CN108027376B - 评价脑内的淀粉样蛋白β蓄积状态的多重生物标记物及其分析方法 - Google Patents

评价脑内的淀粉样蛋白β蓄积状态的多重生物标记物及其分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供：以生物体来源试样中的淀粉样前体蛋白(APP)来源的Aβ和Aβ样肽作为指标的、评价脑内的Aβ蓄积状态的生物标记物及其分析方法。一种判断脑内的Aβ蓄积状态的标记物，其包括：选自由生物体来源试样中的Aβ1‑39(序列号1)水平相对于Aβ1‑42(序列号3)水平的比：Aβ1‑39/Aβ1‑42；Aβ1‑40(序列号2)水平相对于Aβ1‑42(序列号3)水平的比：Aβ1‑40/Aβ1‑42；和APP669‑711(序列号4)水平相对于Aβ1‑42(序列号3)水平的比：APP669‑711/Aβ1‑42组成的组中的至少2个比的组合。

Description

评价脑内的淀粉样蛋白β蓄积状态的多重生物标记物及其分 析方法
技术领域
本发明属于脑神经科学领域和临床医学领域，涉及评价脑内的淀粉样蛋白·β肽(Aβ)蓄积状态的多重替代性生物标记物及其分析方法。更详细而言，本发明涉及以通过淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein；APP)被切断而产生的Aβ和Aβ样肽的生物体来源试样中水平作为指标的评价脑内Aβ蓄积状态的多重替代性生物标记物及其分析方法。本发明的生物标记物涉及阿尔茨海默病，是用于发病前诊断、发病预防干预(优先治疗药给予等)对象者的筛选和治疗药·预防药的药效评价等的标记物。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease；AD)是痴呆症的主要原因，占痴呆症整体的50-60％。推断世界的痴呆症患者数(2001年2400万人以上)在2040年达到8100万人(非专利文献1)。可以认为，阿尔茨海默病的发病与淀粉样蛋白β(Aβ)有较强相关。Aβ是由作为单次跨膜蛋白的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein；APP)通过β分泌酶和γ分泌酶接受蛋白质分解而产生的。由伴随着Aβ纤维化的聚集而在脑内出现老年斑时，以此为引发而微管相关蛋白(tau protein)在神经细胞内聚集蓄积，从而导致神经功能不全、神经细胞死亡。作为其结果，可以认为，引起了认知能力的进行性降低。一直以来熟知的是，Aβ主要由40个残基(Aβ1-40)和42个残基(Aβ1-42)构成，还已知向脑脊髓液(CSF)、血液中移动。进而，近年来报道了与Aβ1-40和Aβ1-42的长度不同的Aβ样的肽还存在于CSF、血浆中(非专利文献2、3)。
可以认为，淀粉样蛋白蓄积是因AD而在脑内产生的病态生理学变化中的最早期的事件，在近些年的研究中证明了自表现出临床症状的前10年以上就开始在脑内蓄积淀粉样蛋白。因此，为了早期诊断AD，准确地检测脑内的淀粉样蛋白蓄积变得尤为重要。目前，作为检测淀粉样蛋白蓄积的方法，有淀粉样蛋白PET和CSF Aβ检查。淀粉样蛋白PET是使用与Aβ特异性结合的配体分子来对Aβ沉积进行可视化的方法，例如有使用了匹兹堡化合物B(Pittsburgh compound-B：PiB)的PiB-PET。然而，PET检查需要大量的设备，因此一次检查费用昂贵，另外，还有暴露于辐射线这样的侵袭性，因此不适合作为AD的筛选方法。另一方面，报道了CSF中Aβ1-42浓度的降低、Aβ1-42/Aβ1-40浓度比的降低、总Tau值或磷酸化Tau值的上升是有用的标记物(专利文献1：日本特开2010-19864号公报、非专利文献4)。然而，采集CSF的侵袭性也高，不适合作为AD的筛选方法。因此，筛选中优选侵袭性低且成本也便宜的血液检查。
因此，期待血中存在的Aβ1-42浓度可成为阿尔茨海默病诊断标记物，尽管多位研究者报道了血中Aβ1-42浓度与阿尔茨海默病发病之间的相关性，但并未得到一致的结果(非专利文献4)。
然而，近些年，作为反映脑内淀粉样蛋白蓄积状态的有希望的血液标记物报道了APP669-711/Aβ1-42的比(非专利文献5)。非专利文献5显示出APP669-711/Aβ1-42的比与由PiB-PET得到的PiB累积度具有较强的相关性。进而，利用PiB阳性和PiB阴性的组进行ROC分析，结果显示出APP669-711/Aβ1-42的比是能够精度良好地判定PiB阳性者和PiB阴性者的标记物。
另外，专利文献2：日本特开2013-63976号公报中公开了，不识别可溶性Aβ单体而仅与可溶性Aβ低聚物特异性结合的单克隆抗体，公开了使用前述抗体的阿尔茨海默病的诊断法。同一公报的[0104]中公开了如下方法：受试者试样中的Aβ低聚物相对于Aβ单体的比高于健康人的情况下，判定受试者为阿尔茨海默病候选者。
专利文献3：日本特表2014-520529号公报中公开了，组合由对象得到的样品中的多个miRNA的水平来诊断阿尔茨海默病的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-19864号公报
专利文献2：日本特开2013-63976号公报
专利文献3：日本特表2014-520529号公报
非专利文献
非专利文献1：Blennow K,de Leon MJ,Zetterberg H.：Alzheimer'sdisease.Lancet.2006Jul 29；368(9533):387-403
非专利文献2：Portelius E,Westman-Brinkmalm A,Zetterberg H,Blennow K.：Determination of beta-amyloid peptide signatures in cerebrospinal fluid usingimmunoprecipitation-mass spectrometry.J Proteome Res.2006Apr；5(4):1010-6
非专利文献3：Kaneko N,Yamamoto R,Sato TA,Tanaka K.：Identification andquantification of amyloid beta-related peptides in human plasma using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.ProcJpn Acad Ser B Phys Biol Sci.2014；90(3):104-17.
