CN108135811A - 用于组织修复和/或皮肤增白的3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺 - Google Patents

用于组织修复和/或皮肤增白的3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺 Download PDF

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Abstract

一方面，本发明涉及用作组织修复剂的3‑(4‑羟基苯基)丙酸酰胺(PA)。第二方面，本发明涉及PA作为皮肤增白/美白剂的用途。

Description

用于组织修复和/或皮肤增白的3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺
技术领域
本发明涉及来自苹果(Malus domestica)的芳香族天然化合物3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺(PA)对人细胞的作用。具体地，本发明涉及细胞运动性和脱色作用的增强，潜在地赋予改善的细胞组织损伤修复和肤色的美白/增白。
背景技术
细胞组织的修复是涉及一些细胞生化子过程的复杂过程。这些涉及通过输注细胞因子消毒和清理受损区域，细胞迁移以覆盖损伤以及新组织的收缩和肉芽形成。细胞迁移主要由肌动蛋白丝的协调装配和拆卸来驱动。因此，改善细胞粘附于基质中心和更有效地迁移以恢复组织损伤的能力将总体上提高细胞组织修复过程的功效。
雀斑、黄褐斑和晒黑后的色素沉积物随着年龄的增长而趋于发生或增加或变得难以消失，因此成为中年人或老年人皮肤护理中的严重问题之一。
现在，对于起到修复色素(即黑色素)的后天沉积物到正常皮肤颜色作用的药物和/或化妆品有着很高的要求。已经开发并实施了一些药物。例如，过氧化物被认为能漂白黑色素，因此尝试使用过氧化氢、过氧化锌、过氧化钠、过氧化苯甲酰等。然而，这些过氧化物是不稳定的化合物，在实际应用条件下几乎没有观察到减少色素沉着的效果。
近年来，提出了包含具有良好还原能力的维生素C(L-抗坏血酸)的化妆品，但是其在外部应用中几乎没有效果。而且，维生素C相当不稳定，不利于被包含在化妆品中。另一方面，在欧洲和美国，对苯二酚及其衍生物已用于治疗褐黄斑(moth patch)或漂白有色/深色皮肤。然而，这些化合物存在安全性问题(例如高刺激性、过敏性问题等)，有时可能会引起白斑，因此将这些物质用作药物/化妆品是相当不利的。也报道了使用各种黑色素抑制剂，但几乎所有的物质都几乎没有显示出黑色素抑制作用。
3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺(PA)最初被检测为苹果树汁中的化合物。该化合物经过纯化、鉴定并随后进行化学合成。
WO2007046721公开了制造PA的方法、其在制造抗老化组合物中的应用。
改善的细胞迁移过程和细胞脱色过程对许多应用将是有利的，特别地，更有效和/或更可靠的皮肤修复和肤色增白将是有利的。
发明内容
在这里提供的实验数据表明，PA赋予增强的运动性能力以及减少培养中人细胞中的黑色素生成。
将PA在体外细胞迁移模型系统中进行测试，例如体外双向和单向细胞迁移和胶原晶格收缩以及博伊登趋化小室运动性测定(Boyden chamber chemotaxic motilityassay)。对属于不同寿命年龄的细胞进行PA预处理，导致产生了更大的收缩力、改善的细胞运动性和更快的迁移能力，这些能力表明了能够帮助体内组织修复的能力(示例2)。
也测试PA的黑色素生成效果。色素沉着研究将黑色素作为皮肤颜色的重要决定因素，黑色素是由位于人体皮肤真皮和表皮的基底层内的黑素细胞产生的。酪氨酸酶负责催化引起皮肤细胞色素沉着的黑色素生物合成途径中的各个步骤。通过PA预处理的鼠黑素细胞测量潜在的皮肤美白/增白能力(示例3)。
PA明显地促进了分解酪氨酸酶的生理变化。酪氨酸酶的这种抑制促进了皮肤的脱色，表明PA是一种强效的肤色增白剂。
