CN108096241B - 银杏内酯组合物的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了银杏内酯组合物在制备治疗多发性硬化症药物中的应用。本发明建立的EAE动物模型，在给予银杏内酯组合物药物干预后发现EAE动物神经功能评分显著降低，falling latency时间显著延长，说明银杏内酯组合物能够显著降低EAE发病程度。且EAE小鼠血清中IL‑17、IFN‑γ表达显著减少，IL‑4表达显著增加，可见，银杏内酯组合物还能够改善由上述细胞因子含量失衡所引发的炎症反应。

Description

银杏内酯组合物的医药用途

技术领域

本发明属于涉及医药技术领域，特别是涉及银杏内酯组合物在治疗多发性硬化症中的应用。

背景技术

多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统脱髓鞘自身免疫性疾病，临床主要表现为复发缓解的过程及进行性加重的神经功能障碍，已成为造成中青年非创伤性残疾的主要原因。MS分为六种主要的临床综合征：临床孤立综合征(clinicallyisolated syndromes，CIS)、缓解复发型MS、继发进展型MS、进展复发型MS、原发进展型MS和急性MS。近年来发病率呈持续上升趋势，女性发病人数两倍于男性，我国北方患者多于南方，以20岁～40岁居多，目前仍无法治愈该疾病，严重影响患者的健康和生活质量，同时也带来了巨大的社会经济影响。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是国际上公认的MS的理想动物模型，主要是以一种特异性致敏的CD4+T细胞为介导，对实验动物进行髓鞘蛋白免疫构建，使中枢神经系统(central nervoussystem，CNS)发生炎性浸润、髓鞘脱失的疾病模型，EAE动物可发生白质和深灰质脱髓鞘，生化、免疫及病理特征都与MS非常相似，因此成为研究MS发病机制和药物治疗临床前试验的重要手段。

与大多数神经变性疾病一样，目前，MS缺乏特异性的治疗方法。临床上用于治疗MS的药物主要是基于抗炎和免疫调节而发挥作用，一般采用干扰素、糖皮质激素、苯二氮

类、肌松剂等对症治疗，但是，上述药物存在毒副作用较大、不良反应较多等缺点限制了其应用。

银杏叶提取物是目前国际上使用最为广泛的中药提取物之一，其中银杏内酯(萜类)是银杏叶提取物及其制剂主要的药效活性成分，具有拮抗血小板活化聚集、降脂、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、保护神经系统等广泛的药理作用。

目前对于单纯的银杏内酯用于治疗多发性硬化症的报道并不多，尤其关于银杏内酯K药理研究还不多，也未有含银杏内酯K的组合物的相关报道研究。

发明内容

本发明以多发性硬化症的经典动物模型-EAE为模型，对含银杏内酯K的组合物进行研究，旨在得到一种具有治疗多发性硬化症的银杏内酯组合物。

由此，本发明提出了银杏内酯组合物在制备治疗多发性硬化症药物中的应用。

具体地，该银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～40)：(50～75):(0.2～5)。

进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～35)：(50～70):(0.5～4)。更进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～30)：(50～65):(0.8～4)。

具体地，多发性硬化症包括临床孤立综合征、缓解复发型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症、进展复发型多发性硬化症、原发进展型多发性硬化症和/或急性多发性硬化症等情形。

进一步地，所述治疗多发性硬化症的药物中，银杏内酯组合物静脉滴注治疗有效量为0.2-0.8mg/kg/d。

具体地，银杏内酯组合物可以使用各种药学上可接受的辅料制备成口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂等。

进一步地，银杏内酯组合物可以制备成片剂、粉针剂、胶囊剂、软膏、栓剂、透皮制剂等等。

本发明还提出了一种银杏内酯组合物在改善中枢神经系统脱髓鞘自身免疫性疾病药物中的应用。

本发明采用背部中线两侧皮下4点注射MOG_33-55与CFA混合乳化抗原、于当天及第2天腹腔注射百日咳毒素制剂复制EAE动物模型，给予银杏内酯组合物药物干预后发现EAE动物神经功能评分显著降低，falling latency时间显著延长，说明银杏内酯组合物能够显著降低EAE发病程度。其次，银杏内酯组合物药物干预后，EAE小鼠血清中IL-17、IFN-γ表达显著减少，IL-4表达显著增加，可见，银杏内酯组合物能够改善由上述细胞因子含量失衡所引发的炎症反应。且本发明提供的含银杏内酯K的组合物与EGb761比较具有更好的作用效果。因此，由对于EAE动物模型的药效证实了银杏内酯组合物具有治疗多发性硬化症的作用，且优于EGb761。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式的内容仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。

银杏内酯类组合物对EAE模型小鼠神经功能及血清中细胞因子含量的影响

1、实验材料

1.1实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，8～10周龄，18～20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2实验药品及试剂

原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制，具体如下：

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白_33-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein_33-55，MOG_33-55，纯度HPLC>96％)由北京奥科生物技术有限公司合成；含有结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(complete freund’s adiuvant，CFA)和百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)均购自Sigma-Aldrich公司；EGb761购自法国益普生药业公司；白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、干扰素-γ(gamma interferon,IFN-γ)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)试剂盒均购自R&D公司。