非专利文献4：Hampel H,Shen Y,Walsh DM,Aisen P,Shaw LM,Zetterberg H,Trojanowski JQ,Blennow K.：Biologicalmarkers of amyloid beta-relatedmechanisms in Alzheimer's disease.Exp Neurol.2010Jun；223(2):334-46
非专利文献5：Kaneko N,Nakamura A,Washimi Y,Kato T,Sakurai T,Arahata Y,Bundo M,Takeda A,Niida S,Ito K,Toba K,Tanaka K,Yanagisawa K.：Novel plasmabiomarker surrogating cerebral amyloid deposition.Proc Jpn Acad Ser B PhysBiol Sci.2014；90(9):353-64.
发明内容
发明要解决的问题
已知的是，在阿尔茨海默病(AD)患者中，在认知功能降低明显化之前有大量的Aβ沉积。淀粉样蛋白-PET对于Aβ蓄积的检测是有效的，但检查费用昂贵且检查所需时间也长，因此，不是大多数老年人能够容易就诊的诊断方法。因此，需要在临床症状明显化前能够检测Aβ蓄积增加的简便的分析方法。
如上述那样，通常以血液、脑脊髓液(CSF)中存在的生物标记物作为指标的检查方法是能够以分子水平简便地检测疾病的发病、进展的有效的方法。上述专利文献1和非专利文献4中报道了，对于阿尔茨海默病，CSF中的Aβ1-42浓度的降低是有用的诊断标记物。然而，另一方面，非专利文献4中报道了，与CSF Aβ1-42不同，血中Aβ1-42浓度与AD发病的相关性低。
一直以来，关于血液中的Aβ的迄今为止的报道中，仅对于血液中的Aβ1-40和Aβ1-42这2种的浓度与AD的相关性进行了考察。上述非专利文献5中，作为反映脑内淀粉样蛋白蓄积状态的有希望的血液标记物报道了APP669-711/Aβ1-42的比。根据APP669-711/Aβ1-42的比，能够高灵敏度判定脑内淀粉样蛋白蓄积，但期望进一步进行精度良好地判断的方法。
本发明的目的在于提供：以生物体来源试样中的淀粉样前体蛋白(APP)来源的Aβ和Aβ样肽作为指标的评价脑内的Aβ蓄积状态的生物标记物和其分析方法。特别是，本发明的目的在于提供：以血液试样中的淀粉样前体蛋白(APP)来源的Aβ和Aβ样肽作为指标的评价脑内的Aβ蓄积状态的生物标记物和其分析方法。更详细而言，本发明的目的在于提供：关于阿尔茨海默病，用于发病前诊断、发病预防干预(优先治疗药给予等)对象者的筛选和治疗药·预防药的药效评价等的标记物和其分析方法。
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果通过算出利用数学方法组合选自由关于生物体试样中的APP来源的Aβ和Aβ样肽的3个比、Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42组成的组中的2个以上比而得到的数值，从而完成了本发明。
本说明书中，作为淀粉样蛋白·β肽的简称，使用“Aβ”。即，“Aβ”包含Aβ1-40和Aβ1-42。有时将通过淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein；APP)被切断而产生的前述Aβ以外的肽称为Aβ样肽。有时将通过淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein；APP)被切断而产生的Aβ和Aβ样肽称为“APP衍生型肽”。
本发明包括以下的方案。
(1)一种判断脑内的Aβ蓄积状态的标记物(marker)，其包括：
选自由生物体来源试样中的Aβ1-39(序列号1)水平相对于Aβ1-42(序列号3)水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40(序列号2)水平相对于Aβ1-42(序列号3)水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711(序列号4)水平相对于Aβ1-42(序列号3)水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比的组合。
更具体而言，一种判断脑内的Aβ蓄积状态的标记物，其包括：
选自由生物体来源试样中的Aβ1-39(序列号1)水平相对于Aβ1-42(序列号3)水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40(序列号2)水平相对于Aβ1-42(序列号3)水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711(序列号4)水平相对于Aβ1-42(序列号3)水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比通过数学方法的复合变量(composite variable)。
根据上述(1)所述的标记物，其中，前述生物体来源试样选自由血液、脑脊髓液、尿、粪便和体分泌液(例如，唾液、泪、汗、鼻黏膜渗出液和痰)组成的组。
(2)一种判断脑内的Aβ蓄积状态的分析方法，其包括如下工序：
测定工序，将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
Aβ1-42(序列号3)和
选自由Aβ1-39(序列号1)、Aβ1-40(序列号2)和APP669-711(序列号4)组成的组中的至少2个
的标记物(marker)的检测，得到前述生物体来源试样中的、
Aβ1-42和
选自由Aβ1-39、Aβ1-40和APP669-711组成的组中的前述至少2个
的各测定水平；
算出工序，求出选自由
Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比；
导出工序，利用数学方法由前述算出的各比导出组合的复合变量，以及
