하기 일반식으로 표시되는 시아노 화합물 중 어느 하나로부터 선택된다.
또는
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R6은 위에서 정의된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 일반식 I로 표시되는 화합물은 하기 화합물로부터 선택된다.
.
본 발명은 일반식 I로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 방법 i 및 방법 ii 중 하나이며,
방법 i:
ia) 식 II로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 축합 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻고;
바람직하게는, 상기 단계 ia)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 축합제 및 염기의 작용을 통해 식 II로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 용매 중에서 0.1 - 12시간 동안 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻으며;
여기서, 상기 용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 에틸아세테이트 및 1,4-디옥산 중 하나 이상을 혼합한 것이고;
선택적으로, 상기 축합제는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염, 1-하이드록시벤조트리아졸, 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 1-프로필포스폰산 무수물, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트, N,N’-카르보닐디이미다졸 및 O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
선택적으로, 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린이고;
ib) 식 IV로 표시되는 화합물을 탈수시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻으며;
바람직하게는, 상기 단계 ib)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 식 IV로 표시되는 화합물과 탈수제를 무수용매 중에서 1 - 24시간 동안 반응시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻고;
여기서, 상기 무수용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 메틸벤젠, 1,4-디옥산 및 피리딘 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
상기 탈수제는 트리플루오로아세트산 무수물 및 N-(트리에틸암모늄 술포닐)메틸카바메이트이고; 또는
방법 ii:
iia) 식 V로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 축합시켜 식 VI로 표시되는 화합물을 얻되, 식 V로 표시되는 화합물 중의 PG는 아미노기의 보호기이며;
바람직하게는, 상기 단계 iia)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 축합제 및 염기의 작용을 통해 식 V로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 용매 중에서 0.1 - 12시간 동안 반응시켜 식 VI로 표시되는 화합물을 얻고,
여기서, 상기 용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 에틸아세테이트 및 1,4-디옥산 중 하나 이상을 혼합한 것이며,
상기 축합제는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N’,N’- 테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염, 1-하이드록시벤조트리아졸, 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 1-프로필포스폰산 무수물, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트, N,N’-카르보닐디이미다졸 및 O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트 중 하나 이상을 혼합한 것이고;
상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린이며;
상기 아미노기의 보호기 PG는 tert-부톡시카르보닐, 벤질 및 p-메톡시벤질이고;
iib) 식 VI로 표시되는 화합물을 탈보호하여 식 VII로 표시되는 화합물을 얻으며;
바람직하게는, 상기 단계 iib)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 식 VI로 표시되는 화합물과 트리플루오로아세트산 또는 염화수소의 유기용액 또는 Pd/C/H2을 반응시켜 식 VII로 표시되는 화합물을 얻고;
iic) 식 VII로 표시되는 화합물을 아미노아실화, 설포닐화 또는 축합 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻으며;
바람직하게는, 상기 단계 iic)에서,
-20℃ ~ 50℃의 온도에서, 염기를 첨가한 조건에서 식 VII로 표시되는 화합물과 염화 아실 또는 산 무수물을 아미노아실화 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻고; 또는,
-20℃ ~ 50℃의 온도에서, 염기의 조건에서 식 VII로 표시되는 화합물과 염화술포닐 또는 설폰산 무수물을 설포닐화 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻으며; 또는,
-20℃ ~ 50℃의 온도에서, 축합제와 염기의 조건에서 식 VII로 표시되는 화합물과 카르복실 화합물을 축합 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻고;
선택적으로, 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린이고;
선택적으로, 상기 축합제는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염, 1-하이드록시벤조트리아졸, 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 1-프로필포스폰산 무수물, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트, N,N’-카르보닐디이미다졸 및 O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트 중 하나 이상을 혼합한 것이고,
iid) 식 IV로 표시되는 화합물을 탈수시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻으며;
바람직하게는, 상기 단계 iid)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 식 IV로 표시되는 화합물과 탈수제를 무수용매 중에서 1 - 24시간 동안 반응시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻고;
여기서, 상기 무수용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 메틸벤젠, 1,4-디옥산 및 피리딘 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
선택적으로, 상기 탈수제는 트리플루오로아세트산 무수물 및 N-(트리에틸암모늄 술포닐)메틸카바메이트이고,
여기서, 각 치환기는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 다른 양태는 일반식 I의 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다. 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보조재료, 희석제, 담체, 부형제 또는 보조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 일반식 I의 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 것, 및 약학적으로 허용가능한 보조재료를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공하고; 선택적으로, 상기 약학적 조성물은 리토나비르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 일반식 I의 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염, 및 리토나비르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 것을 포함하는 약물 조성을 더 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 일반식 I의 시아노 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 것, 리토나비르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 보조재료를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다.
실험을 통해 본 발명의 화합물이 코로나바이러스 3CL 프로테아제 및 피코르나바이러스의 3CL 프로테아제 억제 활성을 갖는다는 것을 증명하였다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 일반식 I의 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 하나 이상, 또는 상기 약학적 조성물을 포함하는 코로나바이러스 3CL 프로테아제 억제제 및/또는 피코르나바이러스의 3CL 프로테아제 억제제를 제공한다.
본 발명은 약물의 제조에서 상기 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 혼합물, 또는 상기 약학적 조성물의 용도를 더 제공하고, 상기 약물은 코로나바이러스 3CL 프로테아제 활성을 억제하기 위한 약물, 코로나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물, 피코르나바이러스의 3CL 프로테아제 활성을 억제하기 위한 약물, 및 피코르나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물로부터 선택된다.
본 발명은 본 발명의 일반식 I의 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 하나 이상, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 처리가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 3CL 프로테아제를 억제하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 본 발명의 일반식 I의 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 하나 이상, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 더 제공하고, 상기 질환 또는 질병은 3CL 프로테아제에 의해 매개된 질환 또는 질병이며, 특히 코로나바이러스 감염 및/또는 피코르나바이러스감염과 관련된 질환 또는 질병이다.
본 발명은 코로나바이러스 및/또는 피코르나바이러스 감염으로 인한 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에서 상기 일반식 I로 표시된 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 중의 하나 이상, 또는 이의 약학적 조성물의 용도를 더 제공한다.
본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 일반식 I로 표시된 시아노 화합물, 이의 라세미체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 중의 하나 이상을 포함하는 약물 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 및/또는 피코르나바이러스 감염으로 인한 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다.
일부 실시 형태에서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, H229E-CoV, HKU1-CoV, NL63-CoV, OC43-CoV 또는 SARS-CoV-2로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 상기 코로나바이러스 감염으로 인한 관련 질환은 호흡기 감염, 폐렴 또는 이의 합병증으로부터 선택된다.
용어 정의 및 설명
“C1~C10 알킬”은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소기를 의미한다. 상기 알킬의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 네오펜틸, 1,1-디메틸프로필, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 2-에틸부틸, 1-에틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸 또는 1,2-디메틸부틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않고; “C1~C6 알킬”은 1-6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 의미하며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
“알킬렌”은 직쇄 또는 분지쇄 2가 포화 탄화수소기를 의미하는 것으로 이해할 수 있다. “C2~C6 알킬렌”은2-6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 2가 포화 탄화수소기를 의미하는 것으로 이해할 수 있고, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH2CH2CH2, CH2CH2CH2CH2CH2 또는 CH2CH2CH2CH2CH2CH2 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
“C3~C8 시클로알킬”은 3-8개의 고리 탄소 원자를 포함하는 고리형 알킬을 의미한다. “C3~C7 시클로알킬”은 3-7개의 고리 탄소 원자를 포함하는 고리형 알킬을 의미하고, 본 출원의 시클로알킬은 시클로프로필, 메틸시클로프로필, 에틸시클로프로필, 디메틸시클로프로필, 시클로부틸, 메틸시클로부틸, 에틸시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
“C1~C10 알콕시”는 1-10개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 알콕시를 의미한다. “C1~C6 알콕시”는 1-6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄, 분지쇄 또는 고리형의 알콕시를 의미하고, 본 출원의 알콕시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 시클로펜틸옥시, 헥실옥시, 시클로헥실옥시 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
“아릴”은 공액 π 전자 시스템을 갖는 전탄소 단일 고리 또는 융합 다중 고리를 갖는 방향족 고리기를 의미한다. 아릴은 6-20개의 탄소 원자, 6-14개의 탄소 원자 또는 6-12개의 탄소 원자를 가질 수 있다. “C6~C20 아릴”은 6~20개의 탄소 원자를 갖는 아릴로 이해할 수 있다. 특히, 6개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C6 아릴”), 예를 들어 페닐; 또는 9개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C9 아릴”), 예를 들어 인다닐 또는 인데닐; 또는 10개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C10 아릴”), 예를 들어 테트랄리닐, 디히드로나프틸 또는 나프틸; 또는 13개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C13 아릴”), 예를 들어 플루오레닐; 또는 14개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C14 아릴”), 예를 들어 안트라세닐이다. “C6~C10 아릴”은 6~10개의 탄소 원자를 갖는 아릴로 이해할 수 있다. 특히, 6개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C6 아릴”), 예를 들어 페닐; 또는 9개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C9 아릴”), 예를 들어 인다닐 또는 인데닐; 또는 10개의 탄소 원자를 갖는 고리(“C10 아릴”), 예를 들어 테트랄리닐, 디히드로나프틸 또는 나프틸이다.
