CN108118005B - 一种利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法。该方法通过向超高浓麦汁中添加二肽Lys‑Leu来提高酿酒酵母的生理和代谢活性，从而提高酿酒酵母的发酵速率，缩短发酵周期。本发明方法仅在麦汁中补充二肽Lys‑Leu，并不改变现有的发酵工艺和设备，工艺简单易行，便于控制，为高浓啤酒发酵技术提供了新思路。

Description

一种利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高超高浓麦汁发酵中啤酒酵母生理及代谢活性的方法。
背景技术
在啤酒酿造过程中，啤酒酵母需要迅速适应麦汁环境，在啤酒酿造过程中迅速增殖并维持高生命力。目前，超高浓麦汁发酵技术由于其经济和产品质量优势而在现代啤酒厂得到越来越广泛的应用。然而，啤酒酵母在超重力麦芽汁中会暴露在极端的环境条件下，包括渗透胁迫、乙醇毒性、粘度和二氧化碳浓度增加，以及在重力发酵期间的营养限制，将导致啤酒酵母的生理特征酵母和发酵缓慢或停滞，从而降低啤酒生产效率和最终产品质量。因此，啤酒厂在改善啤酒酵母的生理活性和发酵性能，以及在重力麦汁发酵过程中最终啤酒的质量方面具有重要意义。
发酵底物模式、营养添加、细胞环境和物种特异性对啤酒酵母的生理活性和发酵性能均有显着影响。在这些因素中，由于添加糖浆导致的氮源缺乏会导致酵母细胞在发酵初期的生理活性降低，因此在使用超重力培养基的酵母发酵中起到关键作用，随后缓慢或停滞的发酵。麦汁中的氮源是啤酒酿造工艺和啤酒品质稳定性的重要影响因素。麦芽糖化蛋白水解产生的氨基酸和多肽，占麦汁总氮含量的60～80％，是酵母代谢的主要氮源。氨基酸在啤酒酵母代谢中的作用和同化方式早已为人所知。麦汁中的氨基酸根据其从发酵液中去除的速率进行分组，或根据酮酸类似物在酵母代谢中的基本性质进行分类。赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)的碳骨架完全来源于外源氨基酸，在酿造过程中缺乏这些氨基酸会引起酵母氮代谢和发酵性能的显着变化。通过在麦汁中加入Lys可以提高酵母的生长、麦汁发酵能力、乙醇生产和风味挥发物的形成。然而，关于肽及其同化的信息以及对啤酒酵母的生理活性和发酵性能的影响非常有限。在含有大豆肽的培养基中培养酵母细胞被发现可提高对面包酵母的冻融胁迫的耐受性，抑制脂质体的形成并加速啤酒酵母的酒精发酵。此外，研究发现植物蛋白水解的肽类在酵母超高浓发酵时能提高酵母的生物量、细胞活力、乙醇产量以及游离氨基氮同化速率。所有这些发现表明，氮源特别是氨基酸和肽可以改变啤酒酵母的特性。然而，氨基酸和多肽补充剂刺激啤酒酵母生长发酵的机制尚不清楚，氨基酸和多肽补充剂之间的关系以及啤酒酵母的生理和发酵性能尚未完全阐明。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法。该方法具体通过在超高浓麦汁培养基中添加固相合成的二肽Lys-Leu来提高啤酒酵母生理和代谢活性，并通过定期取样检测酵母细胞的生理和代谢指标确定其效果。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法，包括如下步骤：
(1)超高浓麦汁培养基的制备：将糖浆添加到原麦汁中调整原麦汁的糖度，再调整pH值后，灭菌，得到超高浓麦汁培养基；
(2)将啤酒酵母接种于原麦汁中活化培养后，进行种子液扩充培养，再将培养得到的种子液接种于超高浓麦汁培养基中，并加入二肽Lys-Leu，进行发酵培养。
进一步地，步骤(1)中，所述糖浆为啤酒专用糖浆。
进一步地，步骤(1)中，所述调整麦汁的糖度是调整麦汁的糖度为20～28°p。
进一步地，步骤(1)中，所述调整pH值是调整pH值为5.0～6.0。
进一步地，步骤(1)中，所述灭菌是在121℃灭菌15min。
进一步地，步骤(1)中、(2)中，所述原麦汁均是糖度为12°P的麦汁。
进一步地，步骤(2)中，所述啤酒酵母为酵母Saccharomycespastorianus，于2010年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.4466，该酵母具有抗高渗的能力，在24°P超高浓麦汁培养基中仍能正常发酵。
进一步地，步骤(2)中，所述活化培养为：将啤酒酵母接种于原麦汁中，25℃、180rpm条件下培养24h。
进一步地，步骤(2)中，所述种子液扩充培养为：将活化培养后的啤酒酵母转接于新鲜的原麦汁中，20℃、140rpm条件下扩大培养48h；最后，转接悬浮细胞于新鲜的原麦汁中，15℃静态培养72h，8000g、4℃离心10～30min获取酵母菌体，弃去上清。
进一步地，步骤(2)中，培养得到的种子液接种于超高浓麦汁培养基的接种量为3×106～5×106cells/mL/°P。
进一步地，步骤(2)中，所述二肽Lys-Leu通过多肽固相合成法合成。
