CN108186656B - 一种升麻及其提取物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种升麻及其提取物的新用途。本发明发现升麻、升麻的醇提取物及升麻乙酸乙酯相萃取物具有显著的减肥降糖作用，并且明确了升麻乙酸乙酯相萃取物中的天然化合物黄肉楠碱具有减肥降糖功效。黄肉楠碱属于9,19‑环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物。动物实验证明，黄肉楠碱不仅能够预防高脂饮食诱导肥胖的形成，而且还能治疗已经由高脂饮食诱导形成的肥胖并同时改善肥胖相关的糖不耐受、胰岛素抵抗和肝功能损伤。升麻、升麻的醇提取物、升麻乙酸乙酯相萃取物以及黄肉楠碱可用于制备减肥降糖且保肝的药物或保健品。
Description
技术领域
本发明属于中药药物及保健品技术领域，具体涉及升麻、升麻的醇提取物、升麻的乙酸乙酯相萃取物及其中的天然化合物黄肉楠碱的减肥降糖功效。
背景技术
超重和肥胖已成为一个全球性的健康问题并呈现出快速增长的趋势。高热量饮食以及久坐不动的生活方式被认为是肥胖患病率升高的主要原因。肥胖相关的代谢疾病如胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化和血脂异常等日益成为危害人类健康的重要因素，但是目前却缺少具有明确功效和低毒副作用的化学合成药物。因此，了解肥胖及相关代谢疾病的形成机制，寻找天然抗肥胖活性物质是改善肥胖及其相关代谢疾病的有效途径。
升麻在我国应用年代久远，资源丰富，具有发表透疹，清热解毒，升举阳气的功能，被我国卫生部列为可以用于保健食品的中药。现代药理研究发现升麻具有治疗妇女更年期综合征，抗骨质疏松，抗病毒，抗肿瘤，降血脂等作用。但目前研究最多最为深入的是原产于北美东部的总状升麻(黑升麻),而对于亚洲产升麻在许多活性方面的研究还几乎是空白。
黄肉楠碱(英文名称为Actein)属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，是一种重要的天然医药原料。国内外以往的研究报道中，黄肉楠碱具有抑制乳腺癌细胞增殖，抗HIV,改善骨质增生等功效，然而，黄肉楠碱对小鼠饮食诱导肥胖的影响仍未见直接系统性报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自升麻的化合物的减肥降糖新用途，来自升麻的化合物为黄肉楠碱。
黄肉楠碱属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，其CAS号为18642-44-9,分子式C37H56O11，分子量676.83，熔点246-250℃，结构式如下：
所述化合物黄肉楠碱在制备减肥降糖药物或保健品中的应用。
推荐临床给药途径：口服治疗。
口服给药拟推荐临床剂量范围为：0.081mg/kg～0.405mg/kg。
本发明的第二个目的是提供一种升麻提取物的新用途，所述升麻提取物为升麻乙酸乙酯相萃取物，所述升麻乙酸乙酯相萃取物中具有减肥降糖功效的化合物的质量含量为2-12％，所述具有减肥降糖功效的化合物为黄肉楠碱，黄肉楠碱属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，分子式C37H56O11，分子量676.83，熔点246-250℃，结构式如下：
所述升麻乙酸乙酯相萃取物在制备减肥降糖药物或保健品中的应用。
乙酸乙酯相萃取物口服给药拟推荐临床剂量为：0.81mg/kg。
本发明的第三个目的是提供一种升麻提取物的新用途，所述升麻提取物为升麻醇提取物。所述升麻的醇提取物可以为不同比例(50％-100％)的甲醇/水或不同比例(50％-100％)的乙醇/水提取物。所述升麻醇提取物中具有质量含量为0.1-1.8％的黄肉楠碱，黄肉楠碱属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，分子式C37H56O11，分子量676.83，熔点246-250℃，结构式如下：
所述升麻醇提取物在制备减肥降糖药物或保健品中的应用。
升麻醇提取物口服给药拟推荐临床剂量2.495mg/kg。
本发明的第四个目的是提供一种升麻的新用途，所述升麻中具有质量含量为0.04-0.2％的黄肉楠碱，黄肉楠碱属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，分子式C37H56O11，分子量676.83，熔点246-250℃，结构式如下：