“헤테로아릴”은 5-20개의 고리 원자를 포함하는 방향성을 갖는 고리기이고, 그 중 하나 이상의 고리 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된 헤테로 원자이며, 나머지 고리 원자는 탄소이다. “5~20원 헤테로아릴”은 5~20개의 고리 원자, 특히 5개 또는 6개 또는 9개 또는 10개 또는 13개 또는 14개의 고리 원자를 갖고, 1-7개의 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자를 포함하는 헤테로아릴로 이해할 수 있다. “5~10원 헤테로아릴”은 5~10개의 고리 원자, 특히 5개 또는 6개 또는 9개 또는 10개의 고리 원자를 갖고, 1-5개의 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자를 포함하는 헤테로아릴로 이해할 수 있다. “5~6원 헤테로아릴”은 5 또는 6개의 고리 원자를 갖고 1-3개의 독립적으로 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자를 포함하는 헤테로아릴로 이해할 수 있다. 본 발명의 상기 헤테로아릴은 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴 또는 티아디아졸릴 등 및 이들의 벤조 유도체, 예를 들어 벤조푸릴, 벤조티에닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 인다졸릴, 인돌릴 또는 이소인돌릴 등; 또는 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 또는 트리아지닐 등 및 이들의 벤조 유도체, 예를 들어 퀴놀리닐, 퀴나졸리닐 또는 이소퀴놀린 등; 또는 아조시닐, 인돌리지닐, 퓨리닐 등 및 이들의 벤조 유도체; 또는 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 프테리디닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐 또는 페녹사지닐 등으로부터 선택될 수 있다.
“할로겐”은 불소, 염소, 브롬, 요오드로부터 선택된다.
“할로겐화”는 모노할로겐화, 폴리할로겐화 또는 퍼할로겐화를 포함하고, 즉 하나 이상 또는 모든 수소 원자가 할로겐으로 치환된다.
“치환”은 기의 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 치환기로 치환되는 것을 의미한다.
용어 “선택적” 또는 “선택적으로”는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있음을 의미하고, 상기 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생 및 상기 사건 또는 상황이 발생하지 않는 것을 포함한다.
“치료 유효량”은 (i) 특정 질환, 병증 또는 장애를 치료, (ii) 특정 질환, 병증 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화, 개선 또는 제거, 또는 (iii)본 명세서에서 상기 특정 질환, 병증 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 지연시키는 본 발명의 화합물의 용량을 의미한다. “치료 유효량”을 구성하는 본 발명의 화합물의 용량은 상기 화합물, 질환 상태 및 이의 중증도, 투여 방법 및 치료할 포유동물의 연령에 따라 달라지나, 통상적으로 당업자에 의해 자신의 지식 및 본 출원의 내용에 따라 결정할 수 있다.
“약학적으로 허용가능한 염”은 약학적으로 허용가능한 산 또는 염기의 염을 의미하고, 화합물과 무기산 또는 유기산으로 형성된 염, 및 화합물과 무기 염기 또는 유기 염기로 형성된 염을 포함한다.
용어 “약물 조합”은 두개 이상의 활성 성분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조합을 의미한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 약물 조합 중의 활성 성분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 동시에 투여될 수 있고, 본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 약물 조합 중의 활성 성분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 각각 또는 순차적으로 투여될 수도 있다.
“약학적 조성물”은 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 이의 염과 약학적으로 허용가능한 보조재료로 조성된 혼합물을 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 본 발명의 화합물을 유기체에 투여하는 것을 유리하게 하는 것이다.
“약학적으로 허용가능한 보조재료”는 유기체에 현저한 자극 작용이 없고, 상기 활성 화합물의 생물 활성 및 성능을 손상시키지 않는 보조재료를 의미한다. 적합한 보조제는 탄수화합물, 왁스, 수용성 및/또는 물 팽창가능한 중합체, 친수성 또는 소수성 재료, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등과 같이 당업자에게 잘 알려진 것이다.
도 1은 SARS-CoV-2의 WIV04 균주의 체외 활성에 대한 화합물 2의 억제율-농도를 나타내는 도이다.
도 2는 SARS-CoV-2의 B.1.351 균주의 체외 활성에 대한 화합물 2의 억제율-농도를 나타내는 도이다.
도 3은 실시예 26에서 각각 감염 2일 후(도 A) 및 4일 후(도 B) 마우스의 폐부 바이러스 역가에 대한 화합물 2의 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 4는 실시예 26의 마우스의 체중 변화를 나타내는 도이다.
도 5는 실시예 26에서 감염 4일 후 마우스 뇌부 바이러스 역가에 대한 화합물 2의 억제 효과를 나타내는 도이다.
이하 실시예를 통해 본 출원을 추가로 설명한다. 이하 실시예에서, 원료는 상업적으로 구매하거나 문헌에 기재된 방법/본 분야에 공지된 유기 합성 방법을 통해 제조할 수 있다.
실시예 1
화합물 1-1의 제조:
단계 1: 반응 플라스크에 시작원료 SMA(2.74 g, 11.85 mmol), 35 ml의 디클로로메탄 및 35 ml의 DMF를 첨가하고, 0℃로 냉각시키며, 순차적으로 시작원료 SMB(3.56 g, 11.86 mmol), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP, 6.29 g, 14.22 mmol) 및 N-메틸모르폴린(NMM, 3.91 ml, 35.56 mmol)을 첨가하고, 실온으로 승온시켜 10시간 동안 반응시키며, 반응이 완료된 후, 적당량의 디클로로메탄을 첨가하고, 유기상을 순차적으로 1 N 염산수용액, 포화 식염수로 세척하며, 세척이 완료된 후 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 유기상을 농축 건조시키며, 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 3.71 g의 INT-1를 얻었다. ESI-MS: 433.2 m/z [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δH: 6.75 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.93 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.40-3.31 (m, 4H), 2.70 (dd, J = 13.1, 7.9 Hz, 1H), 2.37 (dd, J = 13.2, 8.4 Hz, 1H), 1.37 (s, 9H), 0.94 (s, 9H).
단계 2: 반응 플라스크에 INT-1(3.71 g, 8.58 mmol), 37 ml의 THF 및 37 ml의 정제수 및 수산화리튬일수화물(0.72 g, 17.16 mmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시키며, 반응이 완료된 후, 농염산으로 pH=4로 조정하고, 여과하여 3.4 g의 화합물 1-1을 얻었다. ESI-MS: 419.2 m/z [M+H]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δH:12.68 (s, 1H), 6.71 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.38-4.19 (m, 2H), 4.11 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.88 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.41-3.29(m, 4H), 2.69 (dd, J = 13.1, 7.9 Hz, 1H), 2.34 (dd, J = 13.2, 8.9 Hz, 1H), 1.38 (s, 9H), 0.94 (s, 9H).
화합물 1-2의 제조:
반응 플라스크에 암모니아 가스-메탄올 용액(700 ml, 7 mol/L), 시작원료 SMD(100 g, 0.349 mol)를 첨가하고, 교반하여 용해시키며, 25±5℃로 온도를 유지하고, 36 시간 동안 반응시키며, 반응이 완료된 후, 나머지 반응액이 약 250 ml로 될 때까지 반응액을 농축하고, 300 ml의 이소프로필알코올을 첨가하여 나머지 반응액이 약 250 ml로 될 때까지 계속 감압농축하며(3회 반복), 질소 가스로 교체하고, 10±5℃로 냉각시키며, 반응 케틀에 500 ml의 염화수소-이소프로필알코올 용액(4 mol/L)을 첨가하고, 첨가가 완료된 후, 25±5℃로 승온시키며, 25±5℃로 온도를 유지하면서 9시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응액의 부피가 약 250 ml로 될 때까지 반응액을 감압농축하고, 300 ml의 이소프로필알코올을 첨가하여 나머지 반응액의 부피가 약 250 ml로 될 때까지 계속 감압농축하며(2회 반복), 100 ml의 이소프로필알코올을 첨가하고, 30±5분 동안 교반하며, 여과하고, 여과 케이크를 50 ml의 이소프로필알코올로 용출하여 젖은 생성물을 얻었으며; 45±5℃에서 진공 건조시켜 66.7 g의 화합물 1-2를 얻었고, 수율은 92%이다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δH:8.45 (d, J = 5.1 Hz, 3H), 8.25 - 8.04 (m, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.67 - 7.49 (m, 1H), 3.85-3.80 (m, 1H), 3.19-3.13 (m, 2H), 2.59 - 2.51 (m, 1H), 2.32-2.27 (m, 1H), 2.05-1.98 (m, 1H), 1.82 - 1.66 (m, 2H); ESI-MS: 172.1 m/z [M+H]+.
화합물 1의 제조:
2구 플라스크에 화합물 1-1(419 mg, 1 mmol)을 넣고, 질소 가스의 보호하에서 5 mL의 디클로로메탄을 첨가한 후, 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트(400 mg, 1.1 mmol)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 화합물 1-2(1 mmol)를 1 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 상기 시스템에 첨가한 후, 얼음 수욕에서 N,N-디이소프로필에틸아민(0.5 mL, 1 mmol)을 첨가하며, 얼음 수욕을 제거하고, 시스템을 실온에서 밤새 교반하였다. 처리 후, 50 mL의 디클로로메탄을 첨가한 후 1 M 염산수용액으로 3회 세척하고, 중탄산나트륨 포화 수용액으로 3회 세척하며, 유기상을 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키며, 여과하고 회전건조시켜 화합물 1-3(백색 고체, 469 mg, 수율 82%)을 얻었다. ESI-MS: m/z 572.3[M+H]+.
