CN115868409B - 一种西藏扁芒菊的组培培养基及其组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了西藏扁芒菊的组培培养基及其组培方法，包括如下步骤：选择西藏扁芒菊的茎段和腋芽为外植体，表面消毒灭菌后接种于初代培养基中诱导出丛生芽，后转接至继代增殖培养基中诱导丛生芽大量繁殖，最后将丛生芽接种于生根培养基中形成生根苗。本发明首次筛选出了适合西藏扁芒菊生长的组培培养基和组培方法，且与现有技术相比，显著提高了其组培快繁效率，缩短了育种周期，在短期内就能获得大量无菌苗。
Description
技术领域
本发明属于组织培养技术领域，特别涉及一种西藏扁芒菊的组培培养基及其组培方法。
背景技术
西藏扁芒菊（Waldheimia glabra）的藏语名为“刚布”，是菊科扁芒菊属的多年生草本植物，根状茎匍匐，多分枝，具有很强的抗逆性，主要生长于我国西藏海拔4900-5500米的高山碎石山坡中，在印度北部、巴基斯坦、阿富汗及苏联中亚等地区也有分布。其花与叶的浸泡液有良好的驱虫效果，全草晒干也可用于缓解瘙痒、头痛、关节痛、发热等症状，藏族群众常用全草治疗感冒或敷于患处作为抗菌剂加速伤口的愈合。同时有研究表明西藏扁芒菊中含有醇类、酮类、酯类、萜类、醛类等70余种挥发性物质，具有较好的抗炎、抗氧化、抗病毒活性以及免疫增强活性等作用。
但是西藏扁芒菊在我国主要分布于西藏高海拔地区，较难采集，且引种后由于与原产地条件相差较大，移栽后不易成活。而目前尚无针对西藏扁芒菊组织培养技术的相关报道。
因此系统地研究适合西藏扁芒菊快速繁殖的培养基，建立高效稳定的组培扩繁体系，对于西藏扁芒菊野生种质资源的保存以及进一步的开发利用等具有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提供一种西藏扁芒菊的组培培养基。
本发明再一目的在于提供利用上述培养基的组培方法，以期在短时间内获得大量的西藏扁芒菊植株。
本发明提供了一种西藏扁芒菊的组培培养基，包括了初代培养基、继代增殖培养基以及生根培养基；
初代培养基：以MS为基本培养基，在其中加入浓度为0.3~ 2.0 mg/L 6-BA、0.05~0.2 mg/L NAA、30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂；
继代增殖培养基：以MS为基本培养基，在其中加入浓度为0.25~1.0 mg/L 6-BA、0.1~0.2 mg/L NAA、30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂；
生根培养基：以1/2 MS为基本培养基，在其中加入 0.1~0.3 mg/LNAA、30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂。
作为优选，本发明提供的初代培养基、继代增殖培养基以及生根培养基的pH为5.80~5.86，pH值通过添加盐酸或氢氧化钠进行调节；
作为优选，本发明所述初代丛生芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；
作为优选，本发明所述丛生芽继代增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；
作为优选，本发明所述生根培养基为1/2 MS+ 0.3 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；
本发明还提供了一种西藏扁芒菊的组培方法，主要包括以下步骤：
（1）选择生长健壮，无病害的西藏扁芒菊茎段或腋芽为外植体，去除部分叶片，剪切至3~4cm；
（2）将上述获得的外植体置于流水下冲洗干净，之后对其进行灭菌消毒处理；
（3）将消毒灭菌后的外植体放入无菌纸上吸干表面水分并剪去两端伤口，接种于初代培养基中培养，以得到西藏扁芒菊无菌苗；
（4）将初代培养中获得的西藏扁芒菊无菌苗茎段剪切成1.5~2 cm左右，转接到继代增殖培养基中培养，获得大量西藏扁芒菊植株；
（5）将继代培养中大小一致，生长健壮的西藏扁芒菊丛生芽植株接种至生根培养基中生根培养，最终获得生根苗。
作为优选，本发明所提供的组培方法进一步设置为，上述步骤（2）中外植体消毒灭菌的具体方法为：将西藏扁芒菊的茎段和腋芽清洗干净后放入盛有洗洁精溶液的玻璃瓶中浸泡1 min，瓶口用纱布包住，置于流水下冲洗30~40 min；然后，将洗干净后的外植体移至超净工作台中，用75%的酒精浸泡30 S，无菌水冲洗3~4次，再用4%的次氯酸钠溶液震荡消毒10分钟，无菌水冲洗3次。
作为优选，本发明所提供的组培方法进一步设置为，上述步骤（3）中初代培养方法为：在超净工作台内对外植体消毒灭菌后，放入无菌盘中用无菌纸吸干表面水分，剪去两端伤口后接种于MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂初代培养基中进行丛生芽诱导。