1.3主要仪器

Rotarod，美国New Brunswick Scientific公司。

2、实验方法

2.1模型建立

MOG_33-55用PBS稀释后与CFA等体积充分混合，用注射器反复抽打制成均匀分散的乳化抗原制剂，于小鼠背部中线两侧皮下4点注射含有300ugMOG_33-55的乳化抗原制剂0.2ml(含结核分枝杆菌的终浓度为4mg/ml)，免疫当天及第2天给予小鼠腹腔注射PTX，诱导小鼠产生EAE。正常对照组小鼠背部中线两侧皮下4点注射等量CAF，免疫当天及第2天给予小鼠腹腔注射等量生理盐水。

2.2分组及给药

取造模成功的C57BL/6小鼠，随机分组，每组10只：正常对照组、模型组、银杏内酯组合物1、2、3、4低、中、高(1.75mg/kg、3.5mg/kg和7mg/kg)剂量治疗组，EGb761低、中、高(1.75mg/kg、3.5mg/kg和7mg/kg)剂量治疗组，每日腹腔注射给药1次，正常对照组、模型组每日腹腔注射等量生理盐水，连续给药40天。

2.3神经功能评分

参照Kono’s5分法(Kono,1988)分别于免疫第3、13、23、30、40天进行神经功能评分，具体标准如下：0分为不发病；1分为尾巴无力、脱垂行走；2分为后肢无力或单侧后肢拖行；3分为后肢瘫痪或双侧后肢拖行；4分为四肢瘫痪；5分为濒临死亡或死亡。症状介于两者之间者，以0.5分计。

2.4行为学检测

于免疫第3、13、23、30、40天进行参照RotarodTest进行行为学检测。具体实施方法如下：将小鼠置于转轴，设定初始转速为4rpm，持续转动20s后匀速增加转速每15s增加1rpm，记录小鼠从转轴掉落时间(falling latency)，每只动物测试3次，然后记录平均值。如果持续转动110s小鼠仍未从转轴掉落，则将小鼠从转轴取下记录falling latency为110s。

2.5血清中细胞因子含量测定

各组动物分别于造模后第20天(发病高峰期)尾静脉取血，室温静置1小时，低温离心取血清，-80℃冰箱保存备用。ELISA法检测血清中IL-17、IFN-γ、IL-4含量，按照说明书进行操作。

2.5数据处理

实验数据均以Mean±SD表示，所有数据用SPSS17.0软件进行分析。采用方差分析统计，p＜0.05有统计学差异。

3实验结果

3.1对EAE小鼠神经功能评分的影响

实验结果表明：小鼠免疫后第8～12天相继发病，第22～26天发病到高峰，与正常对照组比较，EAE模型组小鼠活动减少，出现弓背、尾巴无力、脱垂行走、后肢无力或单侧后肢拖行、后肢瘫痪或双侧后肢拖行、四肢瘫痪、死亡等多种临床表现；而银杏内酯组合物干预后，银杏内酯组合物各剂量组小鼠神经功能评分均低于EAE模型组，病程缩短，临床症状明显减轻，未出现后肢完全瘫痪的严重症状；且与EGb71比较，银杏内酯组合物对神经功能评分的降低、病程的缩短以及临床症状的减轻等更为明显；其中银杏内酯组合物2组效果更加突出，优于其它组合物组，这可能与GB和GK在治疗多发性硬化症上发挥了更主要的药理作用且各组分间在该比例下存在一定的协同关系有关。结果见表1。

表1 银杏内酯组合物对EAE小鼠神经功能评分的影响

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：^*p<0.05，^**p<0.01；与EGb761-中组相比较：^△p<0.05，^△△p<0.01

3.2对EAE小鼠Rotarod行为学实验的影响

实验结果表明：与正常对照组比较，EAE模型组小鼠第23、30及40天fallinglatency时间显著缩短；给予银杏内酯组合物后各剂量组小鼠在转轴停留时间延长，其中第23天开始，小鼠falling latency时间显著延长，且银杏内酯组合物相对于EGb761有更好的功效，两者具有统计学差异。结果见表2。

表2 银杏内酯组合物对EAE小鼠falling latency时间的影响(s)

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：^*p<0.05，^**p<0.01；与EGb761-中组相比较：^△p<0.05，^△△p<0.01

3.3对EAE小鼠血清中细胞因子含量的影响

实验结果表明：与正常对照组比较，EAE模型组小鼠血清中IL-17、IFN-γ含量明显升高，IL-4含量明显降低；银杏内酯各组合物各剂量组均能显著降低EAE小鼠血清中IL-17、IFN-γ的含量，增加EAE小鼠血清中IL-4的表达(P＜0.01)。且总体上看，银杏内酯组合物相对于EGb761的IL-17、IFN-γ含量更低，IL-4的表达更高，两者具有统计学差异。结果见表3。

表3 银杏内酯组合物对EAE小鼠血清中细胞因子含量的影响(pg/mL)

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：*p<0.05，**p<0.01；与EGb761-中组相比较：^△p<0.05，^△△p<0.01

本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种银杏内酯组合物在制备治疗多发性硬化症药物中的应用，其特征在于，

所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40)：(50～75):(0.2～5)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35)：(50～70):(0.5～4)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30)：(50～65):(0.8～4)。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述多发性硬化症药物药物选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射给药剂型剂量为0.2-0.8mg/kg/d。