所述升麻在制备减肥降糖保健品中的应用。
升麻口服给药拟推荐临床剂量为：12.15mg/kg。
本发明明确了亚洲产升麻，升麻根茎粉末经80％甲醇提取得到的粗提物以及升麻乙酸乙酯相萃取物的减肥降糖作用。通过对升麻乙酸乙酯相萃取物中的天然活性化合物黄肉楠碱进行小鼠实验发现黄肉楠碱不仅能够预防小鼠高脂饮食诱导的肥胖，还能治疗已经由高脂饮食诱导成肥胖的小鼠，同时改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。
本发明的有益技术效果：
1.高脂饮食中添加升麻能够显著降低小鼠体重及肝脏脂质沉积，并改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。相对于高脂组，高脂添加0.15％升麻组小鼠体重降低了12.87％，P值＜0.001，组间差异高度显著。
2.高脂饮食中添加升麻醇提取物能够显著降低小鼠体重及肝脏脂质沉积，并改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。相对于高脂组，高脂添加0.03％升麻醇提取物组小鼠体重降低了25.43％，P值＜0.001，组间差异高度显著。
3.高脂饮食中添加升麻乙酸乙酯相萃取物能够显著降低小鼠体重及肝脏脂质沉积，并改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。相对于高脂组，高脂添加0.01％乙酸乙酯相萃取物组小鼠体重降低了29.74％，P值＜0.001，组间差异高度显著。
4.高脂饮食中添加黄肉楠碱能够显著降低小鼠体重及肝脏脂质沉积，并改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。相对于高脂组，高脂添加0.001％黄肉楠碱组小鼠体重降低了22.77％，P值＜0.001，组间差异高度显著，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠体重降低了23.38％，P值＜0.001，组间差异高度显著。
5.对于已经由高脂饮食诱导成肥胖模型的小鼠，高脂饮食中添加黄肉楠碱也能够显著降低小鼠体重及肝脏脂质沉积，并改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。相对于高脂组，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠体重降低了15.81％，P值＜0.001，组间差异高度显著。表明黄肉楠碱不仅能够预防肥胖的形成还能有效治疗已经由高脂饮食诱导成的肥胖。
6.血清ALT,AST测定结果显示，升麻，升麻醇提取物，升麻乙酸乙酯相萃取物及黄肉楠碱处理组小鼠的ALT值相对于高脂组小鼠均显著降低，且AST值也有不同程度的降低，高脂饮食中添加升麻，升麻醇提取物，升麻乙酸乙酯相萃取物及黄肉楠碱均能够改善肝功能。提示升麻及其提取物可以作为有效且保肝的减肥降糖药物或保健品长期服用。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面将用升麻及其提取物分别对高脂饮食小鼠的影响的实验结果来说明其具有减肥降糖的药用价值。
1.研究方法
1.1实验动物
3周龄C57BL/6雄性小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，于合肥工业大学SPF级动物房饲养，自由进食和饮水，动物房温度和湿度分别维持于25℃和40％,光照周期为12h光照/12h黑暗。
1.2实验药物
低脂饲料配方参照Research Diets D12450B，10％能量源于脂肪；高脂饲料配方参照Research Diets D12451 45％能量源于脂肪。0.15％的升麻根茎，0.03％的升麻醇提取物，0.01％的乙酸乙酯萃取物，0.001％和0.005％的黄肉楠碱按照重量比(wt/wt)分别添加到高脂饲料中。饲料成型后经真空辐照，于4℃冰箱储存。
黄肉楠碱属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，其CAS号为18642-44-9,分子式C37H56O11，分子量676.83，熔点246-250℃，结构式如下：
1.3行为学实验方法