作为优选，本发明所提供的组培方法进一步设置为，上述步骤（4）中继代增殖培养具体方法为：将初代培养中获得的西藏扁芒菊无菌苗茎段剪切成1.5~2 cm左右，转接到MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L继代培养基中进行增殖培养。
作为优选，本发明所提供组培方法进一步设置为，上述步骤（5）中生根培养具体方法为：选择大小一致，生长健壮的西藏扁芒菊丛生芽植株，接种到1/2 MS+ 0.3 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L的培养基中生根培养。
作为优选，本发明所提供组培方法进一步设置为，上述步骤（3）~（5）中提供的初代培养、继代增殖培养以及生根培养的培养温度为25±1℃，光照时间14 h/d，光强为1500~2000lx，湿度为60%的组培室中培养，培养周期为30 天。
本发明的有益效果在于：本发明旨在提高西藏扁芒菊组培快繁的诱导率和缩短诱导生根周期，提高成苗生长速度以及根系活力，实现短期内快速繁殖，为后续种质资源保存以及野生种质资源的开发利用奠定基础。
（1）本发明通过调控西藏扁芒菊外植体诱导的培养条件和培养基配方，直接诱导外植体的芽分化，无需进行独立的外植体脱分化过程，提高了不定芽诱导率，实现同步的芽诱导分化和增殖培养，极大的缩短了培育周期。
（2）选取一定分化程度的西藏扁芒菊丛生芽进行继代增殖培养，在培养过程中，逐步调整培养基中的生长素浓度和配比，进一步促进了丛生芽植株的快速生长，提高不定芽的增殖系数。
（3）采用高浓度的生长素进行生根培养，有效促进了西藏扁芒菊的生根，提高了根系活力，有利于后续种苗移栽的成活。
附图说明
图1实施例中初代培养的状态图；
图2是实施例中丛生芽增殖生长的状态图；
图3是实施例中植株根系生长状态图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步说明。
本发明所涉及的术语：
6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；MS基本培养基为4.43g/L；1/2MS培养基是在MS培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/2；本发明实施例所用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例所涉及的指标测定及数据分析：
采用EXCEL2019和IBM SPSS Statistics 25软件进行数据统计和分析。具体公式：增殖系数=统计时的总芽数/接种腋芽总数；生根率=生根苗数/接种苗总数×100%；平均根数=总根数/生根苗数。
本实施例提供了一种西藏扁芒菊的组培培养基，包括初代培养基、继代增殖培养基和生根培养基，其中，
初代培养基：以MS为基本培养基，在其中加入浓度为1.0 mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂；
继代增殖培养基：以MS为基本培养基，在其中加入浓度为0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂；
生根培养基：以1/2 MS为基本培养基，在其中加入0.3 mg/LNAA、30 g/L蔗糖和7g/L琼脂。
本实施例中一种西藏扁芒菊的组培方法，包括如下步骤：
1、外植体选择：将采集回来的生长健壮且无病虫害的西藏扁芒菊茎段和腋芽作为外植体，去掉部分叶片，剪切至2~3cm，然后放入盛有洗洁精溶液的玻璃瓶中浸泡1min，瓶口用纱布包住，置于自来水下冲洗40min；
2、外植体的消毒：将洗干净后的外植体移至超净工作台中，用75%的酒精浸泡30S，无菌水浸洗3次，然后再用4%的次氯酸钠溶液震荡消毒10分钟，无菌水冲洗3次，最后将清洗好的外植体放到无菌接种盘中用无菌纸把水分吸干，接种到初代培养基中；
3、初代丛生芽诱导：前期对西藏扁芒菊初代培养时发现，其在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的培养基中生长状态较好，具有较高启动率和出芽指数，因此本试验直接将其作为初代培养基。具体操作为：将消毒灭菌后的外植体，移至无菌滤纸上吸干表面水分，剪去两端伤口，接种于初代培养基中进行丛生芽诱导，最后将其放置于光强为1500~2000 lx，光周期为12h/d，温度为（25±1）℃，湿度60%的组培室中培养，培养周期为30天，结果见图；
4、继代增殖培养：以初代培养中生长良好的西藏扁芒菊丛生芽作为外植体，将其茎段剪切成1.5-2 cm左右，转接到以MS为基础培养基，植物生长调节剂为6-BA（0.25、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0.1、0.2 mg/L）的6种增殖培养基中；其中，每种培养基对应处理接种30个外植体，重复3次，最后将其放置在光强为1500~2000 lx，光周期为14 h/d，温度为（25±1）℃，湿度60%的组培室中培养，30天后计算茎段的增殖系数，观察记录不同培养基对增殖芽生长发育的影响。从表1中可以看出，西藏扁芒菊在A3（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂）培养基中增殖效果最好，产生丛生芽较多且生长状态好，增殖系数为6.25，增殖情况如图2所示；