评价工序，以脑内的Aβ蓄积阴性者的前述复合变量作为基准水平，受试对象的前述复合变量高于前述复合变量的基准水平的情况下，判定为受试对象的脑内Aβ的蓄积量大于前述Aβ蓄积阴性者的脑内Aβ的蓄积量。
(3)一种分析方法，其分别在对受试对象进行的医学干预的前后，进行包括如下工序的检查：
测定工序，
将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
Aβ1-42(序列号3)和
选自由Aβ1-39(序列号1)、Aβ1-40(序列号2)和APP669-711(序列号4)组成的组中的至少2个
的标记物的检测，得到所述生物体来源试样中的、
Aβ1-42和
选自由Aβ1-39、Aβ1-40和APP669-711组成的组中的所述至少2个
的各测定水平；
算出工序，求出选自由
Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比；以及
导出工序，利用数学方法由前述算出的各比导出组合的复合变量，
将医学干预前的受试对象的前述复合变量与医学干预后的受试对象的前述复合变量进行比较，针对脑内的Aβ蓄积状态判断前述医学干预的有效性。
即，与医学干预前的受试对象的前述复合变量相比，医学干预后的受试对象的前述复合变量变小时，可以针对脑内的Aβ蓄积状态判断前述医学干预是有效的。
(4)一种分析方法，其对受试对象通过1次或经时多次地进行包括如下工序的检查：
测定工序，将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
Aβ1-42(序列号3)和
选自由Aβ1-39(序列号1)、Aβ1-40(序列号2)和APP669-711(序列号4)组成的组中的至少2个
的标记物的检测，得到所述生物体来源试样中的、
Aβ1-42和
选自由Aβ1-39、Aβ1-40和APP669-711组成的组中的所述至少2个
的各测定水平；
算出工序，求出选自由Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比；以及
导出工序，利用数学方法由前述算出的各比导出组合的复合变量，
基于1次或经时多次的受试对象的前述复合变量的值，针对受试对象的脑内的Aβ蓄积状态进行未来症状的进展预测、痴呆发病风险的预测。
即，即使在仅进行1次包括上述各工序的检查的情况下，基于复合变量的值，也可以进行阿尔茨海默病的未来症状的预测、痴呆发病风险的预测。进而，经时多次地进行了包括上述各工序的检查的情况下，基于复合变量的值的变动，也可以进一步精度良好地进行阿尔茨海默病的未来症状的进展预测、痴呆发病风险的预测。
(5)根据上述(2)～(4)中任一项所述的分析方法，其中，前述数学方法是使用判别分析(线性判别分析、二次判别分析、标准化判别分析)、多元回归分析、主要成分回归分析(PCA)、PLS(偏最小二乘)、逻辑回归的方法。
(6)根据上述(2)～(4)中任一项所述的分析方法，其中，前述数学方法是对前述各比进行标准化后，导出经标准化的前述至少2个比的平均值或总计值的方法。
(7)根据上述(2)～(6)中任一项所述的分析方法，其中，前述生物体来源试样选自由血液、脑脊髓液、尿、粪便和体分泌液(例如，唾液、泪、汗、鼻黏膜渗出液和痰)组成的组。
本发明中，标记物的水平基本上是指浓度，也可以是本领域技术人员依据浓度而使用的其它单位。受试对象包括人和除人以外的哺乳动物(大鼠、狗、猫等)。另外，本发明中，生物体来源试样不返回至原来的受试对象(例如受试者)而被废弃。医学干预包括治疗药、预防药的给予、饮食疗法、运动疗法、学习疗法、外科手术等。
发明的效果
根据本发明，可提供判断脑内的Aβ蓄积状态的标记物，其包括选自由生物体来源试样中的Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比的组合。另外，可提供前述标记物的分析方法。
通过组合选自由受试对象的生物体来源试样中的3个比：Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42组成的组中的至少2个比，从而与各自单独使用前述3个比相比，能够精度更良好地推断脑内的Aβ蓄积状态。对于通过数学方法的复合变量，可以以从统计学的角度推断的权重组合或以各自对等的权重组合选自由Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42组成的组中的至少2个比，能够基于前述各比精度更良好地推断脑内的Aβ蓄积状态。
本发明不仅可以用于脑内的Aβ过剩蓄积且还出现认知功能障碍的阿尔茨海默病加剧阶段的检测，还可以用于其前阶段的轻度认知障碍(MCI)、进而脑内的Aβ过剩蓄积但未出现认知功能障碍的阿尔茨海默病的前临床期阶段的检测。
根据本发明，作为前述生物体来源试样，不仅可以使用血液，还可以使用脑脊髓液(CSF)、尿、粪便、体分泌液(例如，唾液、泪、汗、鼻黏膜渗出液和痰)。因此，在确立了阿尔茨海默病的预防法以及优先治疗法的阶段，通常的健康诊断、综合性健康检查等中，通过对认知功能正常者也分析脑内Aβ的蓄积状态，对阿尔茨海默病发病前诊断是有效的。
如果在对受试对象所进行的医学干预的前后应用本发明，则可以进行阿尔茨海默病的治疗药、预防药的药效评价或其它处置的有效性评价。另外，本发明对于阿尔茨海默病患者的经过观察也是有用的。
如果对受试对象通过1次或经时多次地地应用本发明，则可以进行阿尔茨海默病的未来症状的进展预测、痴呆发病风险的预测。
附图说明
图1是示出实验例1中对于Aβ1-39/Aβ1-42进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图2是示出实验例1中对于Aβ1-40/Aβ1-42进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图3是示出实验例1中对于APP669-711/Aβ1-42进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图4是实验例1中有关Aβ1-39/Aβ1-42的ROC曲线。