(1)在考察升麻对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，5周龄小鼠随机分为3组，每组12只且各组间小鼠平均体重无差别，分别给予低脂，高脂或高脂添加0.15％升麻饮食处理12周。
(2)在考察升麻醇提取物对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，5周龄小鼠随机分为3组，每组12只且各组间小鼠平均体重无差别，分别给于低脂，高脂或高脂添加0.03％升麻醇提取物饮食处理12周。
(3)在考察升麻乙酸乙酯相萃取物对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，5周龄小鼠随机分为3组，每组12只且各组间小鼠平均体重无差别，分别给予低脂，高脂，高脂添加0.01％乙酸乙酯相萃取物饮食处理12周。
(4)在考察黄肉楠碱对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，5周龄小鼠随机分为4组，每组12只且各组间小鼠平均体重无差别，分别给予低脂，高脂，高脂添加0.001％黄肉楠碱或高脂添加0.005％黄肉楠碱饮食处理12周。
(5)在考察黄肉楠碱对已经由高脂饮食诱导成肥胖小鼠的影响实验部分，5周龄小鼠经高脂饮食喂养12周后随机分为4组，每组12只且各组间小鼠平均体重无差别，分别给予低脂，低脂添加0.005％黄肉楠碱，高脂或高脂添加0.005％黄肉楠碱饮食处理8周。
每周检测小鼠的体重、饮食摄入量，喂养阶段完成后，小鼠禁食过夜，然后通过CO2处死，心脏取血，收取小鼠脂肪组组(包括EAT、SAT、BAT)和肝脏(Liver)，称重后一部分用甲醛固定，一部分储存于-80℃备用。
1.4GTT和ITT实验
(1)GTT实验前小鼠禁食12小时，ITT实验前小鼠禁食6小时。
(2)用灭菌的生理盐水稀释葡萄糖和胰岛素注射液，葡萄糖稀释到0.05g/mL，胰岛素稀释到0.8IU/mL。
(3)通过称小鼠体重来计算葡萄糖(1g/kg体重)或者胰岛素(1.5IU/kg体重)的注射剂量。
(4)剪小鼠鼠尾末端获得小鼠血样，使用血糖仪测量注射前小鼠空腹血糖浓度。
(5)腹腔注射葡萄糖或者胰岛素。
(6)测量注射葡萄糖或者胰岛素后15min,30min,45min,60min,90min,120min时小鼠血糖浓度。
1.5组织脱水包埋切片
(1)组织固定：将小鼠EAT、SAT、BAT和Liver置于4％的甲醛溶液中室温固定24h以上。
(2)组织脱水：将固定好的组织样本放入脱水盒中，流水冲洗过夜后，放于组织脱水机中按照设定的脱水程序进行脱水。
EAT、SAT脱水程序如下：
70％乙醇(2h)→80％乙醇(2h)→90％乙醇(2h)→95％乙醇Ⅰ(2h)→95％乙醇Ⅱ(2h)→100％乙醇Ⅰ(2h)→100％乙醇Ⅱ(2h)→二甲苯Ⅰ(40min)→二甲苯Ⅱ(40min)→石蜡Ⅰ(1h)→石蜡Ⅱ(1h)→石蜡Ⅲ(2h)
BAT、Liver脱水程序如下：
70％乙醇(1.5h)→80％乙醇(1.5h)→90％乙醇(1.5h)→95％乙醇Ⅰ(1.5h)→95％乙醇Ⅱ(1.5h)→100％乙醇Ⅰ(1.5h)→100％乙醇Ⅱ(1.5h)→二甲苯Ⅰ(30min)→二甲苯Ⅱ(30min)→石蜡Ⅰ(40min)→石蜡Ⅱ(40min)→石蜡Ⅲ(1h)
(3)组织包埋：将脱水后的组织放入包埋框中进行石蜡包埋，在石蜡未完全凝固时贴上标签，自然冷却。
(4)组织切片：各脂肪组织以5μm厚度进行连续切片，将切片放入40℃水中进行漂片，待切片完全展开后用载玻片轻轻捞起，晾干后70℃烤片20分钟，置于组织切片盒中备用。
1.6H&E染色
(1)脱蜡：将石蜡切片依次放入100％二甲苯Ⅰ、100％二甲苯Ⅱ中各15min，再放入二甲苯与乙醇1:1混合液中5min，进行脱蜡。
(2)复水：脱蜡后的组织切片按100％乙醇Ⅰ(10min)→100％乙醇Ⅱ(10min)→95％乙醇(5min)→85％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)→50％乙醇(5min)的顺序进行复水。
(3)复水后的切片放入蒸馏水中在摇床上摇洗5min。
(4)染色：切片浸入苏木精染料中染色1h，流水冲洗后于42℃水浴中反蓝5min。
(5)将切片放入0.2％伊红酒精染液中染色1min，再用95％乙醇分色10s。
(6)分色后的切片迅速放于蒸馏水摇洗3次，每次5min。
(7)晾干：将切片置于室温下自然晾干。
(8)透明：切片浸入二甲苯中透明5min.