5、生根培养：选择大小一致，生长健壮的西藏扁芒菊丛生芽，接种到以1/2 MS为基本培养基，NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）的3种增殖培养基中，每个处理接种30个外植体，重复3次，一个月后统计生根率和平均根数，从表2可以看出西藏扁芒菊在3种培养基中生根率分别是100%，96.7%以及100%，其中，在B3（1/2 MS+ 0.3 mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂）培养基中诱导根系最多且呈辐射状生长，由此可以得出，西藏扁芒菊的最适生根培养基为1/2MS+ 0.3 mg/L NAA。
西藏扁芒菊试验数据如下表所示：
注：同一列中不同字母表示显著性水平在0.05水平的差异，下表同。
表2西藏扁芒菊生根培养试验结果：
。
Claims (4)
1.一种西藏扁芒菊的组培培养基，其特征在于，由初代培养基、继代增殖培养基以及生根培养基组成，其中，
所述初代培养基、继代增殖培养基以及生根培养基的pH为5.80~5.86；
所述初代培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；
继代增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；以及，
生根培养基作为1/2 MS+ 0.3 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；
6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；MS基本培养基为4.43g/L；1/2MS培养基是在MS培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/2。
2.一种利用权利要求1所述组培培养基的西藏扁芒菊的组培方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选择生长健壮，无病害的西藏扁芒菊茎段或腋芽为外植体，去除部分叶片，剪切至3~4 cm；
（2）将步骤（1）获得的外植体置于流水下冲洗干净后，对其进行灭菌消毒处理；
（3）将灭菌消毒后的外植体放入无菌纸上吸干表面水分并剪去两端伤口，接种于初代培养基中培养，以得到西藏扁芒菊无菌苗；
（4）将初代培养中获得的西藏扁芒菊无菌苗茎段剪切成1.5~2 cm，转接到继代增殖培养基中培养，获得大量的西藏扁芒菊丛生芽植株；
（5）取继代培养中大小一致、生长健壮的西藏扁芒菊丛生芽植株接种至生根培养基中生根培养，最终获得生根苗；
步骤（3）中，初代培养方法为：在超净工作台内对外植体消毒灭菌后，放入无菌盘中用无菌纸吸干表面水分，剪去两端伤口后接种于MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂初代培养基中进行丛生芽诱导；
步骤（4）中，所述继代增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂；
步骤（5）中，所述生根培养基为1/2 MS+ 0.3 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂；
6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；MS基本培养基为4.43g/L；1/2MS培养基是在MS培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/2。
3.根据权利要求2所述的一种西藏扁芒菊的组培方法，其特征在于，步骤（2）中外植体的灭菌消毒处理方法为：将西藏扁芒菊的茎段和腋芽放入盛有洗洁精溶液的玻璃瓶中浸泡1 min，瓶口用纱布包住，置于流水下冲洗30~40 min；然后，将洗干净后的外植体移至超净工作台中，用75%的酒精浸泡30 S，无菌水冲洗3~4次，再用4%的次氯酸钠溶液震荡消毒10分钟，无菌水冲洗3次。
4.根据权利要求2或3项所述的一种西藏扁芒菊的组培方法，其特征在于，步骤（3）~（5）初代培养、继代增殖培养以及生根培养中的培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间14h/d，光强为1500~2000 lx，培养时间为30d。
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