2구 플라스크에 화합물 1-3(114 mg, 0.2 mmol)과 버지스 시약(1.5 eq)을 첨가하고, 질소 가스를 3회 충전 및 방전한 후 분자체로 건조시킨 디클로로메탄을 첨가하며, 실온에서 밤새 교반하고, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타냈다. 처리 후, 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 화합물 1(백색 고체, 52 mg, 수율 47%)을 얻었다. ESI-MS: 554.3 m/z [M+H]+.
실시예 2
화합물 1-3(572 mg, 1 mmol)을 3 mL의 4 M 염화수소/1,4-디옥산 용액에 용해시키거나, 또는 2 mL의 디클로로메탄에 용해시킨 후 2 mL의 트리플루오로아세트산을 적가하고, 환경 온도에서 교반하며, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타낸 후 용매를 충분히 회전건조시켰다. 얻은 조생성물을 2 mL의 디클로로메탄에 용해시키며, 질소 가스의 보호하에서, 트리에틸아민(3 mmol)을 첨가한 후 시스템을 얼음 수욕에 넣고, 트리플루오로아세트산 무수물(1.2 mmol)을 적가하며, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타낸 후, 50 mL의 디클로로메탄을 첨가한 후 1 M 염산수용액으로 3회 세척하고, 중탄산나트륨 포화 수용액으로 3회 세척하며, 유기상을 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키며, 컬럼을 통과시켜 화합물 2-1(백색 고체, 265 mg, 수율 46%)을 얻었다. ESI-MS: m/z 568.3[M+H]+.
2구 플라스크에 화합물 2-1(113 mg, 0.2 mmol)과 버지스 시약(1.5 eq)을 첨가하고, 질소 가스를 3회 충전 및 방전한 후 분자체로 건조시킨 디클로로메탄을 첨가하며, 실온에서 밤새 교반하고, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타냈다. 처리 후, 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 화합물 2(백색 고체, 41 mg, 수율 47%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.46 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 9.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 4.97 (ddd, J = 11.0, 8.5, 5.0 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 9.9, 7.1 Hz, 1H), 4.26-4.14 (m, 1H), 3.92 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.50-3.34 (m, 4H), 3.22-3.11 (m, 1H), 3.06 (td, J = 9.3, 7.1 Hz, 1H), 2.68-2.58 (m, 1H), 2.50-2.43 (m, 1H), 2.31 (dd, J = 13.0, 10.0 Hz, 1H), 2.23-2.07 (m, 2H), 1.71 (tdd, J = 14.9, 10.3, 7.4 Hz, 2H), 0.99 (s, 9H). ESI-MS: 550.3 m/z [M+H]+.
실시예 3
트리플루오로아세트산 무수물 대신 아세트산 무수물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 3(백색 고체, 45 mg, 수율 45%)을 얻었다. ESI-MS: 496.3 m/z [M+H] +.
실시예 4
트리플루오로아세트산 무수물 대신 시클로프로판카르복실산 무수물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 4(백색 고체, 32 mg, 수율 31%)를 얻었다, ESI-MS: 522.3 m/z [M+H] +.
실시예 5
1-1 대신 5-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 5(백색 고체, 22 mg, 수율 20%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.41 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 4.96 (ddd, J = 10.6, 8.4, 5.4 Hz, 1H), 4.58-4.50 (m, 1H), 4.34 (dd, J = 9.8, 7.2 Hz, 1H), 4.26-4.21 (m, 1H), 3.89 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 3.45-3.33 (m, 4H), 3.22-3.03 (m, 2H), 2.64-2.57 (m, 1H), 2.45 (ddd, J = 10.1, 8.5, 4.5 Hz, 1H), 2.31 (dd, J = 12.9, 9.8 Hz, 1H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.84-1.67 (m, 2H), 1.39-1.31 (m, 2H), 1.24 (t, J = 9.5 Hz, 2H), 0.97 (s, 9H). ESI-MS: 540.2 m/z [M+H] +.
실시예 6
1-1 대신 6-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 6(백색 고체, 38 mg, 수율 37%)을 얻었다. ESI-MS:512.2 m/z [M+H] +.
실시예 7
1-1 대신 7-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 7(백색 고체, 49 mg, 수율 44%)을 얻었다. ESI-MS:553.3 m/z [M+H] +.
실시예 8
트리플루오로아세트산 무수물 대신 벤조산 무수물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 8(백색 고체, 44 mg, 수율 39%)을 얻었다. ESI-MS: 558.3 m/z [M+H] +.
실시예 9
트리플루오로아세트산 무수물 대신 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조일클로라이드를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 9(백색 고체, 39 mg, 수율 28%)를 얻었다. ESI-MS: 694.2 m/z [M+H] +.
실시예 10
트리플루오로아세트산 무수물 대신 3,5-디메틸벤조일클로라이드를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 10(백색 고체, 31 mg, 수율 26%)을 얻었다. ESI-MS: 586.2 m/z [M+H] +.
실시예 11
트리플루오로아세트산 무수물 대신 3,3,3-트리플루오로프로피온산 무수물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 11(백색 고체, 28 mg, 수율 25%)을 얻었다. ESI-MS: 564.2 m/z [M+H] +.
실시예 12
트리플루오로아세트산 무수물 대신 3-피리딜카르보닐클로라이드를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 12(백색 고체, 39mg, 수율 35%)를 얻었다. ESI-MS: 559.2 m/z [M+H] +.
실시예 13
트리플루오로아세트산 무수물 대신 펜타플루오로프로피오닐 클로라이드를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 13(백색 고체, 41 mg, 수율 34%)을 얻었다. ESI-MS: 600.2 m/z [M+H] +.
실시예 14
1-1 대신 14-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 14(백색 고체, 32 mg, 수율 29%)를 얻었다. ESI-MS: 550.2 m/z [M+H] +.
실시예 15
트리플루오로아세트산 무수물 대신 메틸설폰산 무수물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 15(백색 고체, 38 mg, 수율 36%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 5.06 (dd, J = 11.5, 4.5 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 10.3, 7.1 Hz, 1H), 4.27 (dd, J = 11.0, 1.6 Hz, 1H), 4.02-3.89 (m, 2H), 3.45 (qt, J = 8.6, 4.7 Hz, 4H), 3.30-3.23 (m, 1H), 2.92 (s, 3H), 2.78 (tdd, J = 10.3, 8.5, 4.0 Hz, 1H), 2.68 (ddd, J = 13.0, 7.2, 1.6 Hz, 1H), 2.51 (dd, J = 13.0, 10.3 Hz, 1H), 2.45-2.27 (m, 2H), 1.94-1.77 (m, 2H), 1.05 (s, 9H). ESI-MS: 532.2 m/z [M+H] +.
실시예 16
트리플루오로아세트산 무수물 대신 사이클로프로필 설포닐 클로라이드를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 16(백색 고체, 29 mg, 수율 26%)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 5.06 (dd, J = 11.5, 4.5 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 10.3, 7.0 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 11.0, 1.6 Hz, 1H), 4.00-3.94 (m, 2H), 3.52-3.38 (m, 4H), 3.31-3.21 (m, 1H), 2.79 (tdd, J = 10.4, 8.5, 4.1 Hz, 1H), 2.72-2.65 (m, 1H), 2.57 (ddd, J = 7.9, 6.2, 3.9 Hz, 1H), 2.51 (dd, J = 13.0, 10.4 Hz, 1H), 2.43-2.29 (m, 2H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.34-1.29 (m, 1H), 1.14 (qt, J = 6.4, 3.8 Hz, 1H), 1.06 (s, 9H), 1.01 (ddt, J = 7.9, 5.8, 2.7 Hz, 2H), 0.97-0.87 (m, 1H). ESI-MS: 558.2 m/z [M+H] +.
실시예 17
트리플루오로아세트산 무수물 대신 벤젠설포닐클로라이드를 사용한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 화합물 17(백색 고체, 35 mg, 수율 29%)을 얻었다. ESI-MS: 594.2 m/z [M+H] +.
실시예 18
1-1 대신 18-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 18(백색 고체, 44 mg, 수율 42%)을 얻었다. ESI-MS: 518.2 m/z [M+H] +.
실시예 19
1-1 대신 19-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 19(백색 고체, 41 mg, 수율 36%)를 얻었다. ESI-MS: 568.2 m/z [M+H] +.
실시예 20
1-1 대신 20-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 20(백색 고체, 45 mg, 수율 35%)을 얻었다. ESI-MS: 648.2 m/z [M+H] +.
실시예 21
1-1 대신 21-1을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 21(백색 고체, 34 mg, 수율 31%)을 얻었다. ESI-MS: 640.2 m/z [M+H] +.
실시예 22
1-1 대신 22-1을 사용하고, 1-2 대신 22-1 을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 22(백색 고체, 22 mg, 수율 18%)를 얻었다. ESI-MS: 614.2 m/z [M+H] +.
실시예 23
2구 플라스크에 화합물 23-1(497 mg, 1 mmol)을 넣고, 질소 가스의 보호하에서 5 mL의 디클로로메탄을 첨가한 후, 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트(400 mg, 1.1 mmol)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 화합물 1-2(또는 이에 상응하는 염, 1 mmol)을 1 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 상기 시스템에 첨가한 후, 얼음 수욕에서 N, N-디이소프로필에틸아민(0.5 mL, 1 mmol)을 첨가하며, 얼음 수욕을 제거하고, 시스템을 실온에서 밤새 교반하였다. 처리 후, 50 mL의 디클로로메탄을 첨가한 후 1 M 염산수용액으로 3회 세척하고, 중탄산나트륨 포화 수용액으로 3회 세척하며, 유기상을 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키며, 여과하고 회전건조시켜 화합물 23-2(백색 고체, 421 mg, 수율 65%)를 얻었다. ESI-MS: m/z 650.3[M+H]+.
