CN108070674B - 一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的scar-pcr鉴定方法 - Google Patents

一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的scar-pcr鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食用菌分子标记辅助育种领域，更具体涉及一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR‑PCR鉴定方法。该方法利用SCAR分子标记对不同交配型的双孢蘑菇同核不育菌株进行PCR特异扩增。本发明的方法不用复杂的杂交配对试验，特异性地鉴别双孢蘑菇菌株同核不育单孢菌株的交配型，该方法耗时短，操作简便，特异性强，根据特异性扩增产物1283bp条带的有无来鉴定交配型为A+的不育单孢菌株，根据特异性扩增产物860bp条带的有无来鉴定交配型为A‑的不育单孢菌株。该方法可以在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定同核不育菌株的交配型，极大的提高了双孢蘑菇杂交育种的效率。

Description

一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法
技术领域
本发明属于食用菌分子标记辅助育种领域，更具体涉及双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法。
背景技术
双孢蘑菇属于二极性次级同宗结合的食用菌，大多数担孢子是异核可育的, 不能用于杂交，只有同核孢子萌发的同核体菌株才能用于杂交。我们应用同工酶或DNA指纹标记，在菌丝阶段可以对异核体和同核体进行区分和鉴定，大大提高了双孢蘑菇杂交育种效率。但不同的同核体菌株仍存在相同或不同的交配型，只有具不同交配型因子的同核体之间才有可能配对成功，随机配对获得杂交子的成功率不够高。前人研究表明，双孢蘑菇是单因子交配型系统，由单个A位点控制（A+/A-），交配型A因子与mip基因紧密连锁。虽然双孢蘑菇基因组序列已于2010年公布，但A因子的序列尚未见报道。为了更有效地开展育种工作，我们开展了双孢蘑菇亲和性因子的研究，寻找与其性亲和性因子相关的分子标记，通过分子生物学手段，以与交配型A因子紧密连锁的mip基因为切入点，利用生物信息学技术结合双孢蘑菇的基因组数据库，以期获得双孢蘑菇交配型A因子的序列，并开发相关的分子标记。近年来发展的DNA分子标记辅助育种技术是食用菌定向辅助育种的一个重要方向。SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，特征序列扩增区域）标记由于检测方便、快速、可靠，可快速检测大量个体等众多优点已成为目前分子标记在育种实践中能直接应用的首选标记。
2015年我所承担了福建省科技厅公益类科研院所专项“双孢蘑菇交配型基因的克隆及基于交配型等位基因差异的SCAR标记的发掘”，项目组在原有基础上经多次实验，开发了一组鉴别不同交配型的双孢蘑菇同核不育单孢菌株的SCAR分子标记，利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速的鉴定同核不育单孢菌株的交配型，省时省力，这对杂交育种中缩短育种周期、提高育种效率及定向筛选有着重要的意义。
发明内容
本发明基于分子标记技术，提供一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法。
本发明的双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法，是利用SCAR分子标记对不同交配型的双孢蘑菇同核不育单孢菌株进行PCR扩增。
利用特异引物对交配型为A+的双孢蘑菇同核不育单孢菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR，能特异性的扩增出1283bp的产物，所述特异引物的核昔酸序列为：
Mat1F: 5’-TGCGAGACGAAGGCGAGGAGTTTAA-3’
Mat1R:5’-ATTCATCAAG GAATAACTGG ACTCTA-3’。
利用特异引物对交配型为A-的双孢蘑菇同核不育单孢菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR，能特异性的扩增出860bp的产物，所述特异引物的核昔酸序列为：
Mat2F：5’- CGCTATATGGACGCGGCCAAACAGGAC-3’
Mat2R：5’- CAGTTTCCCC CAATACCATC CCCGG-3’。
所述的SCAR-PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应体系为：模板DNA 30ng，引物Mat1F30ng，引物Mat1R 30ng，引物Mat2F 30ng，引物Mat2R 30ng ，dNTPs 0.1 mmol/L，MgCl2 2.5mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，PCR缓冲液10µL，用ddH2O将总体积补至20µL。
本发明的优点在于：本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇同核不育单孢的交配型，该方法耗时短，操作简便，特异性强，鉴定准确且省时省力。根据特异性扩增产物1283bp条带的有无来鉴定交配型为A+的不育单孢菌株，根据特异性扩增产物860bp条带的有无来鉴定交配型为A-的不育单孢菌株。应用本发明的方法，不育单孢的交配型只需一天的试验时间即可鉴定，而通过常规杂交配对的鉴定方法，需要耗时30-45天，且无法准确鉴定。
附图说明
图1为17个不同交配型的双孢蘑菇同核不育单孢菌株的SCAR-PCR扩增产物图谱。泳道1-17为表1中编号1-17的菌株;M: λDNA/EcoRI+HindIII Markers。
