CN108094672A - 一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能降解花生分离蛋白致敏性的方法，利用双螺杆挤压膨化机对花生分离蛋白进行预处理，挤压膨化后的花生分离蛋白挤出物经干燥、磨粉后将其配置成一定比例的花生分离蛋白溶液，调整溶液的PH至7.0‑9.0，用碱性蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液，最后经冷冻干燥获得低致敏性花生分离蛋白。本发明所述的方法，其加工工艺简单、反应条件温和、反应过程绿色环保，经挤压膨化和酶解的共同作用后的花生分离蛋白致敏性明显降低，其溶解性、乳化性等功能特性得以改善，扩大了花生分离蛋白的受众群体，有效提高了花生分离蛋白品质，具有良好的推广和应用前景，可用于低致敏食物的生产和加工。

Description

一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，特别涉及一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法。

背景技术

花生是我国重要的植物性蛋白食物资源，具有接近动物蛋白含量的营养价值，其中还不包含胆固醇，可利用率高，有利于对成人和儿童的身体健康。花生分离蛋白不仅富含人体多种必需氨基酸，而且拥有特殊的香味和雪白的颜色，这使其优于大豆蛋白，同时花生也是联合国粮农组织公布的8大主要过敏原之一。近年来，随着花生及花生制品种类和数量增加，花生过敏在儿童中的发生率不断增加。显而易见，花生过敏已经严重影响了过敏人群的生活质量，甚至可能危及过敏人群的生命安全，因此，对花生分离蛋白的过敏性进行研究具有重大意义。

目前，于花生过敏在临床上尚无特效疗法，严格避免食用含花生的食品是花生过敏患者的最佳选择。但是由于现在食物配料的多样化，食物组成变得十分复杂，花生过敏患者很难严格避免食用花生制品，并且避免食用含花生的食品也不是最佳选择。研究发现，通过一些物理、化学或生物手段对花生分离蛋白进行改性，破坏花生分离蛋白的三维结构，使花生分离蛋白表现出的过敏原性降低，这些方法主要包括热加工、挤压、超高静压、辐照、酶法处理、糖基化及发酵等。由于花生过敏原成分和结构的复杂性，不同加工处理方式对花生过敏蛋白的影响机理和效果各不相同，传统的加工处理方式对花生致敏性蛋白的影响已不能满足人们的需求。因此，本发明采用挤压膨化协同酶法的复合改性的处理方法来降低花生分离蛋白的致敏性。

酶解改性反应过程温和、产物安全性高、无氨基酸破坏、无有害物质产生，无环境污染且酶解作用过程可控。酶解产物营养价值高、易消化、具有多种生理活性。挤压技术作为一项重要的食品质构重组技术，该技术是集混合、搅拌、剪切、均化、灭菌、成型、膨化和纤维化等为一体的一种新技术，具有功能多样、生产成本低、生产效率和能量利用率高、无污染物排放等优点。

挤压协同酶法的优点：挤压过程中天然的花生分离蛋白发生变性，蛋白质的三级和四级结构的作用力在温度和剪切共同作用下遭到破坏而使蛋白质分子展开，二硫键被破坏，从而包裹的有序状态显露出来，便于蛋白酶作用。蛋白酶可以破坏花生分离蛋白的一些过敏原表位，特别是其构象表位，也可以通过断裂一些化学键来破坏致敏原表位的一级结构，从而降低或者消除花生分离蛋白致敏性。这种挤压协同酶法将为低致敏或无致敏花生制品的开发提供一条很好的途径。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的制备方法。

本发明的另一目的在于，通过在特定挤压温度辅以碱性蛋白酶酶解处理花生分离蛋白，此方法处理花生分离蛋白的操作过程简单，无有机溶剂的加入，所得到的花生分离蛋白致敏性大幅降低。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括以下步骤：