PA具有另外的优点，即它已知存在于植物汁液中，因此可被认为是天然产物。
因此，PA会影响人细胞的运动性以及黑色素生成。
因此，本发明的一个目的是提供一种化合物，其可以改善体内和体外的细胞迁移/运动性。
另一个目的是提供一种化合物，其可以改善皮肤增白/皮肤美白/皮肤变白。
因此，本发明的一个方面涉及用作组织修复剂和/或，组织重建剂(例如运动员的肌肉重建)的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
本发明的另一方面涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物作为皮肤增白剂的用途：
本发明的再另一方面涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物作为酪氨酸酶抑制剂的用途：
本发明的再另一方面是提供用作改善细胞运动性和/或表面细胞迁移的药剂的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
附图说明
图1显示了反映体内组织修复子过程的体外测定。
图2显示了PA处理对双向划痕试验中人成纤维细胞迁移率的作用。在进行划痕试验之前，将成纤维细胞用PA(80μM)预处理三天。通过微米尺度量化迁移(参见图3)。
图3A+3B显示了来自图2的实验结果的量化。与未处理的相比，PA将组织迁移改善了约37％。
图4显示了PA处理对单向划痕试验中人成纤维细胞迁移率的作用。在进行划痕试验之前，将成纤维细胞用PA(80μM)预处理三天。
图5显示了来自图4的实验结果的量化。24小时后，如通过单向细胞迁移测量的，PA将体外迁移(组织修复)增强了超过60％。上图：细胞迁移距离。下图：细胞迁移率。
图6显示了用于趋化性细胞迁移的博伊登小室测定的原理。
图7显示了三个独立的博伊登小室测定的结果。迁移的细胞附着在小室底部的聚碳酸酯膜上并染色(点)。显示了三个独立的实验。上图：对照。下图：经过PA处理的。
图8是博伊登小室测定结果的量化。PA比化学诱导剂以系数2.7增强体外趋化性迁移。
图9显示了自由浮动胶原晶格测定(free floating collagen lattice assay)的原理。
图10显示了自由浮动胶原晶格测定的示例以及用PA对嵌入的成纤维细胞预处理的作用。上图：对照和经过PA预处理的。下图：收缩时胶原晶格的测量。
图11显示了几种自由浮动胶原晶格测定的定量结果。X轴：小时。Y轴：以％表示的表面积。
曲线图显示了来自两次独立实验的通过PA的胶原晶格收缩的程度。PA将胶原收缩改善了85％。
现在将在下面更详细地描述本发明。
具体实施方式
组织损伤的修复
在第一方面，本发明涉及用作组织修复剂和/或，组织重建剂(例如运动员的肌肉重建)的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
如示例2所示，加入PA后，迁移/运动性测定明显地显示出改善的迁移，清楚地表明改善的组织修复。
因此，用PA处理的细胞明显获得了大大改善的移动能力以覆盖损伤组织。这不仅对开放性创伤和瘢痕(soar)有效果，而且对于较弱的组织损伤也有效果，例如被撕裂的(torned)和损伤的(abused)肌肉纤维。
在本文中，3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺对应于式(I)的化合物，
式(I)的化合物在此也可以表示为PA。式(I)的化合物也称(4-羟基苯基)丙酸酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺或简称为phloretamide。
用另一种方式表达，本发明因此还涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物在制备用作组织修复剂、组织重建剂(例如运动员的肌肉重建)的药物中的用途：
化合物或组合物可以通过不同途径提供给人。因此，在一个实施方案中，所述化合物或组合物是局部、全身性和/或口服施用的。