具体实施方式
实施例1
1、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2 、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，引物委托上海生工有限公司合成，DNA序列上海生工有限公司测序。
2、17个不同交配型的双孢蘑菇同核不育单孢菌株来源于福建省农业科学院食用菌研究所遗传育种研究室，其菌株编号和菌株名称参见（表一）
3、双孢蘑菇DNA提取与电泳
双孢蘑菇DNA提取与DNA电泳按照文献[陈美元，廖剑华，李洪荣，郭仲杰，卢政辉，蔡丹凤，王泽生. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报，2009，(04)：149-156.]。
4、SCAR-PCR反应体系与条件
反应体系为： 模板DNA 30ng，引物Mat1F 30ng，引物Mat1R 30ng，引物Mat2F30ng，引物Mat2R 30ng ，dNTPs 0.1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，PCR缓冲液1×，用ddH2O将总体积补至20µL。扩增条件为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min， 4℃保存。PCR产物电泳按照文献[陈美元，廖剑华，王波，李洪荣，卢政辉，郭仲杰，蔡丹凤，王泽生. 中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 食用菌学报，2009，(01)：11-16.]。
5、结果分析
SCAR-PCR检测结果如图1，1-8号为交配型为A+的双孢蘑菇同核不育单孢菌株，检出特异性SCAR-PCR产物(1283bp)，检出阳性率,100%。9-17号为交配型为A-的双孢蘑菇同核不育单孢菌株，检出特异性SCAR-PCR产物(860bp)，检出阳性率,100%。可见，该组引物及其扩增的PCR标记条带可以对双孢蘑菇不同交配型的同核不育单孢菌株进行有力地区分和鉴定。
表1：图1中的17个菌株编号及菌株名称
表1 供试菌株编号及来源
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：以上菌株的交配型是通过不育单孢之间两两配对进行分类的，其中，以9608为出发菌株，进行菌株间两两杂交配对，根据同种交配型杂交不亲和性原理，以出发菌株9608为A+,能与之配对的为A-。以上菌株均由保藏于福建省农业科学院食用菌研究所。
2、该发明中特异PCR扩增产物的序列（1283bp）及引物所在位置
5’-TGCGAGACGAAGGCGAGGAGTTTAATGTACGCCGGTATTTGGGGAATAGTTCGGTTGGGCGTGCTGGTTGAGCACATTTGGAAGGCTCTGTCAATTGATTGTAATTTACAGATGCTGGATGTCGCTTTGGGTAGAGACGATGGTACGACCAGGGCTCGAAAGTATCAGACGTTTCTTCTGGACATTCCAAAGATGTTCGTTTACATAGCGAGCTGCGGAAATGCAATTTTGAAGCAAAACTCTCAGCGATCTGTTCGTCGATGTTGCTATCAAGAGCTTTTCGTTTACGTGACCGTGAATCGGGTTGAAGTTCACGAGGCCAAGTGAAAGAACCCAGGTTGGGCTCCACAGGACATTCCCAAAAAGCTTTCATATCTTTTTCGCTGTATGAACGCGGCCAAACAGCATCGGGTGGGAGGCAAAAGAAATCGAAGTCCTGTGTTGAAGTTGAGGGCACGGGGGAAAGTGCCAGTGGCTCATCCTTAATTAGGCCATCAGTAGGTTTGCAGCAAGTCTATGATAGACGTAGACTTACAGTTGCAACGCGTCGTTTCTTTGGCAAAGGCATGTCATCGTCTTCCGGTGTAGTGACTCTCGATGTGGGAGAATCTTCGCTGGAAAATTCTGGAGATCCCTCGATATCAGGCCGCTTGAGGGGTATTCCTTTCCTTTTCTCTCGCGTGCGATGATTTTGAAACTGATTTCGTTTTCATATTCAAACAAGTACATATTCAAGATATGGACTGACTTACCCAATCGTAGATTTGTTTGACTGTCATACCTGTTTTAGTTGCCAGTATAACCTTGTCTTGGTGAGTGGGATATGCATTTTGGGCGAAGTATTTTTTCAGAAAAGGTGTCCATTCCTTGAAAAACATCAATAAATAATCGCTCAAGGAATCCATCACTTACAGGCTTGAAAACTGGCCGCTCATCTGTAGAACTAGCTTGTTTTAAGCGTTCTTGAACTCGTATGGAAGCAGCCTGGAGAATGGCTTCCTGCCAACTGGTGATGTTTCGAGAATAACGTGCATCGAGGACACGGTTTATATGTTTGGCGAGATTGCGCAGCTCAGTATTGGAGGAATATTTACTGAGCCGTCGGAAGAGTTTTTCATAGTGACGCTCGTAAGTCGACTGCAAATCTTTCACACGTGATGCAAATATGTTCGCGGCTTCCTGAGACTCTTCGAAAGCGCATCCTAGTTGCACGAGTTGGGCCGCCGGGGATGGTATTGGGGGAAACTGTAGAGGAGGTAGAGTCCAGTTATTCCTTGATGA AT-3’。
3、该发明中特异PCR扩增产物的序列（860bp）及引物所在位置