화합물 23-2(325 mg, 0.5 mmol)를 1.5 mL의 4 M 염화수소/1,4-디옥산 용액에 용해시키거나, 또는 1 mL의 디클로로메탄에 용해시킨 후 1 mL의 트리플루오로아세트산을 적가하고, 환경 온도에서 교반하며, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타낸 후 용매를 충분히 회전건조시켰다. 얻은 조생성물을 2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 질소 가스의 보호하에서, 트리에틸아민(1.5 mmol)을 첨가한 후 시스템을 얼음 수욕에 넣어 트리플루오로아세트산 무수물(0.6 mmol)을 적가하며, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타낸 후, 25 mL의 디클로로메탄을 첨가한 후 1 M 염산수용액으로 3회 세척하고, 중탄산나트륨 포화 수용액으로 3회 세척하며, 유기상을 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키며, 컬럼을 통과시켜 화합물 23-3(백색 고체, 167 mg, 수율 52%)을 얻었다. ESI-MS: m/z 646.3[M+H]+.
2구 플라스크에 화합물 23-3(130 mg, 0.2 mmol)과 버지스 시약(1.5 eq)을 첨가하고, 질소 가스를 3회 충전 및 방전한 후 분자체로 건조시킨 디클로로메탄을 첨가하며, 실온에서 밤새 교반하고, 박층 크로마토그래피 검출하여 원료가 기본적으로 완전히 반응하였음을 나타냈다. 처리 후, 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 화합물 23(백색 고체, 37 mg, 수율 29%)을 얻었다. ESI-MS: 628.2 m/z [M+H] +.
실시예 24: 화합물의 SARS-CoV-2 3Clpro 활성 억제 테스트
형광 공명 에너지 전달 방법을 이용하여 SARS-CoV-2 3CLpro 효소 활성에 대한 화합물의 억제 활성을 평가 측정하였다. 전체 효소 촉매 반응 시스템의 부피는 120 μL이고, 프로테아제의 최종농도는 30 nM이며, 기질의 최종농도는 20 μM이다. 반응 시스템의 완충액은 50 mM의 Tris pH 7.3, 1 mM의 EDTA를 포함한다. 96웰 플레이트에 SARS-CoV-2 3CLpro 프로테아제 및 상이한 농도의 화합물을 첨가하고, 30℃에서 10분 동안 배양하며, 기질을 첨가하고 신속하게 마이크로플레이트 리더기에 넣어 판독하였다. 여기광 및 방출광은 각각 320 nM 및 405 nM이다. 테스트 시간은 3.5 분이고, 35초마다 형광 값을 판독하였다. 최종 결과는 처음 2분 동안의 판독 값을 취하여 반응 속도를 피팅하고, 대조군(DMSO)과 비교하여 억제율을 계산하였다. GraphPad Prism 8 소프트웨어를 이용하여 피팅하여 IC50 값 및 억제율 곡선을 얻었다.
실험 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다. 그 결과, 본 발명의 화합물은 SARS-CoV-2 3CLpro에 대해 강력한 억제 작용을 가짐을 나타낸다. IC50 값의 범위: A는 < 0.1 μM임을 나타내고, B는 0.1 - 1 μM임을 나타내며, C는 1 - 10 μM임을 나타낸다.
SARS-CoV-2 3CLpro에 대한 화합물 1-23의 억제작용
화합물 번호 화합물 구조식 IC50 (μM)
1 A
2 A
3 A
4 A
5 A
6 B
7 A
8 C
9 C
10 C
11 B
12 C
13 A
14 A
15 A
16 A
17 C
18 A
19 C
20 B
21 A
22 A
23 A
실시예 24-2: SARS-CoV-2 오미크론 균주 돌연변이형 3CL 프로테아제에 대한 화합물 2의 억제 활성 테스트
실험 원리: 효소와 기질이 반응하여 형광 공명 에너지 전달(FRET)이 발생되는 방법을 적용하여, 오미크론 균주 돌연변이형 3CL 프로테아제(P132H) 활성에 대한 본 발명의 화합물의 억제 효과를 연구하였다.
실험 재료는 하기 표에 나타낸 바와 같다.
실험 기기 및 장비:
실험 단계:
20 mM의 Tris-HCl, 1 mM의 EDTA, 0.01%의 BSA, 1 mM의 DTT 및 100 mM의 NaCl을 포함하는 반응 완충액을 제조하였다. Echo 피펫팅 시스템으로 테스트할 화합물을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 상이한 농도로 희석하고, 384웰 플레이트로 옮겼다. 반응 완충액으로 돌연변이형 3CL 프로테아제를 희석하고, 384웰 플레이트에 10 μL/웰로 첨가하며, 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리한 후, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 다음 기질을 10 μL/웰로 첨가하고, 1000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 효소 반응을 시작하였다. 반응 시스템에서, 효소의 최종농도는 50 nM이고, 기질의 최종농도는 20 μM이며, 화합물의 농도 범위는 10000 nM 내지 0.51 nM이다. 그 다음 Flexstation 3마이크로플레이트 리더기에서 Kinetic Reduction Vmax 모드를 선택하고, 75초마다 연속적으로 490 nm 파장에서 형광 값을 총 35회 판독하여 반응 속도 값(V)을 얻으며, 억제율을 계산하고, XLfit 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 피팅을 진행하여 반수 최대 억제 농도(IC50)를 얻었다. 억제율 계산 방법은 이하와 같다:
억제율 = (Vmax-Vcompound)/(Vmax -Vmin)*100%
여기서, Vmax는 효소 및 기질만 포함하는 웰의 반응 속도 값이고, Vmin은 기질만 포함하는 웰의 반응 속도 값이며, VCompound는 테스트할 화합물, 효소 및 기질만 포함하는 웰의 반응 속도 값이다.
실험 결과: 화합물 2는 SARS-CoV-2 오미크론 균주에서 P132H 돌연변이를 갖는 3CL 프로테아제에 대해 여전히 현저한 억제 활성을 유지한다(3회 독립적인 테스트 IC50은 0.022±0.00090 μM).
SARS-CoV-2 오미크론 균주 3CL 프로테아제 활성에 대한 화합물 2의 억제 효과
3CL 프로테아제 화합물 2 IC50 (μM) (n=3*)
SARS-CoV-2(오미크론 균주) 0.022±0.00090
*는 3회 독립적인 반복 실험을 의미한다.
실시예 24-3: 상이한 출처의 코로나바이러스 3CL 프로테아제에 대한 화합물 2의 억제 활성 테스트
실험 목적: 인간을 감염시킬 수 있는 다른 6가지의 코로나바이러스에서 유래된 3CL 프로테아제 활성에 대한 화합물 2의 억제 활성을 연구하였고, 이 6가지의 바이러는 각각 SARS-CoV, MERS-CoV, OC43-CoV, H229E-CoV, NL63-CoV 및 HKU1-CoV이다.
실험 재료:
3CL 프로테아제: 코로나바이러스 유전체 서열에 따라 재조합 전장 코로나바이러스 3CL 프로테아제를 자체 제작하였고, 사용된 SARS-CoV, MERS-CoV, H229E-CoV, HKU1-CoV, NL63-CoV 및 OC43-CoV 유전체 GenBank 번호는 각각 AAP13442.1, MT387202.1, AF304460.1, AY597011.2, AY567487.2 및 AY903459.1이며, 6가지 코로나바이러스 3CL 프로테아제 단백질 발현에 필요한 DNA 서열은 Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에서 구입하였다.
3CL 프로테아제 기질은 Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에서 구입하였다.
키모트립신 기질은 GL Biochem Ltd.에서 구입하였다.
다른 시약은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
실험 단계:
반응 완충액(50 mM의 Tris 및 1 mM의 EDTA를 포함)을 제조하였다. DMSO로 테스트할 화합물을 100 mM의 모액으로 용해하고, 추가로 반응 완충액으로 2배 구배로 총 11개의 농도로 희석하였다. 96웰 플레이트에 3CL 프로테아제 및 상이한 농도의 화합물을 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하며, 기질을 첨가하고 신속하게 마이크로플레이트 리더기에 넣어 판독하였다. 전체 효소 촉매 반응 시스템의 부피는 120 μL이고, SARS-CoV, MERS-CoV, H229E-CoV, HKU1-CoV, NL63-CoV 및 OC43-CoV프로테아제의 최종농도는 각각 30 nM, 80 nM, 30 nM, 20 nM, 30 nM 및 10 nM이며, 기질의 최종농도는 10 μM이다. 판독 시 여기광 및 방출광의 파장은 각각 340 nm 및 490 nm이다. 테스트 시간은 10분이고, 1분마다 형광 값을 판독하며, 최종 결과는 처음 5분 동안의 판독 값을 취하여 피팅하여 반응 속도를 얻고, 억제율을 계산하며, 계산 공식은 다음과 같다. 억제율 = 1-(테스트군 반응 속도/대조군반응 속도).