图5是实验例1中有关Aβ1-40/Aβ1-42的ROC曲线。
图6是实验例1中有关APP669-711/Aβ1-42的ROC曲线。
图7是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与Aβ1-39/Aβ1-42比率的散点图。
图8是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与Aβ1-40/Aβ1-42比率的散点图。
图9是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与APP669-711/Aβ1-42比率的散点图。
图10是示出实验例1中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图11是示出实验例1中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图12是示出实验例1中对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图13是示出实验例1中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图14是实验例1中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图15是实验例1中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图16是实验例1中有关通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图17是实验例1中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合的ROC曲线。
图18是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的组合的判别评分的散点图。
图19是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的判别评分的散点图。
图20是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与、通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的判别评分的散点图。
图21是实验例1中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的判别评分的散点图。
图22是示出实验例2中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图23是示出实验例2中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图24是示出实验例2中对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图25是示出实验例2中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图26是实验例2中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图27是实验例2中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图28是实验例2中有关通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图29是实验例2中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合的ROC曲线。
图30是实验例2中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
图31是实验例2中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
图32是实验例2中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
图33是实验例2中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
图34是示出实验例3中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图35是示出实验例3中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图36是示出实验例3中对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-和PiB+的组间比较的箱线图。
图37是示出实验例3中对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
图38是实验例3中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图39是实验例3中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图40是实验例3中有关通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。
图41是实验例3中有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合的ROC曲线。
图42是实验例3中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
图43是实验例3中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
图44是实验例3中PiB累积平均值(mcSUVR)与、通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的z-score的散点图。
