CN108064694A - 一种黄水枝的组培快繁方法 - Google Patents

一种黄水枝的组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种黄水枝的组培快繁方法，包括以下步骤：预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，冲洗，消毒处理，剪切，得到消毒灭菌后的外植体；初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；生根培养：取所述丛生芽的单芽接种于生根培养基进行生根培养，得到组培生根苗；炼苗移栽：将所述组培生根苗壮苗进行炼苗，移栽；利用组培快繁技术进行培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工，且培养时间短，培养流程简便，黄水枝繁殖的效率，增殖系数高，得到的组培苗炼苗成活率高。

Description

一种黄水枝的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及组培快繁技术领域，具体涉及一种黄水枝的组培快繁方法。
背景技术
黄水枝，草本，茎高10～70cm，被柔毛和腺毛，根状茎斜上。基生叶数个，近心形或宽卵形，常3～5浅裂，长2～8cm，宽2～10cm，先端急尖，基部心形，边缘有钝齿，叶片两面均疏被伏毛；叶柄长达15cm，被腺状长柔毛；托叶膜质，褐色。茎生叶2～3片，有短柄。总状花序顶生或腋生，长达20cm，密生腺毛；花白色或淡红色；萼片长约2mm，狭卵形；花瓣针形或无花瓣；雄蕊10，伸出花外。蒴果两片不同大，长的1片可达1cm。花期4～5月，果期6～7月。全草供药用。功能较广，具有清热解毒，活血祛瘀，消肿止痛的功效；主治痈疖肿毒，跌打损伤，肝炎，咳嗽气喘。但目前，对黄水枝培养方法研究较少。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种黄水枝的组培快繁方法，利用组培快繁技术进行培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工，且培养时间短，培养流程简便，黄水枝繁殖的效率，增殖系数高，得到的组培生根苗炼苗成活率高。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种黄水枝的组培快繁方法，包括以下步骤：
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，冲洗，消毒处理，剪切，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5mg/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA，0.05～0.2％PVP；
增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5g/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA；
生根培养：取所述丛生芽的单芽接种于生根培养基进行生根培养，得到组培生根苗；所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.05～0.1mg/LNAA；
炼苗移栽：将所述组培生根苗将所述壮苗进行炼苗，移栽。
本发明上述0.05～0.2％PVP为所述诱导培养基中PVP含量为0.05～0.2wt％。
优选的，所述预处理过程具体为：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，流水冲洗20～40min，酒精消毒20～40s，升汞消毒3～7min，剪切，得到消毒灭菌后的外植体。
优选的，所述预处理过程具体为：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，流水冲洗20～40min，75Vol％酒精消毒20～40s，0.1wt％升汞消毒3～7min，剪切为长度1cm，得到消毒灭菌后的外植体。
优选的，所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，0.1％PVP。
本发明上述0.1％PVP为所述诱导培养基中PVP含量为0.1wt％。
优选的，所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA。
优选的，所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.1mg/LNAA。
优选的，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.7～6.5。
优选的，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.8。
优选的，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基均还包括蔗糖和琼脂，所述诱导培养基中蔗糖含量、所述增殖培养中蔗糖含量和所述生根培养基中蔗糖含量均为3wt％，所述诱导培养基中琼脂、所述增殖培养中琼脂含量和所述生根培养基中琼脂含量均为0.7wt％。
优选的，所述初代培养过程培养时间为28～32d。
优选的，所述生根培养过程培养时间为18～22d。
优选的，所述初代培养、所述增殖培养和所述生根培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。
优选的，所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。
优选的，所述炼苗移栽过程具体为：将所述组培生根苗至于荫棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养。
优选的，所述苗床的基质包括：草炭和蛭石，所述草炭和所述蛭石体积比为7:3。
优选的，闭瓶炼苗时间为2d。
优选的，开瓶炼苗时间为3d。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本申请技术方案提供了一种黄水枝的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、初代培养、增殖培养、生根培养的步骤，通过对诱导初代培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低，配合各阶段的培养条件，得到的组培生根苗培养时间短，培养流程简便，提高了黄水枝繁殖的效率，增殖系数较高为8；能快速获得遗传性状一致的黄水枝组培生根苗，组培生根苗炼苗成活率高，为90％以上。利用组培快繁技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例1中初代培养过程消毒灭菌后的外植体诱导出芽的情况；
图2示出了本发明实施例1中增殖培养过程不定芽增殖情况；
图3示出了本发明实施例1中生根培养过程组培生根苗生根情况；
图4示出了本发明实施例1中生根培养得到的组培生根苗根系情况。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供了一种黄水枝的组培快繁方法，包括以下步骤：