一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，其具体步骤为：

1)测量花生分离蛋白的水分含量，根据花生分离蛋白的水分含量，将蒸馏水和花生分离蛋白加入混合搅拌器中搅拌均匀；

2)采用双螺杆挤压膨化机对上述花生分离蛋白进行挤压膨化预处理；

3)将挤压膨化处理后得到的花生分离蛋白挤出物配置成一定比例的花生分离蛋白溶液，调整花生分离蛋白溶液的PH至7.0-9.0；

4)将花生分离蛋白溶液用碱性蛋白酶酶解，酶解产物经冷冻干燥后，获得低致敏性花生分离蛋白。

其中步骤1)所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，根据105℃恒重法测量花生分离蛋白的初始水分含量，调整花生分离蛋白水分含量为15-55％，搅拌器搅拌5-20min，混合均匀。

所述105℃恒重法测量花生分离蛋白的初始水分含量的具体做法为：取洁净铝制的扁形称量瓶，置于101℃—105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1.0h，取出盖好。置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。将混合均匀的试样称取2g-10g，放入此称量瓶中，试样厚度不超过5mm，加盖，精密称量后，置101℃-105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h-4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量，然后再放入101℃-105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。

其中步骤2)所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，采用双螺杆挤压机，分四个阶段挤压，挤压温度控制为Ⅰ区温度为30-70℃，Ⅱ区温度为40-80℃，Ⅲ区温度为50-100℃，Ⅳ区温度为60-110℃，Ⅴ区温度为70-130℃，喂料速度为5-30kg/h，螺杆转速为100-500rpm/min。将得到的花生分离蛋白挤出物干燥、粉碎后过40-200目筛。

步骤3)所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，取步骤3中所述的样品配置1％-10％的花生分离蛋白溶液，调节PH至7.0-9.0。

步骤4)所述酶活与蛋白底物的比例为1-100U/g进行酶解反应，酶解温度为40-60℃，酶解时间为1.0-6.0h，且反应体系PH保持在7.0-9.0，水解度为11％-30％，反应结束后于沸水浴中加热5-30min灭酶，然后用冰水冷却，将酶解物在8000r/min转速下，25℃离心10min,收集上清液冷冻干燥。

所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白的方法制得的低致敏性花生分离蛋白。

所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白的方法制得的低致敏性花生分离蛋白在花生分离蛋白过敏的人群的应用。

与现有技术相比，本发明具有的优点如下：

本发明利用挤压膨化技术处理花生分离蛋白，在挤压膨化处理的高剪切和高压的作用下对花生分离蛋白的结构进行改善，提高低致敏花生分离蛋白的得率。

本发明代发的低致敏花生分离蛋白，具有较好的风味，易消化吸收，为花生蛋白过敏人群植物蛋白食物的开发提供优质植物蛋白原料；

本发明采用食品级碱性蛋白酶，反应条件温和，经适度酶解后获得特定的花生分离蛋白酶解物，不添加任何添加剂，食用安全。

总之，本发明针对目前低致敏花生分离蛋白产品开发的现状，以花生分离蛋白为原料，经过大量的实验，开发了一种简单高效的低致敏花生分离蛋白的制备方法；得到的花生分离蛋白的致敏性降低了63.2％以上。本发明提供的制备方法可以有效降低致敏花生分离蛋白的产品，较易实现产业化生产，具有巨大的应用前景和市场价值，可广泛用作开发低过敏原性或无过敏原性的花生制品。

附图说明

图1低致敏花生分离蛋白生产工艺流程图；

图2花生分离蛋白过敏原的测定。

具体实施方式

本发明的主要实施例中，为了降低花生蛋白的致敏性，主要通过在酶解工艺之前进行挤压膨化预处理，挤压影响蛋白的空间排列，在挤压过程中蛋白由于分子热运动破坏了束缚力而使分子展开，二硫键被破坏，从而包裹的有序状态显露出来，便于蛋白酶作用，从而有利于改变蛋白的三维结构，降低其致敏性。

本发明将通过以下具体实例作进一步说明。

实施例1：

如图1所示为低致敏花生分离蛋白生产工艺。

1)花生分离蛋白的调制：根据蛋白的初始水分含量，加水调节最终蛋白的水分含量为15％，用搅拌器搅拌15min，混合均匀；

2)挤压膨化预处理：将花生分离蛋白加入双螺杆挤压机中，挤压温度控制为,Ⅰ区温度为30℃，Ⅱ区温度为40℃，Ⅲ区温度为50℃，Ⅳ区温度为60℃，Ⅴ区温度为70℃，喂料速度5kg/h，螺杆转速100rpm/min下进行挤压，获得挤压膨化预处理蛋白。

