CN103789448A - 一种双孢蘑菇菌株子实体颜色scar-pcr鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食用菌分子标记辅助育种领域，更具体涉及一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法。该方法利用SCAR分子标记对双孢蘑菇棕色菌株进行PCR特异扩增，从而鉴定菌株的子实体颜色。本发明的方法用于不用出菇试验，特异性地鉴别双孢蘑菇菌株子实体颜色，该方法耗时短，操作简便，特异性强，只针对双孢蘑菇棕色菌株特异性扩增出1273bp的产物，可以在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定菌株的子实体颜色，极大的提高了双孢蘑菇杂交育种的效率。

Description

一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法
技术领域
本发明属于食用菌分子标记辅助育种领域，更具体涉及一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法。
背景技术
双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，具有重要的经济价值。目前，我国的双孢蘑菇主栽品种单一，当家品种As2796从育种至今已使用二十年，面临着商业菌株不可避免的退化问题。另一方面，由于产业持续健康发展的需要及生产和市场的日渐多样化需求亟须选育一些适合不同用途的专用优良新菌株。近年来，福建省农业科学院食用菌研究所（本发明人单位）收集了具有我国自主知识产权的野生双孢蘑菇种质资源，如何快速评价和利用这些野生种质成为新品种选育的关键。野生种质中很大一部分菌株为棕色，在利用野生种质进行杂交选育的过程中如何根据市场需求对杂交后代进行颜色性状的筛选是育种工作面临的一个重要问题。传统的筛选手段盲目性强，需要进行出菇来筛选，工作量巨大，急需开展颜色性状定向遗传筛选的研究。
近年来发展的DNA分子标记辅助育种技术是食用菌定向辅助育种的一个重要方向。SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，特征序列扩增区域）标记由于检测方便、快速、可靠，可快速检测大量个体等众多优点已成为目前分子标记在育种实践中能直接应用的首选标记。
2011年我所承担了福建省科技厅公益类科研院所专项“双孢蘑菇SCAR标记的发掘及其辅助育种平台的建立”，项目组在原有基础上经多次实验，取得了一个与双孢蘑菇菌株子实体颜色紧密连锁的分子标记，利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速的鉴定菌株的子实体颜色，不用出菇试验，省时省力，这对杂交育种中缩短育种周期、提高育种效率及定向筛选有着重要的意义。 
发明内容
本发明基于分子标记技术，建立一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法。
本发明的一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法，是利用SCAR分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR特异扩增，从而鉴定菌株的子实体颜色。
本发明利用特异引物对双孢蘑菇菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，所述特异引物的核苷酸序列为：
SCAR4-F：5’-CAAGTACTGAAAGTGTACTA-3’， 
SCAR4-R：5’-GAGCCTTTCCATGTGCTCAC-3’。
利用所述特异引物对双孢蘑菇菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，特异性地扩增出1273bp的产物，其中菌株子实体颜色为棕色的扩增为阳性，菌株子实体颜色为白色的扩增为阴性。
所述SCAR-PCR扩增的条件为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min， 4℃保存。
所述SCAR-PCR扩增的反应体系为： 模板DNA 30ng，上游引物30ng，下游引物30ng，dNTPs 0.1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，1×PCR缓冲液10μL，用ddH2O将总体积补至20μL。
本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇菌株子实体颜色，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物1273bp条带的有无来鉴定菌株的子实体颜色，扩增产物呈阳性的菌株子实体颜色为棕色，扩增产物呈阴性的菌株子实体颜色为白色。
附图说明
图1为44个双孢蘑菇菌株的SCAR-PCR扩增产物图谱。
具体实施方式：
实施例1：
1、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2 、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，DNA序列上海生工有限公司测序，引物委托上海生工有限公司合成，引物的核苷酸序列为：
SCAR4-F：5’-CAAGTACTGAAAGTGTACTA-3’， 
SCAR4-R：5’-GAGCCTTTCCATGTGCTCAC-3’。
2、44个双孢蘑菇菌株来源于福建省农业科学院食用菌研究所遗传育种研究室，其菌株编号和菌株名称参见（附录：表一）
3、双孢蘑菇DNA提取与电泳
双孢蘑菇DNA提取与DNA电泳按照文献[陈美元，廖剑华，李洪荣，郭仲杰，卢政辉，蔡丹凤，王泽生. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报，2009，(04)：149-156.]。
4、SCAR-PCR反应体系与条件
反应体系为： 模板DNA 30ng，上游引物30ng，下游引物30ng，dNTPs 0.1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，1×PCR缓冲液10μL，用ddH2O将总体积补至20μL。扩增条件为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min， 4℃保存。PCR产物电泳按照文献[陈美元，廖剑华，王波，李洪荣，卢政辉，郭仲杰，蔡丹凤，王泽生. 中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 食用菌学报，2009，(01)：11-16.]。
5、结果分析
SCAR-PCR检测结果如图1，1-22号为双孢蘑菇棕色菌株，检出特异性SCAR-PCR产物(1273bp)，检出阳性率100%。23-44号为双孢蘑菇白色菌株，均未检出PCR产物，检出阳性率为0%。可见，该标记与双孢蘑菇菌株子实体棕色性状紧密连锁。该方法可以对双孢蘑菇菌株的子实体颜色进行有力地区分和鉴定。
附录：
1、表1：图1中的44个菌株编号及菌株名称
注：其中B表示Brown，子实体棕色。W表示White，子实体白色。
 序列表
 
<110>  福建省农业科学院食用菌研究所
 
<120>  一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
caagtactga aagtgtacta                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gagcctttcc atgtgctcac                                                 20
 
 

Claims (5)

1.一种双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用SCAR分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR特异扩增，从而鉴定菌株的子实体颜色。
2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用特异引物对双孢蘑菇菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，所述特异引物的核苷酸序列为：
SCAR4-F：5’-CAAGTACTGAAAGTGTACTA-3’， 
SCAR4-R：5’-GAGCCTTTCCATGTGCTCAC-3’。
3.根据权利要求2所述的双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用所述特异引物对双孢蘑菇菌株的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，特异性地扩增出1273bp的产物，其中菌株子实体颜色为棕色的扩增为阳性，菌株子实体颜色为白色的扩增为阴性。
4.根据权利要求2所述的双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：所述SCAR-PCR扩增的条件为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸10min， 4℃保存。
5.根据权利要求2所述的双孢蘑菇菌株子实体颜色SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：所述SCAR-PCR扩增的反应体系为： 模板DNA 30ng，上游引物30ng，下游引物30ng，dNTPs 0.1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，1×PCR缓冲液10μL，用ddH2O将总体积补至20μL。
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