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，冲洗，消毒处理，剪切，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5mg/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA，0.05～0.2％PVP；
增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5g/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA；
生根培养：取所述丛生芽的单芽接种于生根培养基进行生根培养，得到组培生根苗；所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.05～0.1mg/LNAA；
炼苗移栽：将所述组培生根苗将所述壮苗进行炼苗，移栽。
本发明上述0.05～0.2％PVP为所述诱导培养基中PVP含量为0.05～0.2wt％。
按照本发明，所述预处理过程具体为：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，流水冲洗20～40min，酒精消毒20～40s，升汞消毒3～7min，剪切，得到消毒灭菌后的外植体。优选的，所述预处理过程具体为：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，流水冲洗20～40min，75Vol％酒精消毒20～40s，0.1wt％升汞消毒3～7min，剪切为长度1cm，得到消毒灭菌后的外植体。
按照本发明，所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，0.1％PVP。所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA。所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.1mg/LNAA。
本发明上述0.1％PVP为所述诱导培养基中PVP含量为0.1wt％。
按照本发明，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.7～6.5。优选的，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.8。
按照本发明，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基均还包括蔗糖和琼脂，所述诱导培养基中蔗糖含量、所述增殖培养中蔗糖含量和所述生根培养基中蔗糖含量均为3wt％，所述诱导培养基中琼脂、所述增殖培养中琼脂含量和所述生根培养基中琼脂含量均为0.7wt％。
按照本发明，所述初代培养过程培养时间为28～32d。所述生根培养过程培养时间为18～22d。
按照本发明，所述初代培养、所述增殖培养和所述生根培养基过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。
按照本发明，所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。
按照本发明，所述炼苗移栽过程具体为：将所述组培生根苗至于荫棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养。优选的，所述苗床的基质包括：草炭和蛭石，所述草炭和所述蛭石体积比为7:3。优选的，闭瓶炼苗时间为2d。优选的，开瓶炼苗时间为3d。
实施例1
黄水枝的组培快繁方法，包括以下步骤：
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，洗衣粉清洗，流水冲洗20～40min，75Vol％酒精消毒20～40s，0.1wt％升汞消毒3～7min，剪切为长度1cm，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5mg/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA，0.05～0.2％PVP；0.05～0.2％PVP为所述诱导培养基中PVP含量为0.05～0.2wt％
增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5g/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA；
生根培养：取所述丛生芽单芽接种于生根培养基进行生根培养，得到组培生根苗；所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.05～0.1mg/LNAA；
炼苗移栽：将所述组培生根苗至于荫棚中，经闭瓶炼苗2d，开瓶炼苗3d后，移栽进苗床中培养。
其中，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.7～6.5。所述初代培养、所述增殖培养和所述生根培养基过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h按照本发明，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基均还包括蔗糖和琼脂，所述诱导培养基中蔗糖含量、所述增殖培养中蔗糖含量和所述生根培养基中蔗糖含量均为3wt％，所述诱导培养基中琼脂、所述增殖培养中琼脂含量和所述生根培养基中琼脂含量均为0.7wt％。所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。
本实施例中，所述初代培养过程消毒灭菌后的外植体诱导出芽的情况见图1；所述增殖培养过程生根不定芽增殖情况见图2；所述生根培养过程组培生根苗生根情况见图3；所述生根培养得到的组培生根苗根系情况见图4。所述初代培养过程培养时间为28～32d。所述生根培养过程培养时间为18～22d，增殖系数为8，炼苗成活率90％以上。
实施例2
诱导培养基中组分对不定芽生长的影响
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，洗衣粉清洗，流水冲洗20～40min，75Vol％酒精消毒20～40s，0.1wt％升汞消毒3～7min，剪切为长度1cm，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；诱导培养基采用MS基本培养基，补充6-BA，NAA，PVP，3％蔗糖，0.7％琼脂，所述诱导培养基pH值为5.8；所述初代培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。
根据诱导培养基中6-BA浓度、NAA浓度、PVP含量进行分组，观察并记录初代培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表1。
表1
从上表可以看出，6-BA浓度为1.0mg/L，NAA浓度为0.05mg/L，PVP含量0.1wt％时，分化率最高，培养天数最短，为诱导培养基的最适合的生长激素组成条件；6-BA，NAA，PVP三种组分共同作用，保证了本发明初代培养过程的进行。
实施例3
增殖培养基中生长激素浓度对丛生芽生长的影响