3)干燥处理：将上述获得的挤压膨化预处理蛋白干燥，粉碎后过80目筛。

4)酶解处理：将干燥粉碎后的蛋白溶于蒸馏水中，蛋白含量为1％，调节PH至8.0，按酶活与蛋白底物的比例为1U/g的量加入碱性蛋白酶进行酶解反应，反应体系温度为50℃，反应时间为3.0h，且反应体系PH保持在8.0，水解度为30％，反应结束后于沸水浴中加热10min灭酶，然后用冰水冷却，将酶解物在8000r/min转速下，25℃离心10min,收集上清液冷冻干燥，得到低致敏性的花生分离蛋白。

2、产品致敏性检测。

通过双抗体一步夹心法ELISA检测产品致敏性变化情况。

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；将挤压膨化协同酶法处理的花生分离蛋白加蒸馏水稀释至2μg/mL，在酶标板上设置的样本孔加入10μL，再加样本稀释液40μL，以未处理花生分离蛋白溶液为对照。然后，在标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加入洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，然后每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min后，每孔加入终止液50μL，15min内在450nm处用酶标仪测定各孔的OD值。

3、产品二级结构检测

利用蛋白二级结构变化解释其致敏性变化情况，采用圆二色谱检测花生分离蛋白二级结构的变化。用JASCO二级结构软件进行蛋白二级结构分析，计算其中α-螺旋(α-heLix)、β-折叠(β-sheet)、β-转角(β-turn)和无规卷曲(Random coils)的含量。结构组成如表1。

检测结果是样品的致敏性降低为63.2％，说明挤压膨化协同酶法处理降低了花生分离蛋白的过敏反应，挤压膨化协同酶法处理改变了花生分离蛋白的氢键、离子键、疏水键和范德华力等化学键，破坏了花生分离蛋白的高级结构，α-螺旋含量显著减少，二级结构受到破坏，其致敏性得到明显改善。

实施例2：

1、低致敏花生分离蛋白生产工艺。

1)花生分离蛋白的调制：根据蛋白的初始水分含量，加水调节最终蛋白的水分含量为55％，用搅拌器搅拌15min，混合均匀；

2)挤压膨化预处理：将花生分离蛋白加入双螺杆挤压机中，挤压温度控制为Ⅰ区温度为60℃，Ⅱ区温度为80℃，Ⅲ区温度为100℃，Ⅴ区温度为120℃，Ⅵ区温度为130℃，喂料速度8kg/h，螺杆转速为500rpm/min下进行挤压，获得挤压膨化预处理蛋白。

3)干燥处理：将上述获得的挤压膨化预处理蛋白干燥，粉碎后过80目筛。

4)酶解处理：将干燥粉碎后的蛋白溶于蒸馏水中，蛋白含量为10％，调节PH至8.0，按酶活与蛋白底物的比例为1U/g的量加入碱性蛋白酶进行水解反应，反应体系温度为40℃，反应时间为2.0h，且反应体系PH一直保持在8.0，水解度为24％，反应结束后于沸水浴中加热10min灭酶，然后用冰水冷却，将酶解物在8000r/min转速下，25℃离心10min,收集上清液冷冻干燥，得到低致敏性的花生分离蛋白。

2.产品致敏性检测。

检测方法同实施例1，检测结果如图2。

3.产品二级结构检测

检测方法同实施例1，二级结构组成如表1。

检测结果是样品的致敏性降低为75.9％，说明挤压膨化协同酶法处理降低了花生分离蛋白的过敏反应，挤压膨化协同酶法处理改变了花生分离蛋白的氢键、离子键、疏水键和范德华力等化学键，破坏了花生分离蛋白的高级结构，α-螺旋含量显著减少，二级结构受到破坏，其致敏性得到明显改善。