在再一个实施方案中，将所述化合物或组合物局部应用于被认为需要组织修复的皮肤区域。
在另一个实施方案中，所述被认为需要组织修复的组织是创伤、手术瘢痕、损伤组织，例如内部或外部的损伤组织，炎性瘢痕、溃疡、晒伤、烧伤、褥疮和/或糖尿病创伤。
可以以不同方式辅助将化合物和/或组合物提供给皮肤。因此，在另一个实施方案中，所述局部应用由绷带或贴片辅助。
在另一个实施方案中，将所述化合物或组合物提供给哺乳动物(例如人)。
也可以以不同的形式提供组合物。因此，在一个实施方案中，所述组合物为洗剂、乳剂、乳膏、软膏、贴剂(stick)、有机溶剂中的溶液、包装(pack)、补剂或凝胶的形式。
皮肤增白剂
化合物或组合物也可以用作皮肤增白剂/美白剂。因此，另一方面，本发明涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物作为皮肤增白剂的用途：
在本文中，“皮肤增白剂”或“皮肤美白剂”或“皮肤变白剂”是指能够使皮肤增白的化合物或组合物。PA能够抑制酪氨酸酶，在哺乳动物(例如人)中酪氨酸酶是黑色素合成的重要部分。因此，该作用可能是由于降低了皮肤中存在的黑色素水平。
另一方面，本发明涉及用作皮肤增白剂的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
在再另一方面，本发明涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物在制备用作皮肤增白剂的药物中的用途：
也可以以不同的形式提供组合物。因此，在一个实施方案中，所述组合物为化妆品、洗剂、乳剂、乳膏、软膏、贴剂、有机溶剂中的溶液、包装、补剂或凝胶的形式。
在更具体的实施方案中，所述式(I)的化合物以在0.01至50重量％、例如1至20重量％、或例如5至10重量％的范围内的浓度存在于组合物中。
在另一个实施方案中，组合物还包含一种或多种选自由油物质、湿润剂、增稠剂、防腐剂、乳化剂、医药成分、香料、乳化稳定剂、尿囊素、维生素E乙酸酯、甘草甜素、水杨酸、尿素、薏苡仁和紫外线吸收剂组成的组的成分。
可以通过不同途径将化合物或组合物提供给受试者。因此，在一个实施方案中，所述化合物或组合物是局部应用的。
在再一个实施方案中，将所述化合物或组合物局部应用于被认为需要皮肤增白/美白的皮肤区域，例如比皮肤的周围区域更暗的区域。
在另一个实施方案中，所述化合物应用于雀斑、黄褐斑、褐黄斑、瘢痕和/或晒黑后的色素沉积物。
在再另一个实施方案中，所述局部应用由绷带或贴片辅助。
将化合物或组合物优选提供给人。因此，在一个实施方案中，将所述化合物或组合物应用于哺乳动物，例如人。
当化合物或组合物用于口服施用时，其可以以不同的形式出现。因此，在一个实施方案中，所述口服施用为食物、食物成分、营养药物、营养化妆品(neutracosmetic)、药丸或胶囊的形式。
酪氨酸酶抑制剂
如示例3所示，根据本发明的化合物或组合物也起到酪氨酸酶抑制剂的作用。因此，一方面，本发明涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物作为酪氨酸酶抑制剂的用途：
抑制酪氨酸酶也可以与非医疗和非化妆品领域有关。例如，酪氨酸酶抑制剂可能与避免例如食物(例如蔬菜和水果)变褐有关。
细胞迁移/运动性
如在例如示例2中所示，根据本发明的化合物或组合物改善细胞迁移。
因此，一方面，本发明涉及用作改善细胞运动性和/或表面细胞迁移的药剂的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
在本文中，“表面细胞迁移”涉及细胞在表面(诸如基质，例如细胞基质)上的迁移。
在另一相似方面，本发明涉及式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物在用作改善细胞运动性和/或表面细胞迁移的药剂中的用途：
不受理论束缚，认为改善的细胞迁移/运动性是由于对表面的改善的粘附性。这也被认为是避免例如癌细胞从其主要位置逃逸到循环系统中从而导致癌症转移的重要特征。因此，一方面，化合物或组合物也可以用于改善(体内的和体外的)细胞粘附。
