CN108251479A - 一种玉米胚芽活性肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其具体步骤为：将向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水进行热处理得玉米胚芽粕混合液，调节其pH，依次加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，灭酶，离心上清液即为酶解液；将酶解液用超滤膜进行超滤，滤液冻干；用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，取离心上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，检测收集液在214nm处的吸光值A214，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽。有益效果为：本发明活性肽的制备方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的活性肽的抗氧化活性高。

Description

一种玉米胚芽活性肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，特别涉及一种玉米胚芽活性肽的制备方法。

背景技术

玉米是全球性主要粮食作物，其种植面积仅次于小麦、水稻。中国是玉米种植最广泛的国家之一，截止至2013年末，全国玉米种植面积已逾3.5千万公顷，年产量已逾2.1亿吨。我国作为玉米生产与消费大国，其主要的消费方式多为食用口粮、动物饲料和工业加工原料。近年来，随着玉米产量的连年增加和相关科技的迅猛发展，我国玉米消费结构由原来的饲料消费主导型逐步转型为精深加工先导型。目前我国的玉米深加工产品主要分为淀粉、淀粉糖和酒精等8个系列，其中用于生产淀粉和酒精的原料约占玉米总深加工消耗量80%以上。而玉米胚芽正是玉米淀粉和酒精等生产加工过程中主要副产品，故就玉米胚芽的综合开发对玉米作物的精深加工乃至整个食品行业的进一步深度化、立体化发展都有极好的经济和社会效益。

目前我国对玉米胚芽的加工利用还相当有限，学者们对其研究也主要集中在对玉米胚芽油的提取工艺上，而对后续产品的深度开发力度却较为薄弱，整个行业的产业链条不够完善，产业规模化程度不足，造成资源能源的极大浪费，同时也限制了玉米精深加工的经济化发展。因此，延长玉米深加工产业链条，加大对玉米胚芽后续副产品的开发是极其重要的。米胚芽是一种优质的蛋白资源，其蛋白含量平均在24.3%以上，仅次于黄豆和青豆等高蛋白植物种子。在植物蛋白资源缺乏的今天，必须采取积极有效的措施加强玉米胚芽粕的综合研究利用，将廉价的玉米胚芽转化为优质生物活性成分具有很大的社会、经济效益。但是玉米蛋白中含有高比例的亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，致使其水溶性差，难以被人们直接消化、利用。而这种独特的氨基酸组成却使玉米蛋白成为制备抗氧化活性肽的良好来源。

现有技术如授权公告号为CN103409487 B的中国发明专利，公开了一种玉米胚芽活性成分的提取方法，包括以下步骤：亚临界萃取玉米油-胚芽饼破壁-盐法提取球蛋白-酶解提取玉米胚芽生物活性肽。该制备方法充分保护并利用了玉米胚芽中的有效活性成分，并在此基础上充分利用玉米胚芽蛋白制备生物活性肽，实现了玉米深加工过程中的副产品有效增值，社会效益和经济效益均十分显著。但是该提取方法采用玉米胚芽为直接原料，需要去除油脂，且活性肽的提取率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的活性肽的抗氧化活性高的玉米胚芽活性肽的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种玉米胚芽活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

预处理：将玉米胚芽粕粉碎，过80-120目筛，然后按料液比为1:15-25（g/mL）向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，然后在95-110℃下热处理5-10min，冷却至室温，即得玉米胚芽粕混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.02-0.03mM牛磺酸和0.01-0.03mM氨基脲，牛磺酸和氨基脲能够协助加热破坏维持蛋白质高级结构的次级键和二硫键，可使球蛋白分子的致密结构展开，同时能解离蛋白的亚基，增加酶和酶切位点的接近机会，提高酶的活性，进而提高活性肽的得率，此外，牛磺酸和氨基脲的存在能够提高蛋白中β-折叠结构提高蛋白对酶的敏感性，最终可使酶解产物水解度大大提高，该步骤通过预处理改变蛋白质的空间结构，蛋白结构变得稀疏，柔化蛋白质刚性结构，使部分弱键断裂，内部非极性基团暴露到分子表面，增大了酶的接触位点，有助酶发挥作用，提高酶水解蛋白质的效率，同时还能去除与目标产物无关的物质，如油脂、小分子水溶性物质、微量元素等，进而提高酶解液的纯度；