실험 결과: 결과는 표 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 2는 다른 6가지의 코로나바이러스에서 유래된 3CL 프로테아제에 대해 비교적 우수한 억제 효과를 나타냈고, 이는 화합물 2가 광범위한 항 코로나바이러스 활성을 가질 수 있음을 나타낸다.
다른 코로나바이러스에서 유래된 3CL 프로테아제에 대한 화합물 2의 억제 작용
3CL 프로테아제 출처 화합물 2 IC50 (μM)
HKU1-CoV 0.0049
OC43-CoV 0.010
SARS-CoV-1 0.024
MERS-CoV 0.060
H229E-CoV 0.13
NL63-CoV 0.85
실시예 25-1: SARS-CoV-2 WIV04, B.1.351 균주의 세포 수준에 대한 화합물 2의 억제 작용
시험은 Vero E6 세포를 사용하고, 48웰 플레이트에 Vero E6 세포(50000개 세포/웰)를 첨가하며, 농도 구배의 화합물이 포함된 배지를 100 μL/웰로 첨가하고, 1시간 후 SARS-CoV-2를 첨가하며, 감염다중도(MOI)는 0.01이다. 총 1시간 동안 배양한 후, 상층액을 흡출하고, 세척하며 다시 농도 구배의 화합물을 포함하는 배지를 200 μL/웰로 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 세포 상층액을 수집하고, 상층액의 바이러스 RNA를 추출하며 정량 실시간 PCR 방법을 이용하여 상층액의 바이러스 카피수를 검출하고, 바이러스 카피수를 기준으로 화합물의 억제율을 계산하며, prism 6.0을 이용하여 화합물의 EC50을 계산하였다.
시험 결과, SARS-CoV-2 WIV04 균주를 억제하는 화합물 2의 반수 유효 농도 EC50은 0.57 +/- 0.04 μM이고, SARS-CoV-2 B.1.351 균주를 억제하는 EC50은 0.73 +/- 0.06 μM인 것으로 나타났으며, EC50 곡선은 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같다.
실시예 25-2: SARS-CoV-2 Vero E6 오리지널 균주(WIV04), 델타 균주(B.1.617.2), 오미크론 균주(B.1.1.529)의 세포 수준에 대한 화합물 2의 억제 작용
실험 목적: 본 시험은 Vero E6 세포에서 정량 실시간 PCR법으로 배양 상층액 중 바이러스 카피수를 검출하는 방법을 통해 세포에서 SARS-CoV-2 오리지널 균주(WIV04 균주), 델타 균주(B.1.617.2) 및 오미크론 균주(B.1.1.529)의 복제에 대한 화합물 2의 억제 활성을 연구하였다. Vero E6 세포는 유출 수송체 P-gp를 고발현하므로, 0.5 μM의 P-gp 억제제 CP-100356을 첨가하여 화합물과 공배양하였다.
실험 재료:
Vero E6은 ATCC (물품번호 CRL-1586)에서 구입하였고, SARS-CoV-2 오리지널 균주(SARS-CoV-2-WIV04 균주), 델타 균주(B.1.617.2), 오미크론 균주((B.1.1.529) 바이러스는 중국과학원 우한 바이러스 연구소 미생물 박테리아(바이러스) 종 보존센터에서 유래하였다.
다른 시약은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
실험 기기:
생물 안전 캐비닛(AC2-3S1, ESCO, 싱가포르)
이산화탄소 인큐베이터(Thermo Scientific HERAcell 150i, Thermo Scientific, 미국)
순수기(SHENYUAN SYS 초순수기, 청두)
StepOne Plus Real-time PCR system (4376600, ABI, 미국)
TC20™ 자동 세포계수기(1450102, BIO-RAD, 미국)
T100™ Thermal Cycler(1861096, BIO-RAD, 미국)
원심분리기(Micro21/21R Thermo Fisher, Thermo Scientific, 미국)
실험 단계:
트립신을 사용하여 Vero E6 세포를 분해하고 배지(90% DMEM, 10%소태아혈청)에 넣으며, 48웰 플레이트에 웰당 50000개의 세포로 접종하고, 밤새 배양하였다. 테스트할 화합물을 DMSO에 용해하여 40 mM의 모액을 제조하고, 추가적으로 0.5 μM의 Pgp 억제제를 포함하는 배지로 구배 희석하여 시험에 필요한 농도를 얻으며, 실험에서 테스트할 화합물의 최종농도 범위는 1 μM 내지 0.004 μM이다. 세포 상층액을 제거하고, 각 웰에 희석된 화합물(0.5 μM의 Pgp 억제제를 포함)을 첨가하며, 1시간 동안 배양하고, 생물안전 3등급(BSL-3) 실험실에서 상이한 SARS-CoV-2 균주를 첨가하며, 감염다중도(MOI)는 0.01 또는 0.001이고, 1시간 동안 배양한 후, 상층액을 제거하며, PBS로 세척하고, 희석된 화합물(0.5 μM의 Pgp 억제제를 포함)을 200 μL/웰로 첨가하며, 감염 24시간 또는 72시간 후 상층액을 수집하였다. 상층액 바이러스 RNA를 추출하고 정량 실시간 PCR을 이용하여 상층액 바이러스 카피수를 검출하며, 바이러스 카피수를 기준으로 화합물 억제율을 계산하고, GraphPad Prism 8을 이용하여 화합물의 IC50을 계산하였다.
세포독성 시험에서, Vero E6 세포를 분해하고 배지(90% DMEM, 10%소태아혈청)에 넣으며, 96웰 플레이트에 웰당 20000개의 세포로 접종하고, 밤새 배양하였다. 테스트할 화합물을 DMSO에 용해하여 40 mM의 모액을 제조하고, 추가적으로 배지 또는 0.5 μM의 Pgp 억제제를 포함하는 배지로 구배 희석하여 시험에 필요한 농도를 얻었으며, 실험에서 테스트할 화합물의 최종농도 범위는 500 μM 내지 1.95 μM이다. 96웰 플레이트에서 세포 상층액을 제거하고, 테스트할 화합물(단일 약물 또는 0.5 μM의 Pgp 억제제를 포함)의 배지를 100 μL/웰로 첨가하며, 24시간 동안 배양한 후, CCK8 검출 키트로 세포 활성을 검출하고, 억제율 및 반수 세포독성 농도(CC50)를 계산하였다.
시험 결과: 표 4 에 나타낸 바와 같이, P-gp 억제제 CP-100356와 병용한 후, 화합물 2는 Vero E6 세포에서 델타 균주의 복제를 용량 의존적으로 억제할 수 있고, IC50은 0.040 μM이다. P-gp 억제제와 병용한 화합물 2도 오리지널 균주에서 강력한 억제 작용을 발휘하였고, IC50은 0.027 μM이다. 또한, P-gp 억제제와 병용한 화합물 2는 Vero E6 세포에서 오미크론 균주의 복제를 현저히 억제할 수 있고, IC50은 0.12 μM이다. 화합물 2 단일 약물 및 P-gp 억제제와의 병용은 모두 Vero E6 세포 증식에 대해 현저한 세포독성을 나타내지 않고, CC50 > 500 μM이다.
Vero E6 세포에서 SARS-CoV-2 복제에 대한 P-gp 억제제와 병용한 화합물 2의 억제 작용
실험 화합물 2 + 0.5μM CP-100356
IC50 (μM) 선발지수 SI
SI = (CC50/IC50)
Vero E6 오리지널 균주
(WIV04)		 0.027
(평균값, n=2)		 > 18519
Vero E6 델타 균주(B.1.617.2) 0.040
(평균값, n=2)		 > 12500
Vero E6 오미크론 균주(B.1.1.529) 0.12 > 4167
Vero E6 단일 약물의 CC50 > 500 μM
P-gp 억제제와 병용한 Vero E6의 CC50 > 500 μM
실시예 26: hACE2-K18 형질전환 마우스에서 SARS-CoV-2 델타 균주에 대한 화합물 2의 생체 내 항바이러스 작용
실험 목적: 본 연구는 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)를 안정적으로 발현하는 K18 형질전환 마우스(K18-hACE2)에서 SARS-CoV-2 델타 균주에 대한 화합물 2의 항바이러스 활성을 평가하였다.
실험 재료:
7-8주령의 K18-hACE2 형질전환 마우스는 Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd.에서 구입하였다. SARS-CoV-2 델타 균주 바이러스는 중국과학원 우한 바이러스 연구소 미생물 박테리아(바이러스) 종 보존센터에서 유래되었다.
리토나비르는 Shanghai Desano Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.에서 구입하였다.
Vero E6 세포는 ATCC(물품번호 CRL-1586)에서 구입하였다.