这种用途也可以是离体用途或体外用途。因此，在一个实施方案中，所述用途是体外(或离体)的。在更具体的实施方案中，所述体外用途(或离体)用于组织(例如皮肤或器官)的生长。
应该注意的是，在本发明的一方面的上下文中描述的实施例和特征也适用于本发明的其它方面。
在本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用以整体并入本文。
现在将在下面的非限制性示例中进一步详细描述本发明。
示例
示例1-方法：
成纤维细胞在真皮等同物中的不同机制
自由浮动胶原晶格
目的：研究成纤维细胞的ECM分子的收缩
方案：
来自牛皮肤的I型胶原蛋白可从IBFB Pharma GmbH，Leipzig，Germany购买，并根据分布式方案制备。
将细胞进行胰蛋白酶消化，悬浮于完全生长培养基中并小心地混合于胶原蛋白溶液中(胶原蛋白在0.9×DMEM、10％FCS、0.2mM NaOH中，室温下制备)。最终的细胞浓度范围可以为0.8×104至3×105个细胞/ml晶格。最终的胶原蛋白浓度范围可以为0.3至0.6mg/ml晶格。
混合后，将溶液置于细菌培养皿中并立即放回培养箱中。
在培养箱中聚合半小时后，利用移液管吸头将晶格从平皿的边界小心分离。非常重要的是，自由浮动胶原晶格在培养基中自由“游动”。
根据细胞类型和种子细胞数量在不同时间点进行直径测量。可以利用刻度纸进行测量。从直径可以计算胶原晶格的面积，并可以在不同的时间点比较它们的大小。
胶原晶格的制备：
·20个晶格的估计时间＝1小时导热加1小时直到添加培养基。
·每次测定，将20个空的35mm细胞培养皿预热至37℃。
所使用的塑料平皿的类型可能会显著影响凝胶的附着强度。
·将细胞进行胰蛋白酶消化，并以约10.0×105个细胞重悬于2.5ml培养基中。细胞起始数量必须根据细胞类型和生长时间进行调整。
·在制备胶原蛋白溶液的过程中，将细胞悬浮液储存在冰上。
·胶原蛋白溶液由冷的和无菌的组分在冰上制备：
组分 量 浓度 制造商
鼠尾胶原I 1250μl 2.3mg/ml First Link(UK)Ltd,RTC 1833
(D)MEM(10×) 150μl 10× Life Tech商品目录号2/430-012
NaOH(无菌) 约100μl 1N
总计：1500μl
·胶原蛋白I溶解于来自First Link的0.6％乙酸中。可以采用任何其它的鼠尾胶原(例如Sigma)，但必须针对乙酸和胶原蛋白物料浓度调整方案。
·用黄色移液管吸头逐滴滴加NaOH(从100μl中约8至9滴)以中和乙酸。在pH 7.4，培养基中的苯酚从黄色变为粉红色，胶原蛋白开始聚合，迅速操作以防止形成胶原蛋白聚集体或胶凝。
·将制备的胶原蛋白溶液(1.5ml)与细胞溶液(2.5ml)在室温下轻轻混合，得到2.5×105个细胞/ml的最终细胞浓度和0.72mg/ml的最终胶原蛋白浓度。同样，通过调整方案，可以将胶原蛋白浓度从0.5mg/ml(柔顺的)变为约2mg/ml(硬的)。
·将200μl胶原蛋白/细胞混合物作为液滴缓慢移液至一个预热的35mm细胞培养皿的中心并在37℃下聚合60分钟。间歇摇动平皿以防止液滴流出并保持良好的圆形滴状形态。
·在60至180分钟后，加入2ml培养基，并将晶格孵育至多5天而不更换培养基。
博伊登小室：
研究成纤维细胞向化学引诱物的趋化性定向运动性
神经探针AP48
48孔微趋化性小室方案
注：以下说明假定正在使用聚碳酸酯滤膜。
准备小室
1、用1mm吸头调整可变容积微量移液管，以便喷出的液体填充底部孔(bottomwell)。该孔将容纳25至26μL。当孔充满时，应形成轻微的正弯液面；这防止了在应用滤膜时气泡被困住。
2、将底板定向在平坦的表面上，使NP商标位于左上方。将化学引诱剂或对照试剂温热至约37℃并通过涡旋或真空除气。填充底部孔，不超过5分钟完成48个孔，以防止过度蒸发。
3、从过滤膜的角落切下1mm，并将其定向为切角在左上方。用两个镊子将滤膜的两端提起，均匀地放在已充满的孔上，然后放在它们上面，让滤膜的中间部分先接触。如有必要，可以在此处调整滤膜的位置，但请注意，太多的移动会导致孔之间的污染。