图45是实验例3中PiB累积平均值(mcSUVR)与、Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
具体实施方式
[1.受试对象]
本发明中，受试对象包括人和除人以外的哺乳动物(大鼠、狗、猫等)。以下，对人的情况进行主要说明，但除人以外的哺乳动物的情况也是同样的。
本发明的方法中，无论迄今为止的病历如何，包括被认为是健康人的人，任何人均可作为受试者。被认为是健康人的人的情况下，通常的健康诊断、综合性健康检查等中，优选通过血液检查判断脑内Aβ的蓄积状态，对阿尔茨海默病的早期发现/诊断是特别有效的。另外，通过用于考察临床症状的ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT或画钟试验那样的认知功能检查、核磁共振图像诊断(MRI)、正电子发射断层成像法(PET)等的图像所见的确认等，怀疑有阿尔茨海默病候选的受试者的情况下，通过本发明的方法，从有无脑内淀粉样蛋白病变这样本质性的观点出发，可以作为准确地诊断阿尔茨海默病的判断材料使用。
[2.生物体来源试样]
本发明的标记物可以在受试者的生物体来源试样中进行检测和分析。因此，本发明的方法中，分析受试者的生物体来源试样中的标记物的水平。
生物体来源试样可以选自血液、脑脊髓液(CSF)、尿、粪便、体分泌液(例如，唾液、泪、汗、鼻黏膜渗出液和痰)等。其中，通常的健康诊断、综合性健康检查等中的阿尔茨海默病的诊断和发病前诊断时，优选血液。
血液试样是可以直接供于标记物的表达水平的测定工序的试样，包括全血、血浆和血清等。血液试样可以通过对从受试对象采集的全血进行适当处理来制备。作为从所采集的全血进行血液试样的制备时所进行的处理，没有特别限定，例如可以进行离心分离等临床医学上允许的任意处理。另外，供于测定工序的血液试样在该制备工序的中途阶段或制备工序的后阶段，适当进行冷冻等低温下的保存。需要说明的是，本发明中血液试样等生物体来源试样不返回至原来的受试者而被废弃。
[3.标记物]
本发明的标记物包括：选自由生物体来源试样中的Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比通过数学方法的复合变量。包括它们中的至少2个比通过数学方法的复合变量标记物在来自于脑内的Aβ蓄积为阴性的认知功能正常者的血浆试样中的复合变量水平与来自于脑内的Aβ过剩蓄积的受试者的血浆试样中的复合变量水平之间确认到显著的差异。
APP672-710(Aβ1-39)(序列号1)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
APP672-711(Aβ1-40)(序列号2)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
APP672-713(Aβ1-42)(序列号3)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
APP669-711(序列号4)：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
淀粉样前体蛋白(APP)是单次跨膜蛋白且由770个残基的氨基酸构成的。淀粉样前体蛋白(APP)通过β分泌酶和γ分泌酶接受蛋白质分解，通过蛋白质分解而产生淀粉样蛋白·β肽(Aβ)。APP672-713和Aβ1-42表示相同的肽(序列号3)。另外，APP672-711和Aβ1-40表示相同的肽(序列号2)。
[4.标记物的分析]
本发明的标记物的分析方法包括如下工序：
测定工序，将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
Aβ1-42(序列号3)和
选自由Aβ1-39(序列号1)、Aβ1-40(序列号2)和APP669-711(序列号4)组成的组中的至少2个
的标记物的检测，得到前述生物体来源试样中的、
Aβ1-42和
选自由Aβ1-39、Aβ1-40和APP669-711组成的组中的前述至少2个
的各测定水平；
算出工序，求出选自由Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42；
Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；和
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少2个比；
导出工序，利用数学方法由前述算出的各比导出组合的复合变量；以及
评价工序，以脑内的Aβ蓄积阴性者的前述复合变量作为基准水平，受试对象的前述复合变量高于前述复合变量的基准水平的情况下，判断出受试对象的脑内Aβ的蓄积量大于前述Aβ蓄积阴性者的脑内Aβ的蓄积量。由此，能够判断脑内的Aβ蓄积状态或作为判断材料使用。
标记物的水平基本上是指浓度，也可以是本领域技术人员依据浓度而使用的其它单位、例如质谱中的检测离子强度。本发明的生物体来源试样中的标记物的分析通过由测定值导出的前述复合变量(测定复合变量)与由基准值导出的前述复合变量(基准复合变量)的比较来进行。为了更准确的分析，比较的测定值与基准值优选为基于在相同条件(前处理条件、保存条件等)下准备的生物体来源试样的值。作为前述标记物的基准复合变量，可以使用对于利用PiB-PET图像判断脑内的Aβ蓄积为阴性者的测定值导出的复合变量。或者，作为前述标记物的基准复合变量，还可以使用对于利用PiB-PET图像判断脑内的Aβ蓄积为阴性的正常者的确立了的基准复合变量。
标记物的测定优选通过基于生物体分子特异性亲和性的检查来进行。基于生物体分子特异性亲和性的检查为对于本领域技术人员来说熟知的方法，没有特别限定，优选免疫分析。具体而言，包括：免疫印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))(包括夹心免疫法、竞争法和直接吸附法)、免疫沉降法、沉降反应、免疫扩散法、免疫聚集测定、补体结合反应分析、免疫放射定量法、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析等包含竞争和非竞争分析体系的免疫分析。免疫分析中，检测生物体来源试样中的与上述标记物结合的抗体。