(9)封片：中性树胶封片后放入70℃烘箱内烘干。
(10)镜检：于光学显微镜下观察组织形态，并于200倍视野下拍摄照片。
1.7血清中ALT,AST测定
(1)通过心脏取血方式采集小鼠新鲜血液至1.5mL EP管中，于4℃静置过夜。
(2)5000g，4℃离心15min后吸取上清液即为小鼠血清。
(3)取50μL血清加150μL生理盐水稀释混匀后置于冰上待测。
(4)采用全自动生化分析仪检测样品的ALT,AST。
1.8统计学分析
所有的数据都是用平均值±标准误来表示。在小鼠研究中由于我们的动物样本属于小样本和非正态分布，两组之间的显著性比较采用Mann-Whitney U检验；细胞实验分析利用t检验进行统计学分析，统计学软件为SPSS 16.0。当p<0.05视为具有显著性差异。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
2.研究结果
(1)在考察升麻对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，经过12周不同饮食喂养，低脂组小鼠平均体重达到34.62±1.11g，高脂组平均体重达到48.56±0.65g，高脂添加0.15％升麻组体重为42.31±1.10g。相对于高脂组，高脂添加0.15％升麻组小鼠体重降低了12.87％，P值＜0.001，组间差异高度显著。高脂饮食中添加升麻根茎干粉能够在不影响小鼠能量摄入的情况下显著降低小鼠体重，减少脂肪组织及肝脏中的脂质沉积，并改善糖不耐受和胰岛素抵抗。
(2)在考察升麻醇提取物对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，经过12周不同饮食喂养，低脂组小鼠平均体重达到33.55±1.35g，高脂组平均体重达到47.26±0.85g，高脂添加0.03％升麻醇提取物组体重为35.24±0.75g。相对于高脂组，高脂添加0.03％升麻醇提取物组小鼠体重降低了25.43％，P值＜0.001，组间差异高度显著。升麻醇提取物能够在不影响小鼠能量摄入的情况下显著降低小鼠体重，减少脂肪组织及肝脏中的脂质沉积，并改善糖不耐受和胰岛素抵抗。
(3)在考察升麻乙酸乙酯相萃取物对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，经过12周不同饮食喂养，低脂组小鼠平均体重达到30.40±0.68g，高脂组平均体重达到44.18±1.16g，高脂添加0.01％乙酸乙酯相萃取物组小鼠平均体重为31.04±0.98g，相对于高脂组，高脂添加0.01％乙酸乙酯相萃取物组小鼠体重降低了29.74％，P值＜0.001，组间差异高度显著。乙酸乙酯相萃取物能够有效降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠体重，减少脂肪组织及肝脏中的脂质沉积，并改善糖不耐受和胰岛素抵抗。
(4)在考察黄肉楠碱对小鼠高脂饮食诱导肥胖的影响实验部分，经过12周不同饮食喂养，低脂组小鼠平均体重达到30.47g±0.76g，高脂组平均体重达到45.80±0.73g，高脂添加0.001％黄肉楠碱组小鼠平均体重为35.37g±1.34g，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠平均体重为35.09±1.04g。相对于高脂组，高脂添加0.001％黄肉楠碱组小鼠体重降低了22.77％，P值＜0.001，组间差异高度显著，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠体重降低了23.38％，P值＜0.001，组间差异高度显著。动物实验结果表明高脂饮食中添加黄肉楠碱确实能够显著降低小鼠体重，减少脂肪组织及肝脏中的脂质沉积，改善糖耐受和胰岛素抵抗，并且对小鼠能量摄入没有显著影响。