酶解：将玉米胚芽粕混合液的pH调节至9.0-10.0，按加酶量为4-6%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在45-55℃的条件下酶解2-4h，再按加酶量为2-4%（w/w）加入风味蛋白酶，混合均匀后在45-55℃的条件下酶解3-5h，然后置于沸水中灭酶8-15min，再在4000-6000r/min的条件下离心15-25min，上清液即为酶解液，变性后的玉米胚芽蛋白主要为不溶性蛋白，在不溶性底物蛋白的酶水解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解稀疏结合的不溶性蛋白上的聚合肽，然后再慢慢水解中心的肽键，酶解彻底，明显提高酶解液中活性肽的含量，且该步骤采用双酶分步水解玉米胚芽粕，效果优于单酶水解，提高水解效率和活性肽的抗氧化活性；

超滤：将酶解液用8-12kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用5-8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在14000-16000r/min的条件下离心8-15min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.4-0.6mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽，该活性肽的肽链末端带有甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH·能力，抗油脂氧化能力和还原力，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明活性肽的制备方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的活性肽的抗氧化活性高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；2）本发明预处理步骤可使球蛋白分子的致密结构展开，解离蛋白的亚基，增加酶和酶切位点的接近机会，提高酶的活性，提高活性肽的得率，且能提高蛋白中β-折叠结构提高蛋白对酶的敏感性，最终提高酶解产物的水解度；3）本发明采用双酶分步水解玉米胚芽粕，效果优于单酶水解，提高水解效率和活性肽的抗氧化活性；4）本发明制得的活性肽具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH·能力，抗油脂氧化能力和还原力，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种玉米胚芽活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：将玉米胚芽粕粉碎，过120目筛，然后按料液比为1:15（g/mL）向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，然后在110℃下热处理5min，冷却至室温，即得玉米胚芽粕混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.03mM牛磺酸和0.01mM氨基脲，牛磺酸和氨基脲能够协助加热破坏维持蛋白质高级结构的次级键和二硫键，可使球蛋白分子的致密结构展开，同时能解离蛋白的亚基，增加酶和酶切位点的接近机会，提高酶的活性，进而提高活性肽的得率，此外，牛磺酸和氨基脲的存在能够提高蛋白中β-折叠结构提高蛋白对酶的敏感性，最终可使酶解产物水解度大大提高，该步骤通过预处理改变蛋白质的空间结构，蛋白结构变得稀疏，柔化蛋白质刚性结构，使部分弱键断裂，内部非极性基团暴露到分子表面，增大了酶的接触位点，有助酶发挥作用，提高酶水解蛋白质的效率，同时还能去除与目标产物无关的物质，如油脂、小分子水溶性物质、微量元素等，进而提高酶解液的纯度；

2）酶解：将玉米胚芽粕混合液的pH调节至10.0，按加酶量为4%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在55℃的条件下酶解2h，再按加酶量为4%（w/w）加入风味蛋白酶，混合均匀后在45℃的条件下酶解5h，然后置于沸水中灭酶8min，再在6000r/min的条件下离心15min，上清液即为酶解液，变性后的玉米胚芽蛋白主要为不溶性蛋白，在不溶性底物蛋白的酶水解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解稀疏结合的不溶性蛋白上的聚合肽，然后再慢慢水解中心的肽键，酶解彻底，明显提高酶解液中活性肽的含量，且该步骤采用双酶分步水解玉米胚芽粕，效果优于单酶水解，提高水解效率和活性肽的抗氧化活性；

3）超滤：将酶解液用12kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用5kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

4）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在16000r/min的条件下离心8min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.6mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽，其抗氧化活性为302.18U/mL，该活性肽的肽链末端带有甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH·能力，抗油脂氧化能力和还原力，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

实施例2：

一种玉米胚芽活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：将玉米胚芽粕粉碎，过80目筛，然后按料液比为1:25（g/mL）向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，然后在95℃下热处理10min，冷却至室温，即得玉米胚芽粕混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.02mM牛磺酸和0.03mM氨基脲；