进一步地，步骤(2)中，所述二肽Lys-Leu的添加量为100～800mg/L。
进一步地，步骤(2)中，所述发酵培养的温度为12℃。
通过上述方法将固相合成的二肽Lys-Leu添加到超高浓麦汁培养基中进行啤酒发酵，定期取样检测啤酒酵母细胞的细胞数量、细胞活力、细胞干重、麦汁浓度、乙醇浓度、胞内海藻糖和甘油，啤酒酵母的生理活性和发酵性能均得到明显改善。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明的方法仅在发酵过程中补充二肽Lys-Leu，并不改变现有的发酵工艺和设备，工艺简单易行，条件温和、易于控制，为大规模啤酒发酵提供了新路径。
附图说明
图1a为具体实施例中采用的二肽Lys-Leu的液相质谱分析图；
图1b为具体实施例中采用的二肽Lys-Leu的质谱分析图；
图2为实施例1、实施例2和实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的最大生长细胞数对比图；
图3a为实施例1中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的细胞活力影响曲线图；
图3b为实施例2中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的细胞活力影响曲线图；
图3c为实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的细胞活力影响曲线图；
图4a为实施例1、实施例2和实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的发酵性能影响对比图；
图4b为实施例1、实施例2和实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的乙醇产量影响图；
图5a为实施例1、实施例2和实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的胞内海藻影响图；
图5b为实施例1、实施例2和实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的胞内甘油影响图。
具体实施方式
以下结合具体实施例以及附图对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明的保护范围及具体实施方式不限于此。
以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件进行实验。
具体实施例中，采用的啤酒酵母为酵母Saccharomyces pastorianus，于2010年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所菌种保藏中心)，保藏编号为CGMCC No.4466。
具体实施例中，通过对比研究在啤酒酵母在超高浓(VHG)麦芽汁培养基发酵期间，补充二肽Lys-Leu和氨基酸来改善啤酒酵母的生理和代谢活性的有效性差异。
其中，采用的二肽Lys-Leu通过多肽固相合成法合成，具体步骤如下：
取0.3mmol/g芴甲氧羰酰-亮氨酸-王树脂(Fmoc-Leu-Wang Resin)30～60g置于反应柱中以二甲基甲酰胺(DMF)浸泡30～60min；抽干二甲基甲酰胺，加入3～6倍体积的20wt％哌啶的二甲基酰胺溶液(20％Pip/DMF)，鼓氮气30～60min脱除笏甲氧羰酰基，二甲基甲酰胺洗5遍，检测现深蓝色；按比例(N-9-芴甲氧羰基-N-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸：苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯：N-甲基吗啡啉＝3：2.85：6)投入原料，加入300～600ml二甲基甲酰胺，鼓氮气反应30min，检测透明；抽干二甲基甲酰胺，加入3～6倍体积的20％Pip/DMF，鼓氮气30～60min脱除笏甲氧羰酰基、二甲基酰胺、甲醇和二氯甲烷；甲醇抽干反应器内树脂，转移至切割管中，加入0.4～0.8L由三氟乙酸95％、水2％和三异丙基硅烷3％配制的混合液，摇床控温3～6h；抽滤，将切割滤液收集至离心管中，加入6～12倍体积冰乙醚，低速离心机沉淀；将沉淀的粗品用乙醚洗3遍得粗品；将粗品真空干燥后纯化制得纯品。
合成的二肽Lys-Leu的液相分析图和质谱分析图分别如图1a和图1b所示，由图1a和图1b可知，通过高效液相色谱对固相合成的二肽Lys-Leu分析其纯度高达99.77％，并且通过质谱进一步准确分析二肽Lys-Leu的离子质量以及化合物组成情况，可知合成的二肽为Lys-Leu。
通过定期取样检测啤酒酵母细胞的细胞数量、细胞活力、细胞干重、麦汁浓度、乙醇浓度、胞内海藻糖和甘油，检测啤酒酵母的生理活性和发酵性能，具体的：
(1)细胞数量(cells/mL)按照血细胞计数法测定。