5’-CGCTATATGGACGCGGCCAAACAGGACTGGGTGGGAGGCGAAAGAAATCGAAGTCTTGTGTTGAAGTTGAGGGCACGGGGGAAGGTGCCAGTAGCTCATCCTGTATTTGGCCATCAGCAGACGCAAGTCTATAATAGACATAAACGTACAGTCGCAATGCGTCGTTTTTTGGACAGAGGCATGTCGTCGCCTTCAGGTGTAGTGACTCTCGATGTGGGAGAATCTTCGCTAGAAAAATCTGGAGATCCCTCGTTATCAGGCCGTTTGAGAGGTATTCCTTTTCTTTTCTCTCGCGTGCGATGATTTTGAAACTGAGTTTGTTTTCATATTCAGAAGTTTCATATTCAAGTATGTGCCGACTTACCCAATCGTATATTTGTTTGACTGTCATACCTGTTTTAGTTGCCAATATAACCTTGTCTTGGTGGGTGGGGTATGCATTTTGGGCAAAGTATTTTTTCAAAAAAGGTGTCCATTCCTAAAGAAACATCAGTAAAGAATCGCTCAAGGAATCGATAACATACAGGCTTGAAAGCTGGCCGCTCATCTGTAGAACTAGCTTGTTTAGAGCGTTCTTGAACTCGCAGGGAAGCAGCCTGGAGAATGGTTTCCTGCCAAGTGGTGATGTTTCGAGAGTAACGTGCGTCGAGGACATGGTTCATATGTTTGGCGAGATTGCGCAACTCGGTACTGGAGGAATATTTACTGAGCCGTCGGAAAAGTTTCTCATAGTGACGCTCATAAGTCGACTGCAGATCTTTCACACGTGATGCAAATACGTTCGCAGCTTCCTGAGACTCTTCGAAAGTGCATCCTAGTTGCACGAGTTGTGCCACCGGGGATGGTATTGGGGGAAACTG-3’。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院食用菌研究所
<120> 一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcgagacga aggcgaggag tttaa 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attcatcaag gaataactgg actcta 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgctatatgg acgcggccaa acaggac 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagtttcccc caataccatc cccgg 25
<210> 5
<211> 1283
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgcgagacga aggcgaggag tttaatgtac gccggtattt ggggaatagt tcggttgggc 60
gtgctggttg agcacatttg gaaggctctg tcaattgatt gtaatttaca gatgctggat 120
gtcgctttgg gtagagacga tggtacgacc agggctcgaa agtatcagac gtttcttctg 180
gacattccaa agatgttcgt ttacatagcg agctgcggaa atgcaatttt gaagcaaaac 240
tctcagcgat ctgttcgtcg atgttgctat caagagcttt tcgtttacgt gaccgtgaat 300
cgggttgaag ttcacgaggc caagtgaaag aacccaggtt gggctccaca ggacattccc 360
aaaaagcttt catatctttt tcgctgtatg aacgcggcca aacagcatcg ggtgggaggc 420
aaaagaaatc gaagtcctgt gttgaagttg agggcacggg ggaaagtgcc agtggctcat 480
ccttaattag gccatcagta ggtttgcagc aagtctatga tagacgtaga cttacagttg 540
caacgcgtcg tttctttggc aaaggcatgt catcgtcttc cggtgtagtg actctcgatg 600
tgggagaatc ttcgctggaa aattctggag atccctcgat atcaggccgc ttgaggggta 660
ttcctttcct tttctctcgc gtgcgatgat tttgaaactg atttcgtttt catattcaaa 720
caagtacata ttcaagatat ggactgactt acccaatcgt agatttgttt gactgtcata 780
cctgttttag ttgccagtat aaccttgtct tggtgagtgg gatatgcatt ttgggcgaag 840
tattttttca gaaaaggtgt ccattccttg aaaaacatca ataaataatc gctcaaggaa 900
tccatcactt acaggcttga aaactggccg ctcatctgta gaactagctt gttttaagcg 960
ttcttgaact cgtatggaag cagcctggag aatggcttcc tgccaactgg tgatgtttcg 1020
agaataacgt gcatcgagga cacggtttat atgtttggcg agattgcgca gctcagtatt 1080
ggaggaatat ttactgagcc gtcggaagag tttttcatag tgacgctcgt aagtcgactg 1140