4、施加在左上方带有切角的硅胶垫片，然后施加顶板，将其NP商标与底板上的商标对齐。稳稳地推顶板，不要放开；这有助于防止气泡被吸入并困在底部孔。用空闲的手，施加并拧紧蝶形螺母，直到用手拧紧。不要使用钳子或其它工具来拧紧它们。
准备和添加响应细胞
1、在上部孔中应调整悬浮液中的细胞浓度，以使50μL含有一个孔所需的细胞数量。例如，由于每个孔的暴露滤膜面积为8mm2，因此在50μL中的8,000个细胞的悬浮液将产生1,000个细胞/mm2。在50μL中的50,000个细胞将产生约6,000个细胞/mm2。
2、将细胞悬浮液用移液管吸取至每个上部孔中，调整体积以使充满的孔具有轻微的正弯液面。将移液管保持在一陡峭的角度，以使移液管吸头的端部抵靠在滤膜正上方的小室的壁上，吸头的侧面抵靠在孔的顶部边缘上。流体以快速移动方式喷出以排出孔底部的空气。
3、检查上部孔中被困的气泡。一个简单的方法就是查看弯液面的顶灯的反射：具有异常大的正弯液面的孔通常有被困的气泡。要除去任何气泡，则用吸入管线(suctionline)和一次性移液管吸头将孔完全吸干，然后重新填充。
4、对于大多数趋化性实验，将充满的小室在37℃的含5％CO2的潮湿空气中孵育。根据细胞类型和趋化因子大幅改变孵育时间。确定最佳孵育时间的一个好方法是采用6至12个盲孔小室(例如编号#BW100)设置为阴性对照并同时置于培养箱中。在设定的一段时间(例如30分钟)后移除一个盲孔小室，然后依次移除其余部分，每5分钟一个小室。对滤膜进行染色并检查它们以查看未受刺激的细胞迁移通过滤膜所用的时长，或者如果采用硝酸纤维素滤膜，则达到指定的最佳深度所用的时长。
将聚碳酸酯滤膜染色
1、从顶部孔中抽吸液体或通过在水槽或容器上晃动小室将其清空。
2、在按住顶板的同时取下蝶形螺母，然后将整个小室翻转到纸巾上。抓住顶板(现在在底部)的四个角并均匀地向下推，使其在落到桌面上时保持水平。如果垫片应挂在支柱硬件上，则小心地将其均匀地推到平板上。小心不要触摸到应粘在垫片上的滤膜。将其余的板(在适当的位置上有螺栓硬件)浸入冷的蒸馏水中。
3、迁移的细胞现在在滤膜上面朝上；滤膜的这一侧此后称为细胞侧。用镊子提起滤膜的一端，并在大滤膜夹中抓住1mm的边缘。提起滤膜并快速将小滤膜夹附接到自由端的边缘。保持细胞侧朝上，在含有PBS的平皿中润湿滤膜的下侧(非迁移细胞侧)。不要让PBS冲洗滤膜的细胞侧。
4、用大夹子夹住滤膜，将小夹子附接在另一端并悬空，然后通过将滤膜向上拉过刮片，将细胞从滤膜的非迁移细胞侧擦拭掉。刮片应该首先接触宽夹的钳口正下方的滤膜。只使用轻微的压力抵住刮片，并且将刮片上方的滤膜部分与垂直线保持约30°的角度。仔细和快速地完成擦拭是非常重要的，以便细胞不会在滤膜上干燥；干燥在10至20秒内发生，并将阻碍非迁移细胞的完全除去。
5、用棉签清理刮片，再次用PBS浸湿滤膜的下侧，然后重复步骤3。再次清理刮片，然后在PBS中第三次润湿滤膜，然后重复步骤3。
6、对于粒细胞和单核细胞，小心地将滤膜浸入甲醇中，然后将滤膜细胞侧放在一次性无绒毛巾上风干。在冷的蒸馏水中清洗所有小室部件。对于其它类型的细胞，则参阅文献的染色技术。
7、当滤膜干燥时，按照制造商的说明，用大滤膜夹钳夹住一端的边缘，用小滤膜夹压住另一端，并用或同等染料染色。为了避免染色剂污染小室部件，可以方便地使用两套滤膜夹，一套用于从垫片上取下滤膜，另一套用于染色。
8、将湿的滤膜的细胞侧放在50×75mm的显微镜载玻片上干燥。当滤膜是干燥的时，将其置于载玻片上并在其上放置一滴浸油。用平滑钝器将油擦在滤膜上以去除所有气泡和褶皱。滤膜现在已准备好进行计数。
示例2-单向和双向细胞迁移
目的：确定3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺处理对成纤维细胞迁移的作用。
介绍
汇合的精细细胞单层被机械破坏，留下无细胞的区域。这个过程是通过对细胞进行“刮擦”来完成的，随后通过显微镜监测，通过细胞机械迁移将相邻细胞推进到开放区域。取决于细胞类型，覆盖过程可能需要数小时至不到一天，这完全取决于细胞的类型和刮擦的程度。细胞迁移的速率或程度(通常称为再增殖率)可以通过一系列显微照片来计算。