(2)细胞活力按照次甲基蓝染色法测定。
(3)麦汁浓度(°P)和乙醇浓度(％，v/v)为离心后的上清液经奥地利安东帕AntonPaar便携式密度计DMA35N测定。
(4)麦汁发酵度由如下公式计算得出：
Figure BDA0001565830990000071
(5)胞内海藻糖和甘油分别由Waters 6002414折射率检测器和Hypersil NH2柱(5μm，4.6×250mm)HPLC分析。
实施例1
利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法，具体步骤如下：
(1)超高浓麦汁培养基制备：通过添加啤酒专用糖浆(60°P)到12°P的原麦汁中，调整其糖度为20°P，再调节pH值为5.0，121℃灭菌15min，得到超高浓麦汁培养基；
(2)将啤酒酵母Saccharomycespastorianus接种于12°P的原麦汁中进行活化培养，具体为：对固态保存的啤酒酵母接种于12°P的原麦汁中，25℃、180rpm条件下培养24h；
活化培养后，进行种子液扩充培养，具体为：将活化培养后的啤酒酵母转接于200ml12°P的新鲜原麦汁中，20℃、140rpm条件下扩大培养48h；最后，转接悬浮细胞于1L12°P的新鲜原麦汁中，15℃静态培养72h，8000g、4℃离心10min获取酵母菌体，弃去上清；再将得到的种子液接种于含4L 20°P的超高浓麦汁培养基的5L啤酒发酵罐中，添加二肽Lys-Leu和氨基酸；其中，试验组为添加100mg/L的二肽Lys-Leu的20°P高浓麦汁，添加50mg/LLys和50mg/LLeu混合氨基酸的20°P高浓麦汁，空白组为无添加其他成分的20°P高浓麦汁；
接种量为3×106cells/mL/°P，培养温度12℃进行发酵培养14天，定期取样测定细胞数量、细胞活力、细胞干重、麦汁浓度、乙醇浓度、胞内海藻糖和甘油。
实施例2
利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法，具体步骤如下：
(1)超高浓麦汁培养基制备：通过添加啤酒专用糖浆(60°P)到12°P的原麦汁中，调整其糖度为24°P，再调节pH值为5.5，121℃灭菌15min，得到超高浓麦汁培养基；
(2)将啤酒酵母Saccharomycespastorianus接种于12°P的原麦汁中进行活化培养，具体为：对固态保存的啤酒酵母接种于12°P的原麦汁中，25℃、180rpm条件下培养24h；
活化培养后，进行种子液培养，具体为：将活化培养后的啤酒酵母转接于200ml12°P的新鲜原麦汁中，20℃、140rpm条件下扩大培养48h；最后，转接悬浮细胞于1L 12°P新鲜原麦汁中，15℃静态培养72h，8000g、4℃离心10min获取酵母菌体，弃去上清；再将得到的种子液接种于含4L 24°P的超高浓麦汁培养基的5L啤酒发酵罐中，添加二肽Lys-Leu和氨基酸；其中，试验组为添加400mg/L的二肽Lys-Leu的24°P高浓麦汁，添加200mg/L Lys和200mg/LLeu混合氨基酸的24°P高浓麦汁，空白组为无添加其他成分的24°P高浓麦汁；
接种量为4×106cells/mL/°P，培养温度12℃进行发酵培养14天，定期取样测定细胞数量、细胞活力、细胞干重、麦汁浓度、乙醇浓度、胞内海藻糖和甘油。
实施例3
利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法，具体步骤如下：
(1)超高浓麦汁培养基制备：通过添加啤酒专用糖浆(60°P)到12°P的原麦汁中，调整其糖度为28°P，再调节pH值为6.0，121℃灭菌15min，得到超高浓麦汁培养基；
(2)将啤酒酵母Saccharomycespastorianus接种于12°P的原麦汁中进行活化培养，具体为：对固态保存的啤酒酵母接种于12°P的原麦汁中，25℃、180rpm条件下培养24h；
活化培养后，进行种子液培养，具体为：将活化培养后的啤酒酵母转接于200m112°P的新鲜原麦汁中，20℃、140rpm条件下扩大培养48h；最后，转接悬浮细胞于1L 12°P新鲜原麦汁中，15℃静态培养72h，8000g、4℃离心10min获取酵母菌体，弃去上清；再将得到的种子液接种于含4L 28°P的超高浓麦汁培养基的5L啤酒发酵罐中，添加二肽Lys-Leu和氨基酸；其中，试验组为添加800mg/L的二肽Lys-Leu的28°P高浓麦汁，添加400mg/L Lys和400mg/LLeu混合氨基酸的28°P高浓麦汁，空白组为无添加其他成分的28°P高浓麦汁；
接种量为5×106cells/mL/°P，培养温度12℃进行发酵培养14天，定期取样测定细胞数量、细胞活力、细胞干重、麦汁浓度、乙醇浓度、胞内海藻糖和甘油。