caaatctttc acacgtgatg caaatatgtt cgcggcttcc tgagactctt cgaaagcgca 1200
tcctagttgc acgagttggg ccgccgggga tggtattggg ggaaactgta gaggaggtag 1260
agtccagtta ttccttgatg aat 1283
<210> 6
<211> 860
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgctatatgg acgcggccaa acaggactgg gtgggaggcg aaagaaatcg aagtcttgtg 60
ttgaagttga gggcacgggg gaaggtgcca gtagctcatc ctgtatttgg ccatcagcag 120
acgcaagtct ataatagaca taaacgtaca gtcgcaatgc gtcgtttttt ggacagaggc 180
atgtcgtcgc cttcaggtgt agtgactctc gatgtgggag aatcttcgct agaaaaatct 240
ggagatccct cgttatcagg ccgtttgaga ggtattcctt ttcttttctc tcgcgtgcga 300
tgattttgaa actgagtttg ttttcatatt cagaagtttc atattcaagt atgtgccgac 360
ttacccaatc gtatatttgt ttgactgtca tacctgtttt agttgccaat ataaccttgt 420
cttggtgggt ggggtatgca ttttgggcaa agtatttttt caaaaaaggt gtccattcct 480
aaagaaacat cagtaaagaa tcgctcaagg aatcgataac atacaggctt gaaagctggc 540
cgctcatctg tagaactagc ttgtttagag cgttcttgaa ctcgcaggga agcagcctgg 600
agaatggttt cctgccaagt ggtgatgttt cgagagtaac gtgcgtcgag gacatggttc 660
atatgtttgg cgagattgcg caactcggta ctggaggaat atttactgag ccgtcggaaa 720
agtttctcat agtgacgctc ataagtcgac tgcagatctt tcacacgtga tgcaaatacg 780
ttcgcagctt cctgagactc ttcgaaagtg catcctagtt gcacgagttg tgccaccggg 840
gatggtattg ggggaaactg 860

Claims (3)

1.一种双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用特异引物对双孢蘑菇同核不育单孢菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，所述特异引物的核苷酸序列为：
Mat1F: 5’-TGCGAGACGAAGGCGAGGAGTTTAA-3’，
Mat1R:5’-ATTCATCAAG GAATAACTGG ACTCTA-3’；
Mat2F：5’- CGCTATATGGACGCGGCCAAACAGGAC-3’ ，
Mat2R：5’- CAGTTTCCCC CAATACCATC CCCGG-3’；
利用所述的特异引物对Mat1F和Mat1R扩增获得的产物仅为1283bp，鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型为A+ ；利用所述的特异引物对Mat2F和Mat2R扩增获得的产物仅为860bp，鉴定双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型为A- 。
2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：所述SCAR-PCR扩增的条件为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min， 4℃保存。
3. 根据权利要求1所述的双孢蘑菇同核不育单孢菌株交配型的SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：所述SCAR-PCR扩增的反应体系为： 模板DNA 30ng，引物Mat1F 30ng，引物Mat1R30ng，引物Mat2F 30ng，引物Mat2R 30ng，dNTPs 0.1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，1×PCR缓冲液10µL，用ddH2O将总体积补至20µL。
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Genome sequence of the button mushroom Agaricus bisporus reveals mechanisms governing adaptation to a humic-rich ecological niche;Emmanuelle Morin et al.;《Proc Natl Acad Sci USA》;20121023;第109卷(第43期);第17501-17506页 *
双孢蘑菇不同交配型同核不育单孢的基因组文库构建;蔡志欣 等;《福建农业学报》;20171215;第1327-1331页 *
双孢蘑菇性亲和性相关分子标记的初步筛选;詹才新 等;《食用菌学报》;20021220;第9卷(第4期);摘要段，第1页最后1段-第2页第1段，第7页第1，3段 *

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