方案
·在35mm组织培养板中以1×104密度平铺(plate)成纤维细胞，并采用新型测试化合物与对照在37℃，5％CO2下孵育三天。
·在汇合时，通过利用无菌移液管吸头形成一个条纹来移动单层细胞内的一组细胞。
·刮擦后在相差显微镜下以19小时的间隔依次拍照。
·利用目镜测微计测量每个时间点的刮擦尺寸。
·通过学生t试验(Student's t test)评估统计显著性。
·在成纤维细胞的PA预处理中观察刮擦修复中的显著差异。
结果
图1显示了所提供的实验中采用的体外测定反映的体内过程的总体概述。
图2和图3中呈现的双向划痕测定的结果清楚地显示出当添加PA时改善的细胞迁移。
图4和图5中呈现的单向划痕测定的结果清楚地显示出当添加PA时改善的细胞迁移。
图7和8中呈现的趋化性迁移测定(博伊登小室测定)的结果清楚地显示出当添加PA时改善的细胞迁移。在图6中示意性地示出了博伊登小室测定。
图10和图11中呈现的自由浮动胶原晶格测定的结果清楚地显示出当添加PA时改善的细胞迁移/运动性。在图9中示意性地示出了自由浮动胶原晶格测定。
结论
通过采用该细胞迁移测定的集合获得的结果清楚地表明PA处理的细胞中细胞运动性的显著改善，表明PA可能强烈地改善人类细胞修复施加的组织损伤的能力。
示例3-皮肤脱色测定
研究3-(4-羟基苯基)丙酸酰胺对人细胞中黑色素生成的作用
介绍
皮肤颜色的决定因素-黑色素是由位于分离人体皮肤中的真皮和表皮的基底层上的黑素细胞产生。酶-酪氨酸酶负责催化负责皮肤细胞色素沉着的黑色素生物合成途径中的各个步骤。因此，酪氨酸酶抑制促进皮肤脱色(皮肤美白)。
研究的目的
本研究旨在用动物模型系统体外研究皮肤美白效应
测定标准化
采用B10F16小鼠黑素细胞进行标准化测定，细胞数量-密度的范围为5×104至1×105个细胞/ml。发现105个细胞足以获得足够的细胞沉淀，并将细胞以相同数量接种在培养皿中。第二天，细胞用80μM的PA和10μM+对照预处理2小时、24小时、72小时和96小时。
然后收集细胞，对细胞数量进行计数，并将相同数量进行沉淀。肉眼观察细胞沉淀的颜色强度并定量。然后将相同的细胞沉淀用于蛋白质提取和免疫印迹分析。
材料和方法
制备测试溶液：测试化合物的储备溶液通过溶解在DMSO中而制备。将储备溶液过滤灭菌，在4℃的冰箱中保存，根据需要用细胞培养基稀释后用于实验。
细胞系：将小鼠黑素细胞(B10F16细胞系)供养在补充有10％胎牛血清(体积/体积；Invitrogen)、2mM谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Invitrogen)中。
培养条件：在每个测定前，将细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下继代培养，喂养约16小时，利用Coulter Z2计数器(Beckman Coulter)重复测定细胞数量。当小鼠黑素细胞以1:4的分割比达到汇合时，将它们继代培养。
用于蛋白质估计的Bradford测定：
浓度为1μg/μl的储备溶液由BSA制备。
测定试剂-通过用4体积的蒸馏水稀释1体积的染料储备液来制备测定试剂。溶液储存在4℃的黑色瓶中。
蛋白质标准品-在与待测定样品相同的缓冲液中制备蛋白质标准品。采用用于微量测定的具有0、2、4、6、8、10、15和20μg/mL的浓度的牛血清白蛋白(BSA)可以形成方便的标准曲线。
标准蛋白质测定过程：
研究了含有0、2、4、6、8、10、15和20μg/mL BSA的八种标准溶液(各1mL)。分光光度计设定为595nm的波长。在此波长上使用充满蒸馏水的4mL塑料比色皿以使分光光度计空白。将塑料比色皿清空至试管中，并将任何剩余的液体摇出。加入4μL蛋白质标准溶液和1mL测定试剂，从最低蛋白质浓度和待测定样品开始。记录400至700nm下样品的吸光度光谱，并记录595nm处的吸光度。对每种蛋白质标准品和待测定样品重复上述步骤。检查标准品和样品的光谱。要从吸光度中确定样品的蛋白质浓度，利用标准曲线找出与样品具有相同吸光度的标准品浓度。