다른 시약은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
실험 기기:
생물 안전 캐비닛(AC2-3S1, ESCO, 싱가포르)
이산화탄소 인큐베이터(Thermo Scientific HERAcell 150i, Thermo Scientific, 미국)
순수기(SHENYUAN SYS 초순수기, 청두)
StepOne Plus Real-time PCR system (4376600, ABI, 미국)
TC20™ 자동 세포계수기(1450102, BIO-RAD, 미국)
T100™ Thermal Cycler(1861096, BIO-RAD, 미국)
원심분리기(Micro21/21R Thermo Fisher, Thermo Scientific, 미국)
조직 분쇄기(JXFSTPRP-CL, SHANGHAI JINGXIN, 중국)
실험 단계: K18-hACE2 형질전환 마우스는 비강 점적 방식을 통해 SARS-CoV-2 델타 균주에 감염되었고, 이날은 0일째이다. 감염 2시간 후 위관 영양법을 사용하여 각각 용매, 50 mg/kg 또는 200 mg/kg의 화합물 2(50 mg/kg의 시토크롬 P450억제제 리토나비르와 병용)를 투여하고, BID를 2일(0일째에 1회 투여, 1일째에 2회 투여, 2일째에 1회 투여) 또는 4일(0일째에 1회 투여, 1일째, 2일째, 3일째에 각각 2회 투여)동안 투여하였다. 마우스의 체중 변화를 기록하고, 종료 시점에 폐 조직 및 뇌 조직을 수집하였다. 여기서, 왼쪽 폐를 포르말린으로 고정하고, 포매하며, 절편하고 H&E 염색하여 조직병리학 검사에 사용하였다. 오른쪽 폐 및 뇌 조직을 각각 두 부분으로 나누어, 한 부분은 분쇄한 후 균질액을 취하여 RNA를 추출하고 역전사를 진행하며, 정량 실시간 PCR을 통해 바이러스 카피수를 검출하였다. 다른 한 부분은 분쇠한 후 균질액을 취하여 플라크실험을 통해 바이러스 역가를 검출하였다. 플라크실험방법은 이하와 같다: 24웰 플레이트에 웰당 12000개의 세포로 Vero E6 세포를 접종하고, 밤새 배양하였다. 조직 균질액 원액을 DMEM배지에서 10배로 구배 희석하여 준비하였다. 세포 상층액을 제거하고, 희석된 조직 균질액을 첨가하여 1시간 동안 배양한 후, 상층액을 제거하며, 1%의 메틸셀룰로오스 나트륨 및 2%의 FBS를 포함하는 배지를 첨가하고, 4일 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고, 파라포름알데히드를 사용하여 고정한 후, 1%(w/v)의 크리스탈 바이올렛으로 염색하며, 각 웰의 플라스크 수를 통계하였다.
시험 결과: 표 5에 나타낸 바와 같이, 감염 2일 후 모델군(바이러스 평균 카피수는 9.19 ± 0.30 log10 Copies/g)과 비교하여, 리토나비르와 병용한 경우, 50 mg/kg 및 200 mg/kg의 화합물 2는 모두 폐부의 바이러스 양을 현저히 감소시켰고, 평균 카피수는 각각 7.66 ± 0.27 log10 Copies/g 및 6.79 ± 0.30 log10 Copies/g이며, 여기서 200 mg/kg의 투여량에서 바이러스 카피수의 감소 수준은 2.4 log10 Copies/g에 달한다. 감염 4일 후, 바이러스 카피수에 대한 화합물 2의 직속적인 억제 작용이 관찰되었다. 바이러스 역가의 경우, 도 3에 나태낸 바와 같이, 화합물 2의 현저한 억제 작용이 관찰되었고, 감염 2일 후, 200 mg/kg의 용량에서 바이러스 복제가 완전히 억제되었으며, 역가가 검출되지 않았고, 50 mg/kg에서 모델군과 비교하여, 바이러스 역가의 감소 폭이 3 log10 PFU/g을 초과하였으며, 감염 4일 후, 화합물 2는 바이러스 역가에 대한 지속적인 억제 작용을 나타냈다. 체중의 경우 도 4에 나타낸 바와 같이, 감염 4일 후, 모델군 마우스의 체중은 약 10% 감소한 반면, 화합물 2 투여군의 체중은 크게 감소하지 않았으므로, 화합물 2의 지속적인 투여는 유의한 독성을 나타내지 않았음을 보여준다. 발명자는 추가적으로 마우스 뇌에서 바이러스 양을 검출하고, 감염 2일 후, 각 그룹에서 유의한 감염이 발견되지 않았다. 감염 4일 후, 모델군과 비교하여, 화합물 2는 50 mg/kg 및 200 mg/kg의 용량에서 모두 마우스의 뇌 부분의 바이러스 카피수를 현저히 감소시킬 수 있고, 특히 200 mg/kg의 용량에서 뇌부의 바이러스 카피수는 감염되지 않은 정상군과 비슷하였다. 발명자는 추가적으로 감염 4일 후 뇌부의 바이러스 역가를 검출한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 모델군과 비교하여, 화합물 2는 두 용량에서 모두 바이러스 역가가 검출되지 않았으므로, 화합물 2의 강력한 억제 작용를 나타냈다. 또한, 폐부의 조직병리학적 분석 결과, 모델군과 비교하여, 화합물 2는 200 mg/kg의 용량에서 폐포 수축 또는 팽창 정도 및 폐포막 비후 정도를 감소시키는 등의 폐손상을 현저히 개선하였다.
감염 2일 및 4일 후 마우스의 폐부 및 뇌부의 바이러스 양(평균 값±SD)
그룹 별 폐 조직
(log10 Copies/g)		 뇌 조직
(log10 Copies/mg)
2일째 4일째 2일째 4일째
모델군 9.19 ± 0.30 9.35 ± 0.30 1.34 ± 0.78 7.17 ± 0.27
화합물 2-200 mg/kg +리토나비르-50 mg/kg 6.79 ± 0.30 7.48 ± 0.63 1.04 ± 0.24 0.99 ± 0.42
화합물 2-50 mg/kg +리토나비르-50 mg/kg 7.66 ± 0.27 7.88 ± 0.74 0.77 ± 0.20 2.88 ± 1.26
정상군 5.76 ± 0.32 6.27 ± 0.18 1.08 ± 0.06 1.08 ± 0.06
실시예 27: 키나아제에 대한 화합물 2의 선택성
실험 목적: KinaseProfile 실험 플랫폼에서 413가지의 키나아제에 대한 화합물 2의 억제 활성을 검출하여, 키나아제에 대한 화합물 2의 선택성을 연구하였다.
실험 재료:
Full Human Panel [10uM ATP] KinaseProfiler은 Eurofins사에서 제공하는 제품이고, 물품번호가 50-005KP10이며, 이 제품은 413개의 키나아제를 포함한다.
실험 단계:
Eurofins 표준 KinaseProfiler 분석 방법을 사용하고, 관련 표준 조작 절차에 따라 선택된 각 키나아제에 대해 화합물 테스트를 진행하였다. 단백질 키나아제는 방사선 방법을 사용하여 검출되었고, 지질 키나아제는 HTRF 방법을 사용하여 검출되었다. 실험에서 ATP 농도는 10 μM이다. 각 키나아제에 대한 상세한 정보는 Eurofins 웹사이트에서 얻을 수 있고, 웹사이트 주소는 이하와 같다: https://www.eurofinsdiscoveryservices.com/ catalogmanagement/viewItem/Full-Human-Panel-10-uM-ATP-KinaseProfiler/50-005KP10.
실험 결과: 413가지의 키나아제에 대해, 10 μM 농도에서 화합물 2의 억제율은 모두 30%미만이고, 유의한 억제 작용이 없으므로, 화합물 2는 선택성이 우수함을 보여준다.
실시예 28: 안전성 표적에 대한 화합물 2의 선택성
실험 목적: Safetyscan실험 플랫폼에서 47개의 안전성 관련 표적에 대한 화합물 2의 영향을 검출하였다.
실험 재료:
Safety47 Panel Dose Response SAFETYscan은 Eurofins회사에서 제공한 테스트 제품이고, 물품번호가 87-1003DR이다. 이 제품은 47개의 안전성 표적과 관련된78개의 테스트를 포함한다.
실험 단계:
47개의 안전성 표적과 관련된 78개의 테스트에 대해 사용된 실험 방법은 cAMP 실험, 칼슘 유동 실험, 호르몬 핵 수용체 실험, 키나아제 결합 실험, 효소 활성 실험, 신경전달물질 수송체 실험, 이온 채널 실험 및 수송체 실험을 포함한다. 각 실험의 구체적인 방법은 eurofins 웹사이트에서 얻을 수 있고, 웹사이트 주소는 이하와 같다: https://www.eurofinsdiscoveryservices.com/catalogmanagement/viewItem/Safety47-Panel-Dose-Response-SAFETYscan-DiscoveRX/87-1003DR.
실험 결과: 47개의 안전성 관련 표적에 대해, 화합물 2는 100 μM 농도에서 모두 유의한 억제 또는 활성화 작용이 없으므로(EC50 모두 100 μM를 초과), 화합물 2는 선택성이 우수함을 보여준다.
실시예 29: 화합물 2의 인간 혈장 단백질 결합 시험
실험 재료
인간 혈장은 BioIVT회사에서 구입하여, EDTA K2로 항응고 처리하고, -80°C에서 보관하였다. 96웰 평형 투석 플레이트는 HTDialysis LLC회사에서 구입하였다. 평형 투석막은 Gales Ferry회사에서 구입하였다.
실험 단계
초순수로 인산이나트륨 농도가 14.2 g/L및 염화나트륨 농도가 8.77 g/L인 염기성 용액을 제조하였고, 상기 염기성 용액은 4℃에서 7일 동안 보관할 수 있다. 초순수로 인산이수소나트륨 농도가 12.0 g/L 및 염화나트륨 농도가 8.77 g/L인 산성 용액을 제조하였고, 상기 산성 용액4℃에서 7일 동안 보관할 수 있다. 산성 용액으로 염기성 용액의 pH 값을 7.4로 적정하였고, 상기 완충액은 4℃에서 7일 동안 보관할 수 있다. 실험 당일 완충액 pH 값을 측정하여, 7.4 ± 0.1 범위를 초과하면 이의 pH 값을 조정하였다.
