CN108037205A - 一种高效液相色谱测定cbz-伐昔洛韦含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱测定CBZ‑伐昔洛韦含量的方法，包括以下步骤：1）准确称取待测样品，用甲醇溶解，然后用流动相稀释后定容，得到供试品溶液；2）准确称取对照品，用甲醇溶解，然后用流动相稀释后定容；得到对照品溶液；3）采用高效液相色谱分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中流动相为磷酸二氢钾溶液和甲醇混合，进行梯度洗脱，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ‑伐昔洛韦含量。本发明提供的方法具有分离效果好，测定准确，灵敏度高，分析方法简便等特点。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，涉及药物分析，具体为高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法。
背景技术
盐酸伐昔洛韦是阿昔洛韦的前体药物，口服后吸收迅速并在体内很快转化为阿昔洛韦，其抗病毒作用为阿昔洛韦所发挥，药物被磷酸化成活化型无环鸟苷三磷酸酯，与脱氧核苷竞争病毒胸腺嘧啶激酶或细胞激酶，与脱氧鸟嘌呤三磷酸酯竞争病毒DNA多聚酶，从而抑制了病毒DNA合成，显示抗病毒作用。
N-苄氧羰基-L-缬氨酸2-[(2-氨基-1,6-二氢-6-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]乙基酯(简称为CBZ-伐昔洛韦)，其是盐酸伐昔洛韦的关键中间体，经过氢化反应得到伐昔洛韦，再成盐即可得到盐酸伐昔洛韦。CBZ-伐昔洛韦的纯度对最终产品纯度影响很大，经查阅文献及资料，没有高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法的介绍。
现有检测中，可以通过高氯酸非水滴定法进行测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法，能够快速。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法，包括以下步骤：
1)准确称取待测样品，用甲醇溶解，然后用流动相稀释后定容，得到供试品溶液；
2)准确称取对照品，用甲醇溶解，然后用流动相稀释后定容；得到对照品溶液；
3)采用高效液相色谱分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中流动相为磷酸二氢钾溶液和甲醇混合，进行梯度洗脱，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ-伐昔洛韦含量。
进一步地，步骤2)中所述的对照品是采用CBZ-伐昔洛韦样品经过多次提纯精制后得到的，其纯度为99.9％。
进一步地，其中流动相为流动相A和流动相B，两者均采用甲醇、乙醇、正己烷及乙腈中的一种有机溶剂与磷酸二氢钾溶液混合而成；流动相A中磷酸二氢钾溶液与有机溶剂的体积比为80-90:10-20，流动相B中磷酸二氢钾溶液与有机溶剂的体积比为25-35:65-75。
进一步地，步骤3)梯度洗脱时，具体梯度如下：
进一步地，步骤1)及步骤2)中，所用的流动相为流动相A，采用甲醇与磷酸二氢钾溶液按体积比20:80混合而成。
进一步地，步骤1)及步骤2)中，所用的流动相为流动相A。
进一步地，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.01mol/L。
进一步地，步骤1)及步骤2)中，所称取的样品为25mg，先加20mL甲醇使其溶解，然后加流动相定容至50ml，测试时，取20μL注入色谱仪即可。
进一步地，所述步骤3)中测试时，
色谱柱：C18柱；
柱温：25℃-30；
检测波长：251nm。
本发明采用高效液相色谱法测定CBZ-伐昔洛韦含量，检测时间在40分钟左右，采用两种流动相进行洗脱，分离效果好，结构准确可靠，灵敏度高。可以用于指导CBZ-伐昔洛韦及盐酸伐昔洛韦生产，进行质量控制。
附图说明：
图1是实施例1中供试品溶液1的色谱图。
图2是实施例1中供试品溶液1的另一色谱图。
图3是实施例1中供试品溶液2的色谱图。
图4是实施例1中供试品溶液2的另一色谱图。
图5是实施例1中对照品溶液1的色谱图。
图6是实施例1中对照品溶液1的另一色谱图。
图7是实施例1中对照品溶液2的色谱图。
图8是实施例1中对照品溶液2的另一色谱图
图9是实施例1中空白溶液的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
本发明中所涉及的待测样品为本公司生产的CBZ-伐昔洛韦产品。
对照品为申请人通过多次纯化精制制得，采用高氯酸非水滴定法测定纯度为99.9％。
检测设备为高效液相色谱仪，型号为Agilent1200。
实施例1：
一种高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法，包括以下步骤：
1)准确称取25mg待测样品，置50ml量瓶中，加20ml甲醇溶解，然后用流动相A稀释并定容，得到供试品溶液，供试品溶液配制两组，即供试品溶液1和供试品溶液2，同时做空白试验；
2)准确称取25mg对照品，置50ml量瓶中，加20ml甲醇溶解，然后用流动相A稀释并定容，得到对照品溶液，对照品溶液配制两组，即对照品溶液1和对照品溶液2；
3)采用高效液相色谱分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱：C18柱；
柱温：25℃；
检测波长：251nm。
流动相：
流动相A0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液，体积比为80:20；
流动相B 0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合溶液，体积比为25:75；
具体梯度洗脱参数见表1：
表1
理论塔板数根据供试品进行计算，不低于5000。
按照上述条件，分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为20μl，调节色谱系统及检测灵敏度，记录色谱图，每种溶液分别进样2次，其中供试品溶液1的色谱图如图1-2所示，供试品溶液2的色谱图如图3-4所示，对照品溶液1的色谱图如图5-6所示，对照品溶液2的色谱图如图7-8所示，空白溶液的色谱图如图9所示，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ-伐昔洛韦含量。
具体计算公式是：
CBZ-伐昔洛韦含量＝(对照品质量*供试品峰面积)/(对照品峰面积*供试品质量)