本发明中，也可以利用抗体固定化载体来进行标记物的测定，所述抗体固定化载体是使用具有能够识别淀粉样前体蛋白(APP)来源的肽的抗原结合部位的免疫球蛋白、或者包含能够识别淀粉样前体蛋白(APP)来源的肽的抗原结合部位的免疫球蛋白片段制作的。通过使用了前述抗体固定化载体的免疫沉降法，从而能够利用质谱装置进行试样中肽的检测(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry；IP-MS)。
另外，本发明中还可以进行连续免疫沉淀(Consecutive Immunoprecipitation；CIP)，然后进行通过质谱分析装置的试样中肽的检测(cIP-MS)。通过连续进行2次亲和纯化，从而能够通过第2次的亲和纯化使仅通过1次亲和纯化无法完全排除的夹杂物质进一步减少。因此，能够抑制由夹杂物质导致的多肽的离子化，生物体试样中微量的多肽的情况下，也能够通过质谱分析高灵敏度地进行计测。
通过组合受试对象的生物体来源试样中的3个比：选自由Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42组成的组中的至少2个比，从而与各自单独使用前述3个比相比，能够精度更良好地推断脑内的Aβ蓄积状态。对于通过数学方法的复合变量，可以以从统计学的角度推断的权重组合或以各自对等的权重组合选自由Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42组成的组中的至少2个比，从而能够基于前述各比精度更良好地推断脑内的Aβ蓄积状态。
作为以从统计学的观点出发推断的权重组合的数学方法，例如，使用选自前述3个比的至少2个比，利用判别分析、多元回归分析、主要成分回归分析、偏最小二乘或逻辑回归而算出复合变量。可以将其作为组合的复合变量。
作为以对等的权重组合的数学方法，例如，对于选自前述3个比的至少2个比，对前述各比进行标准化后，导出经标准化的前述至少2个比的平均值或总计值，将导出的平均值或总计值作为前述至少2个比的复合变量。更具体而言，对于选自前述3个比的至少2个比，进行基于受试对象的全病例的标准化或进行基于空白组(PiB-组：通过PiB-PET图像判断脑内的Aβ蓄积为阴性的组)的标准化，然后算出经标准化的前述至少2个比(z-score)的平均值，将其作为组合的复合变量。
使用这样的数学方法时，与其它一个或二个比相比，选自前述3个比中的至少2个比中的一个比过大或过小时，可以以对等的权重组合各个比，通过使用组合的复合变量，从而能够基于前述各比精度更良好地推断脑内的Aβ蓄积状态。
实施例
以下示出实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。以下％所示的物的量只要没有特别声明，该物为固体时以重量基准表示，为液体时以体积基准表示。
[实验例1]
[1-1.血浆样品]
在国立长寿医疗研究中心，准备分类为PiB-和PiB+的组的病例的血浆样品(76样品)。
PiB-(通过PiB-PET图像判断脑内的Aβ的蓄积为阴性的人)：50例
PiB+(通过PiB-PET图像判断脑内的Aβ的蓄积为阳性的人)：26例
为了判断对于脑内的Aβ的蓄积是阳性或阴性，获得受试者的脑的PiB-PET图像。大脑皮质的PiB累积量大于非特异性的白质的PiB累积量或为同等的受试者评定为阳性。仅利用向白质的非特异性的累积，皮质中几乎未观察到累积的受试者判定为阴性。认知功能障害依据2011年发表的NIA-AA诊断基准进行判断。
PiB累积平均值(mcSUVR:mean cortical Standard Uptake Value Ratio)是对皮质的PiB累积进行定量，以小脑为基准求出大脑的累积比。其中，PiB-中为2例的缺失值。
[1-2.抗体固定化珠的准备]
准备以淀粉样蛋白β蛋白质(Aβ)的3-8残基作为表位的抗Aβ抗体(IgG)的克隆6E10(Covance公司)。
相对于抗Aβ抗体(IgG)100μg，使磁珠(Dynabeads(注册商标)M-270Epoxy)约3.3×108个在固定化缓冲液(含有1M硫酸铵的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4))中、37℃下反应16～24小时，由此制作了抗AβIgG固定化珠。
[1-3.连续免疫沉淀法(Consecutive Immunoprecipitation；cIP)]
(第1反应工序)
向人血浆250μL中混合以10pM包含被稳定同位素标记的Aβ1-38(SIL-Aβ1-38)的第一IP反应缓冲液(0.2％(w/v)DDM,0.2％(w/v)NTM,800mM GlcNAc,100mM Tris-HCl,300mMNaCl,pH7.4)250μL，然后在冰上静置5～30分钟。SIL-Aβ1-38的Phe和Ile的碳原子被13C置换，作为用于对质谱的信号强度进行标准化的内标使用。将该血浆与抗AβIgG固定化珠混合，在冰上振荡1小时。
(第1清洗工序、第1洗脱工序)
然后，将前述抗体珠用第一IP清洗缓冲液(0.1％DDM,0.1％NTM、50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl)100μL清洗3次、用50mM乙酸铵缓冲液50μL清洗2次后，利用第一IP洗脱液(含有0.1％DDM的50mM甘氨酸缓冲液(pH2.8))洗脱与抗体珠结合的Aβ和Aβ样肽(即，APP衍生型肽)。
(中性化工序)
将得到的洗脱液与第二IP反应缓冲液(0.2％(w/v)DDM,800mM GlcNAc,300mMTris-HCl,300mM NaCl,pH7.4)混合而得到第一纯化溶液。
(第2反应工序)
将得到的第一纯化溶液与另外的抗Aβ抗体固定化珠混合，在冰上振荡1小时。
(第2清洗工序、第2洗脱工序)