实施例3：

1.低致敏花生分离蛋白生产工艺。

1)花生分离蛋白的调制：根据蛋白的初始水分含量，加水调节最终蛋白的水分含量为25％，用搅拌器搅拌15min，混合均匀；

2)挤压膨化预处理：将花生分离蛋白加入双螺杆挤压机中，挤压温度控制为Ⅰ区温度为40℃，Ⅱ区温度为60℃，Ⅲ区温度为80℃，Ⅳ区温度为90℃，Ⅴ区温度为100℃，喂料速度10kg/h，螺杆转速300rpm/min下进行挤压，获得挤压膨化预处理蛋白。

3)干燥处理：将上述获得的挤压预处理蛋白干燥，粉碎后过80目筛。

4)酶解处理：将干燥粉碎后的蛋白溶于蒸馏水中，蛋白含量为8％，调节PH至8.0，按酶活与蛋白底物的比例为100U/g的量加入碱性蛋白酶进行水解反应，反应体系温度为60℃，反应时间为1.0h，且反应体系PH保持在8.0，水解度为11％，反应结束后于沸水浴中加热10min灭酶，然后用冰水冷却，将酶解物在8000r/min转速下，25℃离心10min,收集上清液冷冻干燥，得到低致敏性的花生分离蛋白。

2.产品致敏性检测。

检测方法同实施例1，检测结果如图2。

3.产品二级结构检测

检测方法同实施例1，二级结构组成如表1。

表一花生分离蛋白二级结构的变化

检测结果是样品的致敏性降低为94.7％，说明挤压膨化协同酶法处理降低了花生分离蛋白的过敏反应，挤压膨化协同酶法处理改变了花生分离蛋白的氢键、离子键、疏水键和范德华力等化学键，破坏了花生分离蛋白的高级结构，α-螺旋含量显著减少，二级结构受到破坏，其致敏性得到明显改善。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)测量花生分离蛋白的水分含量，根据花生分离蛋白的水分含量，将蒸馏水和花生分离蛋白加入混合搅拌器中搅拌均匀；

2)采用双螺杆挤压膨化机对上述花生分离蛋白进行挤压膨化预处理；

3)将挤压膨化处理后得到的花生分离蛋白挤出物配置成一定比例的花生分离蛋白溶液，调整花生分离蛋白溶液的PH至7.0-9.0；

4)将花生分离蛋白溶液用碱性蛋白酶酶解，酶解产物经冷冻干燥后，获得低致敏性花生分离蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，其特征在于，所述步骤1)中根据105℃恒重法测量花生分离蛋白的初始水分含量，调整花生分离蛋白水分含量为15-55％，搅拌器搅拌5-20min，混合均匀。

3.根据权利要求1所述的一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用双螺杆挤压膨化机对上述花生分离蛋白进行挤压膨化预处理，具体分四个阶段挤压，挤压温度控制为Ⅰ区温度为30-70℃，Ⅱ区温度为40-80℃，Ⅲ区温度为50-100℃，Ⅳ区温度为60-110℃，Ⅴ区温度为70-130℃，喂料速度为5-30kg/h，螺杆转速为100-500rpm/min。将得到的花生分离蛋白挤出物干燥、粉碎后过40-200目筛。

4.根据权利要求1所述的一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，其特征在于，所述步骤3)中花生分离蛋白溶液的质量分数为1％-10％。

5.根据权利要求1所述的一种挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白致敏性的方法，其特征在于，所述步骤4)酶活与蛋白底物的比例为1-100U/g进行酶解反应，酶解温度为40-60℃，酶解时间为1.0-6.0h，且反应体系PH保持在7.0-9.0，水解度为11％-30％，反应结束后于沸水浴中加热5-30min灭酶；然后用冰水冷却，将酶解物在8000r/min转速下，25℃离心10min，收集上清液冷冻干燥。

6.根据权利要求1-5任一所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白的方法制得的低致敏性花生分离蛋白。

7.根据权利要求1-5任一所述的挤压膨化协同酶法降低花生分离蛋白的方法制得的低致敏性花生分离蛋白在花生分离蛋白过敏的人群中的应用。