图2为实施例1～3补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys和Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵细胞生长的最大生物量对比图，由图2可知，与对照组相比，补充二肽Lys-Leu的培养基中酵母保持较高的悬浮细胞量，3个实施例中显示了相似的细胞生长趋势，并且添加不同成分的培养基中细胞活力：二肽Lys-Leu＞氨基酸＞对照。以上结果表明，在超高浓(VHG)麦汁发酵过程中，二肽Lys-Leu的补充可以提高酵母细胞的生长和活力。
图3a、图3b和图3c分别为实施例1、实施例2和实施例3补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys或Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的细胞活力影响曲线图，由图3a～图3c可知，与对照组相比，补充二肽Lys-Leu的培养基中酵母保持较高的细胞活力，并且添加不同成分的培养基中细胞活力：二肽Lys-Leu＞氨基酸＞对照。以上结果表明，在超高浓(VHG)麦汁发酵过程中，二肽Lys-Leu的补充可以提高酵母细胞活力。
图4a和图4b分别为实施例1～实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys或Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的发酵性能和乙醇产量影响图，由图4a和图4b可知，补充二肽Lys-Leu的麦汁展现出更显著的发酵能力和乙醇产量，并且显著高于氨基酸组与对照组相比。因此，补充二肽Lys-Leu可有效改善酿酒酵母在VHG酿造期间的发酵性能。
图5a和图5b分别为实施例1～实施例3中补充二肽Lys-Leu和氨基酸(Lys或Leu)对啤酒酵母超高浓麦汁发酵的胞内海藻和甘油最大含量对比图，由图5a和图5b可知，补充二肽Lys-Leu的超高浓麦汁培养基发酵中，酵母细胞胞内海藻糖和甘油含量均高氨基酸组与对照组相比(p＜0.05)。而海藻糖和甘油是酵母细胞抵御外界胁迫环境的重要保护剂，因此，补充二肽Lys-Leu可有效帮助酿酒酵母在VHG酿造期间的提高酵母的耐受性以及细胞活力。
由图2～图5b可知，在整个发酵过程中，补充二肽Lys-Leu的样品组啤酒酵母均显示出典型的酵母生长模式。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用二肽提高酿酒酵母生理和代谢活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）浓麦汁培养基的制备：将糖浆添加到原麦汁中调整原麦汁的糖度，再调整pH值后，灭菌，得到浓 麦汁培养基；所述调整原麦汁的糖度是调整原麦汁的糖度为20～28 oP；所述调整pH值是调整pH值为5.0~6.0；
（2）将啤酒酵母接种于原麦汁中活化培养后，进行种子液扩充培养，再将培养得到的种子液接种于浓麦汁培养基中，并加入二肽Lys-Leu，进行发酵培养；所述二肽Lys-Leu的添加量为100～800 mg/L；所述啤酒酵母为酵母Saccharomyces pastorianus，于2010年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4466。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述糖浆为啤酒专用糖浆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述灭菌是在121℃灭菌15min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中、（2）中，所述原麦汁均是糖度为12 oP的麦汁。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述活化培养为：将啤酒酵母接种于原麦汁中，25℃、180 rpm条件下培养24 h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液扩充培养为：将活化培养后的啤酒酵母转接于新鲜的原麦汁中，20℃、140 rpm条件下扩大培养48 h；最后，转接悬浮细胞于新鲜的原麦汁中，15℃静态培养72 h，8000g、4℃离心10～30 min获取酵母菌体，弃去上清。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，培养得到的种子液接种于浓麦汁培养基的接种量为3×106～5×106 cells/mL/ oP。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述二肽Lys-Leu通过多肽固相合成法合成；所述发酵培养的温度为12℃。
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