然后，将抗Aβ抗体固定化珠用第二清洗缓冲液(0.1％DDM,50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl)50μL清洗5次、用50mM乙酸铵缓冲液50μL清洗2次、进而用H2O 30μL清洗1次后，利用第二IP洗脱液(含有5mM盐酸的70％(v/v)乙腈)5μL洗脱与抗体珠结合的Aβ和Aβ样肽(APP衍生型肽)。由此得到第二纯化溶液。将第二纯化溶液供于质谱分析。
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷：(n-Dodecyl-β-D-maltoside：DDM)[临界胶束浓度cmc:0.009％]
正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷：(n-Nonyl-β-D-thiomaltoside：NTM)[cmc:0.116％]
[1-4.通过MALDI-TOF MS的检测]
作为Linear TOF用的基质，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid：CHCA)。通过用70％(v/v)乙腈1mL溶解CHCA 1mg制备了基质溶液。作为基质添加剂，使用0.4％(w/v)亚甲基二膦酸(methanediphosphonic acid：MDPNA)。将1mg/mL CHCA溶液与0.4％(w/v)MDPNA进行等量混合后，将混合液0.5μL滴加至μFocusMALDI plateTM900μm(Hudson Surface Technology,Inc.,Fort Lee,NJ)上，进行干固。
取出上述免疫沉淀中得到的第二纯化溶液1μL，滴加至μFocus MALDI plateTM 900μm上的基质。
质谱数据使用AXIMA Performance(Shimadzu/KRATOS,Manchester,UK)，在正离子模式的Linear TOF下获得。针对1孔为400个斑点、每16000次拍摄(shots)进行累计。峰检测限界的基准为S/N比3以上。Linear TOF的m/z值由峰的平均质量表示。m/z值使用人血管紧张素(human angiotensin II)和人促肾上腺皮质激素18-39(human ACTH fragment 18-39)、牛胰岛素氧化β链(bovine insulin oxidized beta-chain)、牛胰岛素(bovineinsulin)作为外标进行校准。
[1-5.Aβ和Aβ样肽的峰强度的标准化]
各质谱中，通过用各Aβ和Aβ样肽(APP衍生型肽)的信号强度除以内标肽(SIL-Aβ1-38)的信号强度，从而使Aβ和Aβ样肽的信号强度标准化。然后，针对1样品求出由4个质谱得到的各APP衍生型肽的标准化强度(Normalized intensity)的平均值并用于统计分析。此处，用于平均化的4个标准化强度中，不在中央值的0.7～1.3倍的范围内的标准化强度视为离群值，从平均化的数据处理中除去。未达到检测下限(S/N＜3)或出现离群值，且用于平均化的标准化强度的数据数量低于3时为不能检测。
[1-6.统计]
PiB-和PiB+的组间比较使用t检验进行评价。为了评价辨别PiB-和PiB+的性能而使用受试者工作特征ROC(Receiver Operatorating Characteristic)曲线，求出该曲线以下的面积(AUC：area under the curve)、灵敏度(Sensitivity)、特异性(Specificity)和准确度(Accuracy)。所有的检验通过双侧检验进行，显著性水平为P＜0.05。各标记物值与mcSUVR的相关分析中，使用皮尔逊积矩相关系数(Pearson product-moment correlationcoefficient)进行评价。其中，由于mcSUVR中有2例的缺失值，因此用74例进行了分析。
[1-7.各标记物的组间比较]
将Aβ1-39、Aβ1-40或APP669-711的归一化强度(Normalized intensity)相对于Aβ1-42的归一化强度的比率(Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42、APP669-711/Aβ1-42)作为标记物，进行了PiB-与PiB+的组间比较(图1、2、3)。进行t检验时的P值均为P＜0.001，显示出与PiB-相比PiB+在统计学上显著增加。
图1是示出对于Aβ1-39/Aβ1-42进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。同样地，图2是示出对于Aβ1-40/Aβ1-42进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图3是示出对于APP669-711/Aβ1-42进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。均为关于单独标记物的结果。
箱线图中，各组中由箱所示的范围表示全部样品中强度比顺序为25～75％中的样品的强度比分布范围(四分位数范围)，箱的上下所示的横线表示处于从箱的上端和下端至四分位数范围的1.5倍的范围内的样品的各自最大值和最小值，箱中的横棒表示强度比的中央值。以下的各箱线图中也为相同。
[1-8.各标记物的ROC分析]
为了评价Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的判定性能，将PiB+作为阳性，进行了PiB+组相对于PiB-组的ROC分析(图4、5、6)。其结果，Aβ1-39/Aβ1-42显示出最高的AUC＝0.898，接着，APP669-711/Aβ1-42显示出高的AUC＝0.894，Aβ1-40/Aβ1-42显示出AUC＝0.828。任意标记物的AUC均为0.8以上，显示出能够精度良好地判定PiB-组与PiB+组。
图4是有关Aβ1-39/Aβ1-42的ROC曲线。同样地，图5是有关Aβ1-40/Aβ1-42的ROC曲线。图6是有关APP669-711/Aβ1-42的ROC曲线。均为关于单独标记物的结果。