투석막을 초순수에 60분 동안 담궈서 막을 두 조각으로 분리한 후, 20%의 에탄올에 20분 동안 담그고, 마지막으로 투석에 사용되는 완충액으로 20분 동안 담궜다.
냉동 혈장을 실온에서 신속하게 해동하였다.
혈장을 4℃, 3,220g의 원심력에세 10분 동안 원심분리하여 혈전을 제거하고, 상층액을 새로운 원심분리 튜브에 수집하였다. 혈장의 pH 값을 측정 및 기록하였다.
10 mM의 시험물질의 DMSO 저장 용액을 제조하였다. 98 μL의 DMSO로 2 μL의 저장 용액(10 mM)을 희석하여 작업 용액(200 μM)을 얻었다. 3 μL의 작업 용액을 취하여, 597 μL의 인간 혈장을 첨가하였고, 최종농도는 1 μM(0.5%의 DMSO)이다. 충분히 균일하게 볼텍싱하였다.
투석막의 일측에 120 μL의 약물 함유 혈장 샘플을 첨가하고, 다른 일측에 동동한 부피의 투석액(인산염 완충액)을 첨가하였다. 실험은 이중 평형 실험이다. 투석 플레이트를 밀봉하고, 인큐베이터에 넣어 37℃, 5 % CO2, 약 100 rpm에서 6시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 밀봉막을 제거하고, 각 웰의 완충액 및 혈장 측에서 50 μL를 새로운 플레이트의 다른 웰에 피펫팅하였다.
인산염 완충액 샘플에 50 μL의 블랭크 혈장을 첨가하고, 혈장 샘플에 동등한 부피의 블랭크 인산염 완충액을 첨가하였다. 300 μL의 실온 담금질제(내부 표준 아세토니트릴(IS, 500 nM의 라베탈롤, 100 nM의 알프라졸람 및 2 μM의 케토프로펜))를 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 5분 동안 볼텍싱하였다. 4℃에서, 3220 g으로 30분 동안 원심분리하였다. 100 μL의 상층액을 새로운 플레이트로 옮겼다. 시험물질의 액체 질량 반응 신호 및 피크 모양에 따라, 100 μL 또는 200 μL의 물로 상층액을 희석하였다. 균일하게 혼합하고, 액체 크로마토그래피-질량검출기를 이용하여 샘플을 분석하였다.
모든 계산은 Microsoft Excel을 통해 진행되었다. 완충액 측 및 혈장 측에서 시험물질의 피크 면적을 결정하였다. 시험물질 및 대조 약물의 혈장 단백질 결합률을 계산하는 공식은 이하와 같다: 해리율 = (완충액 측의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율/혈장 측의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율)*100%, 결합률 = 1-해리율, 회수율=(완충액 측의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율+혈장 측의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율)/(초기 혈장 샘플의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율)*100%. 완충액 측의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율은 화합물의 해리 농도를 나타내고, 혈장 측의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율은 화합물의 해리 농도 및 결합 농도의 합을 나타내고, 초기 혈장 샘플의 내부 표준 피크 면적에 대한 샘플 피크 면적 비율은 샘플 배양을 시작할 때 화합물의 총 농도를 나타낸다.
시험 결과:
표 6에 나타낸 바와 같다. 1 μM의 화합물 2를 37℃에서 6시간 동안 배양한 경우, 평균 해리율은 46.63%이고, 결합률은 53.37%이며, 회수율은 88.02%이다.
화합물 2의 인간 혈장 단백질 결합 시험 결과
화합물 해리율(F%) 결합률(%) 회수율(%)
반복 1 반복 2 평균 값
화합물 2 48.71 44.55 46.63 53.37 88.02
실시예 30: 화합물 2를 단회 위관 영양한 조직 분포 시험
실험 재료:
총 60마리의 Balb/c 마우스(Shanghai Minchang Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)에서 절반은 수컷, 절반은 암컷이며, 체중은 18-25 g이다.
실험 단계:
Balb/c 마우스에게 화합물 2를 단회 위관 영양 투여하였고, 투여량은 100 mg/kg이며, 투여 부피는 10 mL/kg이다.
투여 전 및 투여 후 5 분, 0.25시간, 1.0시간, 2.0시간, 3.0시간, 5.0시간, 7.0시간 및 10시간(각 시점마다 6마리의 마우스, 절반은 수컷, 절반은 암컷임); 상기로 설정된 시점에 안구후정맥총에서 혈액 0.2 mL를 취하여, EDTA-K2 시험관에 넣고, 11000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하며 혈장을 분리하고, -70℃의 냉장고에서 냉동하였으며; 0.25시간, 1.0시간, 3.0시간 및 7.0시간 시점에서 전혈 채취 후 즉시 폐조직을 해부하여 채취하고, 차가운 생리식염수로 조직 표면에 남아있는 혈액 및 내용물을 깨끗히 ??어 내며, 흡입 건조 후 라벨링하여 -70℃에서 보관하여 테스트에 사용하였다. LC/MS-MS 방법으로 혈장 및 폐 조직 중 화합물 2의 함량을 측정하고, 폐-혈액 비율을 계산하였다.
시험 결과:
Balb/c 마우스에게 화합물 2를 단회 위관 영양 투여 후, 혈장 노출량에 대한 폐 조직의 노출량의 비율은0.62이고, 이는 폐 조직에서 화합물 2의 높은 노출량을 나타낸다.
실시예 31: 화합물 2의 위관 영양 투여가 사이노몰구스 원숭이 심혈관계에 미치는 영향에 대한 안전성 약리 시험
사이노몰구스 원숭이를 대상으로 한 2주 동안 반복 투여 독성 연구에서, 화합물 2가 심혈관계에 미치는 영향도 함께 조사하였다.
실험 재료:
사이노몰구스 원숭이는 32마리이고, 절반은 수컷, 절반은 암컷이며, 투여 시 연령은 2.5 - 5세이다.
동물 출처: Yunnan Yingmao Biotechnology Co., Ltd.; Guangxi Xiongsen Primate Experimental Animal Breeding and Development Co., Ltd.; Zhongke Lingrui (Zhanjiang) Biotechnology Co., Ltd..
스마트 비침습적 혈압계 BP-98E를 사용하여 깨어 있는 모든 동물의 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP) 및 평균 동맥 혈압(MBP)을 측정하고, Provantis/v10.2.3.1 전자 데이터 수집 시스템(PV-02)을 사용하였다.
실험 단계: 32마리의 사이노몰구스 원숭이(제1 그룹 및 제4 그룹 5마리 동물/성별/그룹, 제2 그룹 및 제3 그룹3마리 동물/성별/그룹, 총 4개 그룹)를 무작위로 그룹을 나누고, 비강 영양 투여를 통해 화합물 2(40, 160 및 600 mg/kg/일) 또는 대조 제제(98.9%의 용매 제제 + 1.1%의 MTBE, 0 mg/kg/일)를 14일 동안 1일 2회 투여하고, 투여 종료 후 14 일 동안 회복하였다. 투여가 ECG 매개변수(심박수, PR 간격, QRS 지속시간, QT 간격 및 QTcF를 포함) 및 투여 전, 투여기 및 회복기의 혈압에 미치는 영향을 평가하기 위해, 모든 동물을 본 연구에 포함시켰다.
시험 결과: 본 시험 조건에서, 사이노몰구스 원숭이에게 화합물 2(40, 160 및 600 mg/kg/day)를 비위관 영양법으로 14 일 동안 1일 2회 투여한 결과, 시험제품과 관련된 심혈관계 변화가 발견되지 않았고; 시험제품과 관련된 부정맥이 발견되지 않았으며; 전체 시험 과정에서 시험제품과 관련된 ECG 매개변수 또는 혈압의 변화가 발견되지 않았다.