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，洗衣粉清洗，流水冲洗20～40min，75Vol％酒精消毒20～40s，0.1wt％升汞消毒3～7min，剪切为长度1cm，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；诱导培养基采用MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，0.1％PVP，3％蔗糖，0.7％琼脂；
增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充6-BA，NAA，3％蔗糖，0.7％琼脂；
所述诱导培养基、增殖培养基pH值为5.8；所述初代培养、增殖培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h；
根据增殖培养基中6-BA浓度、NAA浓度含量进行分组，观察并记录增殖培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表2。
表2
从上表可以看出，6-BA浓度为1.0mg/L，NAA浓度为0.05mg/L时，分化率最高，平均初代丛生芽株高最高，为增殖培养基的最适合的生长激素组成条件。
实施例4
生根培养基中生长激素浓度对丛生芽生长的影响
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，洗衣粉清洗，流水冲洗20～40min，75Vol％酒精消毒20～40s，0.1wt％升汞消毒3～7min，剪切为长度1cm，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；诱导培养基采用MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，0.1％PVP，3％蔗糖，0.7％琼脂；
增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，3％蔗糖，0.7％琼脂；
生根培养：取所述丛生芽的单芽接种于生根培养基进行生根培养，得到组培生根苗；所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充NAA；
所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养pH值均为5.8；所述初代培养、增殖培养和生根培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h；
根据生根培养中NAA浓度含量进行分组，观察并记录生根培养过程中的培养情况，具体分组及培养结果见表3。
表3
从上表可以看出，NAA浓度为0.1mg/L时，生根率最高，培养时间最短为生根培养基的最适合的生长激素组成条件。
本发明中，培养基成分解释：
MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组培快繁快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
1/2MS基本固体培养基为MS基本培养基中，大量元素减半，其余不变形成的培养基。
NAA：所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组培快繁，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
6-BA：所述6-BA为6-苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素，可促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。
PVP：所述PVP为聚乙烯吡咯烷酮，作为吸附剂，吸附酚类物质。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种黄水枝的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，冲洗，消毒处理，剪切，得到消毒灭菌后的外植体；
初代培养：取所述消毒灭菌后的外植体接种于诱导培养基进行初代培养，得到不定芽；所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5mg/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA，0.05～0.2％PVP；
增殖培养：取所述不定芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到丛生芽；所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充0.5～1.5g/L6-BA，0.01～0.1mg/LNAA；
生根培养：取所述丛生芽的单芽接种于生根培养基进行生根培养，得到组培生根苗；所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.05～0.1mg/LNAA；
炼苗移栽：将所述组培生根苗将所述壮苗进行炼苗，移栽。
2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述预处理过程具体为：取黄水枝幼嫩叶柄为外植体，清洗，流水冲洗20～40min，酒精消毒20～40s，升汞消毒3～7min，剪切，得到消毒灭菌后的外植体。
3.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述诱导培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，0.1％PVP。
4.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述增殖培养基包括：MS基本培养基，补充1.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA。
5.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，补充0.1mg/LNAA。
6.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.7～6.5。
7.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述诱导培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基均还包括蔗糖和琼脂，所述诱导培养基中蔗糖含量、所述增殖培养中蔗糖含量和所述生根培养基中蔗糖含量均为3wt％，所述诱导培养基中琼脂、所述增殖培养中琼脂含量和所述生根培养基中琼脂含量均为0.7wt％。
8.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述初代培养、所述增殖培养和所述生根培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。
9.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。
10.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程具体为：将所述组培生根苗至于荫棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养。
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