该实施例中，对照品质量1为：24.8mg，对照品质量2为：24.5mg，供试品质量1为25.6mg，供试品质量2为25.1mg，对照品峰面积1为17324.7,17320.8，对照品峰面积2为17113.7,17105.0；供试品峰面积1为17486.9,17487.7，供试品峰面积2为17059.6,17069.7；
每组计算CBZ-伐昔洛韦含量，最后计算平均值和标准偏差；CBZ-伐昔洛韦含量平均值为97.5％。RSD为0.27％。
由于色谱图数量较多，后续实施例及重复性试验、回收率试验等中的色谱图未作为附图提交，只是给出了计算结果。
实施例2：
除检测条件中的
流动相A0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液与乙醇的混合溶液，体积比为90:10；
流动相B 0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液与乙醇的混合溶液，体积比为35:65；
其余均同实施例1。
按照上述条件，分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为20μl，调节色谱系统及检测灵敏度，记录色谱图，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ-伐昔洛韦含量为97.3％。
实施例3：
一种高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法，包括以下步骤：
1)准确称取25mg待测样品，置50ml量瓶中，加20ml乙腈溶解，然后用流动相A稀释并定容，得到供试品溶液，同时做空白试验；
2)准确称取25mg对照品，置50ml量瓶中，加20ml乙腈溶解，然后用流动相A稀释并定容，得到供试品溶液；
3)采用高效液相色谱分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱：C18柱；
柱温：25℃；
检测波长：251nm。
流动相：
流动相A0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合溶液，体积比为85:15；
流动相B 0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液与乙腈的混合溶液，体积比为30:70；
其余均同实施例1，分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为20μl，调节色谱系统及检测灵敏度，记录色谱图，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ-伐昔洛韦含量为97.4％。
实施例4：
除检测条件中的
柱温；30℃；
其余均同实施例1。
按照上述条件，分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，进样量为20μl，调节色谱系统及检测灵敏度，记录色谱图，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ-伐昔洛韦含量为97.3％。
重复性试验
使用同一批供试品，配制6份供试品溶液，和对照品溶液分别进样，计算含量的RSD(n＝6)。
验收标准：
RSD(n＝6)≤5.0％RSD＝0.12％符合要求
回收率试验
取本品约50mg，置50ml容量瓶中，加甲醇20ml超声溶解,用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为储备液。
取上述储备液4ml至10ml容量瓶，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为80％浓度溶液。平行制备三份。
取上述储备液5ml至10ml容量瓶，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为100％浓度溶液。平行制备三份。
取上述储备液6ml至10ml容量瓶，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为120％浓度溶液。平行制备三份。
取重复性项下对照品溶液，照本品质量标准含量测定项下操作，测定其含量，并计算回收率。
验收标准：
各浓度下平均回收率应在98.0％～102.0％之间，RSD≤10.0％。符合要求。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高效液相色谱测定CBZ-伐昔洛韦含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)准确称取待测样品，用甲醇溶解，然后用流动相稀释后定容，得到供试品溶液；
2)准确称取对照品，用甲醇溶解，然后用流动相稀释后定容；得到对照品溶液；
3)采用高效液相色谱分别对供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中流动相为磷酸二氢钾溶液和甲醇混合，进行梯度洗脱，最后按外标法以峰面积计算，得到供试品中CBZ-伐昔洛韦含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述的对照品是采用CBZ-伐昔洛韦样品经过多次提纯精制后得到的，其纯度为99.9％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中流动相为流动相A和流动相B，两者均采用甲醇、乙醇、正己烷及乙腈中的一种有机溶剂与磷酸二氢钾溶液混合而成；流动相A中磷酸二氢钾溶液与有机溶剂的体积比为80-90:10-20，流动相B中磷酸二氢钾溶液与有机溶剂的体积比为25-35:65-75。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)梯度洗脱时，具体梯度如下：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)及步骤2)中，所用的流动相为流动相A，采用甲醇与磷酸二氢钾溶液按体积比20:80混合而成。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.01mol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)及步骤2)中，所称取的样品为25mg，先加20mL有机溶剂使其溶解，然后加流动相定容至50ml，测试时，取20μL注入色谱仪即可。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中测试时，
色谱柱：C18柱；
柱温：25-30℃；
检测波长：251nm。
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