Claims (12)

  1. 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서,

    I
    상기 식 I에서,
    R1은 -COR8 및 -SO2 R9로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, D, C1~C10 알킬, 아다만틸 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 3~8원 탄소 고리를 형성하며;
    X는 O, S, S(=O)2 및 S=O로부터 선택되고;
    Y는 부재 또는 O, S, S(=O)2 및 S=O로부터 선택되며;
    R4는 H, C1~C10 알킬, C3~C8 시클로알킬, C6~C20 아릴, C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, C1~C10 알콕시로 치환된 C6~C20 아릴 및 할로겐화 C6~C20 아릴로부터 선택되고;
    R5는 H, C1~C10 알킬 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나;
    또는, R4 와 R5가 서로 연결되어 공동으로 C2-C6 알킬렌을 형성함으로써, X와 Y를 연결하며;
    R6은 및 으로부터 선택되고;
    R7은 H 및 D로부터 선택되며;
    R8은 H, C1~C10 알킬, C1~C10 알콕시, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C10 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR13R14, C6~C20 아릴, 할로겐화 C6~C20 아릴, C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 할로겐화 C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 5~20원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~20원 헤테로아릴로부터 선택되고;
    R9는 C1~C10 알킬, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C10 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR15R16, C6~C20 아릴, 할로겐화 C6~C20 아릴, C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 할로겐화 C1~C10 알킬로 치환된 C6~C20 아릴, 5~20원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~20원 헤테로아릴로부터 선택되며;
    R13 및 R14는 각각 독립적으로 H 및 C1~C10 알킬로부터 선택되고;
    R15 및 R16은 각각 독립적으로 H 및 C1~C10 알킬로부터 선택되는 일반식 I로 표시되는 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, D, C1~C6 알킬, 아다만틸 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 3~8원 탄소 고리를 형성하거나; 또는
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 이소프로필, tert-부틸, 시클로펜틸 및 아다만틸로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로프로필 및 시클로펜틸을 형성하거나; 또는
    R2 및 R3 중 하나는 H로부터 선택되고, 다른 하나는 이소프로필, tert-부틸, 시클로펜틸 및 아다만틸로부터 선택되거나, 또는, R2 및 R3은 이들에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로프로필 및 시클로펜틸을 형성하는 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    R4는 H, C1~C6 알킬, C3~C8 시클로알킬, C6~C10 아릴, C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, C1~C6 알콕시로 치환된 C6~C10 아릴 및 할로겐화 C6~C10 아릴로부터 선택되고;
    R5는 H, C1~C6 알킬 및 C3~C7 시클로알킬로부터 선택되거나;
    또는, R4 와 R5가 서로 연결되어 공동으로 C2-C6 알킬렌을 형성함으로써, X와 Y를 연결하며; 또는, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2 및 CH2CH2CH2을 형성함으로써, X와 Y를 연결하는 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R8은 H, C1~C6 알킬, C1~C6 알콕시, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C6 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR13R14, C6~C10 아릴, 할로겐화 C6~C10 아릴, C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 5~10원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~10원 헤테로아릴로부터 선택되고, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H 및 C1~C6 알킬로부터 선택되거나; 또는
    R8은 C1~C6 알킬, 할로겐화 C1~C6 알킬, C1~C6 알콕시, -NR13R14, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, 페닐, 할로겐화 페닐, C1~C6 알킬로 치환된 페닐, 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 페닐 및 5~6원 헤테로아릴로부터 선택되고, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H 및 C1~C6 알킬로부터 선택되거나; 또는
    R8은 CH3, CF3, CH2CF3, CF2CF3, 메톡시, , , 시클로프로필, , 페닐, , , 및 피리딘-3-일로부터 선택되고;
    R9는 C1~C6 알킬, C3~C7 시클로알킬, 할로겐화 C1~C6 알킬, 할로겐화 C3~C7 시클로알킬, -NR15R16, C6~C10 아릴, 할로겐화 C6~C10 아릴, C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 C6~C10 아릴, 5~10원 헤테로아릴 및 할로겐화 5~10원 헤테로아릴로부터 선택되며, R15 및 R16은 각각 독립적으로 H 및 C1~C6 알킬로부터 선택되거나; 또는
    R9는 C1~C6 알킬, C3~C7 시클로알킬, 페닐, C1~C6 알킬로 치환된 페닐 및 할로겐화 C1~C6 알킬로 치환된 페닐로부터 선택되거나; 또는
    R9는 CH3, 시클로프로필, 페닐, p-메틸페닐 및 p-트리플루오로메틸페닐로부터 선택되는 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    X는 O, S, S(=O)2 및 S=O로부터 선택되고; Y는 부재 또는 O, S 및 S=O로부터 선택되며; R4는 C1~C6 알킬 및 C6~C10 아릴로부터 선택되고, R5는 H로부터 선택되거나; 또는, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 C2~C6 알킬렌을 형성함으로써, X와 Y를 연결하거나; 또는
    X, Y는 각각 독립적으로 O, S 및 S=O로부터 선택되고, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2 및 CH2CH2CH2을 형성함으로써, X와 Y를 연결하거나; 또는
    X, Y는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고, R4와 R5가 서로 연결되어 공동으로 CH2CH2을 형성함으로써, X와 Y를 연결하는 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 I로 표시되는 시아노 화합물은 일반식 IA로 표시되는 시아노 화합물로부터 선택되고,

    IA
    상기 식 IA에서, R1, R2, R3, R4, R5, X 및 Y는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    일반식 I로 표시되는 시아노 화합물은 하기 일반식으로 표시되는 시아노 화합물로부터 선택되고:


    또는
    상기 식에서, R1, R2, R3 및 R6은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제1항에 있어서,
    일반식 I로 표시되는 화합물은 하기 화합물로부터 선택되는 시아노 화합물 또는 이의 입체 이성질체, 중수소화물, 용매화물, 프로드러그, 대사산물, 약학적으로 허용 가능한 염 또는 공결정.
















  9. 일반식 I로 표시되는 화합물의 제조 방법으로서,
    상기 방법은 방법 i 및 방법 ii 중 하나이며,
    방법 i:

    ia) 식 II로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 축합 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻고;
    바람직하게는, 상기 단계 ia)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 축합제 및 염기의 작용을 통해 식 II로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 용매 중에서 0.1 - 12시간 동안 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻으며,
    선택적으로, 상기 용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 에틸아세테이트, 1,4-디옥산 중 하나 이상을 혼합한 것이고;
    선택적으로, 상기 축합제는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염, 1-하이드록시벤조트리아졸, 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 1-프로필포스폰산 무수물, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트, N,N’-카르보닐디이미다졸, O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
    선택적으로, 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, N-메틸모르폴린이고;
    ib) 식 IV로 표시되는 화합물을 탈수시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻으며;
    바람직하게는, 상기 단계 ib)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 식 IV로 표시되는 화합물과 탈수제를 무수용매 중에서 1 - 24시간 동안 반응시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻고;
    선택적으로, 상기 무수용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 메틸벤젠, 1,4-디옥산 및 피리딘 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
    선택적으로, 상기 탈수제는 트리플루오로아세트산 무수물 또는 N-(트리에틸암모늄 술포닐)메틸카바메이트이고; 또는
    방법 ii:

    iia) 식 V로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 축합시켜 식 VI로 표시되는 화합물을 얻되, 식 V로 표시되는 화합물 중의 PG는 아미노기의 보호기이며;
    바람직하게는, 상기 단계 iia)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 축합제 및 염기의 작용을 통해 식 V로 표시되는 화합물과 식 III로 표시되는 화합물을 용매 중에서 0.1 - 12시간 동안 반응시켜 식 VI로 표시되는 화합물을 얻고;
    선택적으로, 상기 용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 에틸아세테이트 및 1,4-디옥산 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
    선택적으로, 상기 축합제는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염, 1-하이드록시벤조트리아졸, 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 1-프로필포스폰산 무수물, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트, N,N’-카르보닐디이미다졸 및 O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트 중 하나 이상을 혼합한 것이고;
    선택적으로, 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린이고;
    선택적으로, 상기 아미노기의 보호기 PG는 tert-부톡시카르보닐, 벤질 및 p-메톡시벤질이고;
    iib) 식 VI로 표시되는 화합물을 탈보호하여 식 VII로 표시되는 화합물을 얻으며;
    바람직하게는, 상기 단계 iib)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 식 VI로 표시되는 화합물과 트리플루오로아세트산 또는 염화수소의 유기용액 또는 Pd/C/H2을 반응시켜 식 VII로 표시되는 화합물을 얻고;
    iic) 식 VII로 표시되는 화합물을 아미노아실화, 설포닐화 또는 축합 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻으며;
    바람직하게는, 상기 단계 iic)에서,
    -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 염기를 첨가한 조건에서 식 VII로 표시되는 화합물과 염화 아실 또는 산 무수물을 아미노아실화 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻고;
    -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 염기의 조건에서 식 VII로 표시되는 화합물과 염화술포닐 또는 설폰산 무수물을 설포닐화 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻으며;
    -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 축합제와 염기의 조건에서 식 VII로 표시되는 화합물과 카르복실 화합물을 축합 반응시켜 식 IV로 표시되는 화합물을 얻고;
    선택적으로, 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린이고;
    선택적으로, 상기 축합제는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N’,N’-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염, 1-하이드록시벤조트리아졸, 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드, 1-프로필포스폰산 무수물, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트, N,N’-카르보닐디이미다졸 및 O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트 중 하나 이상을 혼합한 것이고;
    iid) 식 IV로 표시되는 화합물을 탈수시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻으며;
    바람직하게는, 상기 단계 iid)에서, -20℃ ~ 50℃의 온도에서, 식 IV로 표시되는 화합물과 탈수제를 무수용매 중에서 1 - 24시간 동안 반응시켜 일반식 I로 표시되는 화합물을 얻고;
    선택적으로, 상기 무수용매는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 메틸벤젠, 1,4-디옥산 및 피리딘 중 하나 이상을 혼합한 것이며;
    선택적으로, 상기 탈수제는 트리플루오로아세트산 무수물 또는 N- (트리에틸암모늄 술포닐)메틸카바메이트이고;
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, X 및 Y는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 약학적 조성물로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 것, 및 약학적으로 허용가능한 보조재료를 포함하고; 선택적으로, 상기 약학적 조성물은 리토나비르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 더 포함하는 약학적 조성물.
  11. 약물 조합으로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 것, 및 리토나비르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약물 조합.
  12. 약물의 제조에서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 시아노 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 제10항 또는 제11항에 따른 약학적 조성물 또는 약물 조합의 용도로서, 상기 약물은 코로나바이러스 3CL 프로테아제 활성을 억제하기 위한 약물, 코로나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물, 피코르나바이러스의 3CL 프로테아제 활성을 억제하기 위한 약물, 및 피코르나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물로부터 선택되고; 선택적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, H229E-CoV, HKU1-CoV, NL63-CoV, OC43-CoV 및 SARS-CoV-2로부터 선택되는 용도.
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