结果：
-C 对照无化合物
+C 阳性对照(10μM的对苯二酚)
PA 80μM的化合物
对苯二酚是一种众所周知的具有已知的健康风险的酪氨酸酶抑制剂。
结论
化合物PA显示出明显的颜色变化，从黑色到发白，表明对抑制黑色素生成具有显著效果。

Claims (19)

1.一种用作组织修复剂和/或，组织重建剂，例如运动员的肌肉重建的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述组合物是局部、全身性和/或口服施用的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物局部应用于被认为需要组织修复的皮肤区域。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述被认为需要组织修复的组织是创伤、手术瘢痕、损伤组织，例如内部或外部损伤组织，炎性瘢痕、溃疡、晒伤、烧伤、褥疮和/或糖尿病创伤。
5.根据权利要求3至4中任一项的化合物或组合物，其中所述局部应用通过绷带或贴片辅助。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述组合物为洗剂、乳剂、乳膏、软膏、贴剂、有机溶剂中的溶液、包装、补剂或凝胶的形式。
7.式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物作为皮肤增白剂的用途：
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述组合物为化妆品、洗剂、乳剂、乳膏、软膏、贴剂、有机溶剂中的溶液、包装、补剂或凝胶的形式。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的用途，其中所述式(I)的化合物以在0.01至50重量％、例如1至20重量％、或例如5至10重量％的范围内的浓度存在于所述组合物中。
10.根据权利要求7至9中任一项的用途，还包含一种或多种选自由油物质、湿润剂、增稠剂、防腐剂、乳化剂、医药成分、香料、乳化稳定剂、尿囊素、维生素E乙酸酯、甘草甜素、水杨酸、尿素、薏苡仁和紫外线吸收剂组成的组的成分。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的用途，其中所述化合物或组合物是局部应用的。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的用途，其中所述化合物或组合物局部应用于被认为需要皮肤增白的皮肤区域，例如比所述皮肤的周围区域更暗的区域。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述化合物应用于雀斑、黄褐斑、褐黄斑、瘢痕和/或晒黑后的色素沉积物。
14.根据权利要求11至13中任一项的用途，其中所述局部应用由绷带、贴片辅助。
15.式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物作为酪氨酸酶抑制剂的用途：
16.用作改善细胞运动性和/或表面细胞迁移的药剂的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物：
17.式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物在用作改善细胞运动性和/或表面细胞迁移的药剂中的用途：
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述用途是体外(或离体)的。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述体外(或离体)用途是用于组织的生长，例如皮肤或器官的生长。
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