(5)在考察黄肉楠碱对已经由高脂饮食诱导成肥胖小鼠的影响实验部分，5周龄小鼠经高脂饮食喂养12周后小鼠平均体重达到46.33±1.40g。随后将诱导成肥胖模型的小鼠随机分为4组，每组12只且各组间小鼠平均体重无差别。分别给予低脂，低脂添加0.005％黄肉楠碱，高脂或高脂添加0.005％黄肉楠碱饮食喂养8周后，低脂组小鼠平均体重为33.54±0.68g，低脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠平均体重为30.57±0.61g，高脂组平均体重为52.70±0.48g，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠平均体重为44.37±1.03g。相对于低脂组，低脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠体重降低了8.86％，P值＜0.01，组间差异较显著。相对于高脂组，高脂添加低脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠体重降低了15.81％，P值＜0.001，组间差异高度显著。对于已经由高脂饮食喂养12周诱导成肥胖的小鼠，饮食中添加黄肉楠碱能显著降低小鼠体重及肝脏脂质沉积，改善糖不耐受和胰岛素抵抗。这些结果表明，黄肉楠碱不仅能够预防高脂饮食诱导的肥胖，还能有效治疗肥胖并改善糖代谢。
(6)血清ALT，AST测定结果显示，低脂组小鼠血清ALT平均值为42.32±1.31IU/L,高脂组小鼠血清ALT平均值为67.05±5.70IU/L，高脂添加0.15％升麻组小鼠血清ALT平均值为36±1.79IU/L，高脂添加0.03％升麻醇提取物组小鼠血清ALT平均值为41.78±4.12IU/L，高脂添加0.01％乙酸乙酯相萃取物组小鼠血清ALT平均值为36±2IU/L，高脂添加0.001％黄肉楠碱组小鼠血清ALT平均值为37.33±1.33IU/L，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠血清ALT平均值为40.8±3.2IU/L。低脂组小鼠血清AST平均值为85.6±7.93IU/L,高脂组小鼠血清AST平均值为116.63±11.07IU/L，高脂添加0.15％升麻组小鼠血清AST平均值为80±3.04IU/L，高脂添加0.03％升麻醇提取物组小鼠血清AST平均值为98.67±11.67IU/L，高脂添加0.01％乙酸乙酯相萃取物组小鼠血清AST平均值为71.5±5.26IU/L，高脂添加0.001％黄肉楠碱组小鼠血清AST平均值为101.78±9.07IU/L，高脂添加0.005％黄肉楠碱组小鼠血清AST平均值为100±6.25IU/L。数据分析结果表明，升麻，升麻醇提取物，升麻乙酸乙酯相萃取物以及黄肉楠碱处理组小鼠的ALT值相对于高脂组小鼠均显著降低，且AST值也有不同程度的降低，小鼠高脂饮食中长期添加升麻及其提取物能够改善肝功能。
3.总结
本发明公开了亚洲产升麻，升麻的醇提取物，升麻乙酸乙酯相萃取物以及化合物黄肉楠碱能够改善小鼠高脂饮食诱导的肥胖及肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。通过对升麻根茎进行分离提取及筛选找出了其中主要的抗肥胖天然化合物是来自乙酸乙酯相萃取物中的黄肉楠碱。小鼠实验表明黄肉楠碱不仅能够预防高脂饮食诱导的肥胖，还能有效治疗已经由高脂饮食诱导形成的肥胖，同时改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗。ALT，AST测定结果显示，小鼠高脂饮食中长期添加升麻或其提取物均能够改善肝功能。综上所述，升麻，升麻的醇提取物、升麻乙酸乙酯相萃取物以及黄肉楠碱均能够有效抑制肥胖，改善肥胖相关的糖不耐受和胰岛素抵抗，并同时起到了改善肝功能的效果。
Claims (1)
1.亚洲产升麻乙酸乙酯相萃取物 在制备治疗 高脂饮食诱导的肥胖的药物中的应用，所述乙酸乙酯相萃取物采用如下方法制得：
先将亚洲产升麻根茎粉末经80％甲醇提取得到粗提物，后经萃取得到乙酸乙酯相萃取物，
该乙酸乙酯相萃取物中具有质量含量为2-12％的黄肉楠碱，黄肉楠碱属于9,19-环阿尔廷烷型三萜皂苷类化合物，分子式C37H56O11，分子量676.83，熔点246-250℃，结构式如下：
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