2）酶解：将玉米胚芽粕混合液的pH调节至9.0，按加酶量为6%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在45℃的条件下酶解4h，再按加酶量为2%（w/w）加入风味蛋白酶，混合均匀后在55℃的条件下酶解3h，然后置于沸水中灭酶15min，再在4000r/min的条件下离心25min，上清液即为酶解液；

3）超滤：将酶解液用8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

4）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在14000r/min的条件下离心15min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.4mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽，其抗氧化活性为312.72U/mL。

实施例3：

一种玉米胚芽活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：将玉米胚芽粕粉碎，过100目筛，然后按料液比为1:20（g/mL）向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，然后在100℃下热处理8min，冷却至室温，即得玉米胚芽粕混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.025mM牛磺酸和0.02mM氨基脲；

2）酶解：将玉米胚芽粕混合液的pH调节至9.5，按加酶量为5%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在50℃的条件下酶解3h，再按加酶量为3%（w/w）加入风味蛋白酶，混合均匀后在50℃的条件下酶解4h，然后置于沸水中灭酶10min，再在5000r/min的条件下离心20min，上清液即为酶解液；

3）超滤：将酶解液用10kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用6kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

4）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在15000r/min的条件下离心12min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.5mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽，其抗氧化活性为352.65U/mL。

实施例4：

一种玉米胚芽活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：将玉米胚芽粕粉碎，过100目筛，然后按料液比为1:20（g/mL）向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，然后在100℃下热处理8min，冷却至室温，即得玉米胚芽粕混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.025mM牛磺酸和0.02mM氨基脲；

2）酶解：将玉米胚芽粕混合液的pH调节至9.5，按加酶量为5%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在50℃的条件下酶解3h，再按加酶量为3%（w/w）加入风味蛋白酶和风味蛋白酶重量0.035%的酪氨酸，混合均匀后在50℃的条件下酶解4h，然后置于沸水中灭酶10min，再在5000r/min的条件下离心20min，上清液即为酶解液，上述酪氨酸中含有0.42%的右旋酪氨酸，该酪氨酸能协助酶快速将疏水性氨基酸从蛋白质或肽的末端切除，且使得酶解产物中的亲水性基团暴露出来，进而快速溶于水中，避免酶解产物积累而对酶产生竞争性抑制性，使得酶解过程中能够一直保持较高的酶解速率进行酶解，同时可避免游离的肽段又重新聚合，提高酶解效率，且可避免玉米胚芽蛋白过分水解而产生苦味，提高活性肽的口感；

3）超滤：将酶解液用10kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用6kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

4）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在15000r/min的条件下离心12min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.5mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽，其抗氧化活性为358.97U/mL。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种玉米胚芽活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、超滤、分离纯化，其特征在于：所述预处理步骤为：将玉米胚芽粕粉碎，过筛，向玉米胚芽粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，热处理，冷却至室温，即得玉米胚芽粕混合液，所述蒸馏水中含有牛磺酸和氨基脲。

2.根据权利要求1所述的一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其特征在于：所述玉米胚芽粕粉和蒸馏水的料液比为1:15-25（g/mL），热处理温度为95-110℃、时间为5-10min。

3.根据权利要求1所述的一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其特征在于：所述蒸馏水中含有0.02-0.03mM牛磺酸和0.01-0.03mM氨基脲。

4.根据权利要求1所述的一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤为：将玉米胚芽粕混合液的pH调节至9.0-10.0，加入碱性蛋白酶，酶解，再加入风味蛋白酶，酶解，灭酶，离心，上清液即为酶解液。

5.根据权利要求4所述的一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶的加酶量为4-6%（w/w），所述风味蛋白酶的加酶量为2-4%（w/w）。

6.根据权利要求1所述的一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其特征在于：所述超滤步骤为：将酶解液用8-12kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用5-8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用。

7.根据权利要求1所述的一种玉米胚芽活性肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化步骤为：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，离心，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.4-0.6mL/min，检测收集液在214nm处的吸光值A214，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得玉米胚芽活性肽。

8.根据权利要求1至7任一项所述方法制备的玉米胚芽活性肽作为产品或原料可应用于食品、医药、保健品领域。