各标记物的ROC曲线中，将“灵敏度+特异性-1”最高的值设定为截断值(cut-offvalue)。将设定的截断值及该值中的灵敏度、特异性和准确度示于表1。Aβ1-39/Aβ1-42显示出最高的准确度＝0.855。表1中，编号1～3是分析单独标记物的结果。
[表1]
Figure BDA0001596756930000231
[1-9.各标记物值与mcSUVR的相关分析]
为了调查Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42是否反映了脑内淀粉样蛋白蓄积量，分析了各指标与mcSUVR的相关性(图7、8、9、表1)。其结果，显示出通过全部3个标记物使皮尔逊积矩相关系数(r)为0.4以上且具有相关性，尤其是Aβ1-39/Aβ1-42的相关系数(r)显示出0.630这样最强的相关性。
显示出Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42可以成为判定脑内淀粉样蛋白蓄积状态有用的指标。对于这次76个病例的分析，Aβ1-39/Aβ1-42显示出最优异的判定性能。
图7是对于Aβ1-39/Aβ1-42横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42比率的散点图。同样地，图8是对于Aβ1-40/Aβ1-42横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-40/Aβ1-42比率的散点图。图9是对于APP669-711/Aβ1-42横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示APP669-711/Aβ1-42比率的散点图。均为关于单独标记物的结果。另外，图中的“○”表示PiB-组，“●”表示PiB+组。以下的散点图中也为相同。
[1-10.使用了判别分析的标记物的组合方法]
通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、以及通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合来进行判别分析，得到各自的判别函数z。使用判别函数z，基于组合的标记物值求出判别评分。
使用判别函数z，基于组合的标记物值求出判别评分，然后，进行了如下统计分析。
[1-11.通过判别评分的组间比较]
对于组合各标记物而得到的判别评分，进行了PiB-与PiB+的组间比较(图10、11、12、13)。进行t检验时的P值均为P＜0.001，组合的情况下，也确认了与PiB-相比PiB+在统计学上显著地增加。
图10是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。同样地，图11是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图12是示出对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图13是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
[1-12.通过判别评分的ROC分析]
为了评价判别评分的判定性能，将PiB+作为阳性，进行了PiB+组相对于PiB-组的ROC分析(图14、15、16、17)。其结果，对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42(图14)、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42(图15)、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42(图16)这2种标记物的组合、以及通过这3种标记物的组合(图17)，分别是比单独标记物还高的AUC，显示出0.9以上(图14、15、16、17、表2)。即，通过组合标记物而使判别性能提高，能够以非常高的精度判别PiB-和PiB+。这次ROC分析中，Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合显示出最高的AUC。
图14是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。同样地，图15是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。图16是有关通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。图17是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合的ROC曲线。
判别评分＞0时判别为PiB+，判别评分＜0时判别为PiB-。即，将截断值为0时的各组合中的灵敏度、特异性和准确度示于表2(编号：11、12、13、14)。所有组合中，显示出与各自单独标记物相比还高的准确度。即，通过组合标记物而使正确判定的概率提高。这次分析中，通过3种标记物的组合显示出最高的准确度。表2中，编号11～14使用各标记物值进行判别分析，将组合的标记物的判别评分用于分析。
[表2]
Figure BDA0001596756930000271
[1-13.通过判别评分的与mcSUVR的相关分析]
为了调查组合的标记物的判别评分是否反映了脑内淀粉样蛋白蓄积量，对于各自的判别评分与mcSUVR的相关性进行了分析。对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42、以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合以及通过3种标记物的组合，与各自单独标记物相比，皮尔逊积矩相关系数(r)提高，得到更好地反映PiB累积度的结果(图18、19、20、21、表2)。这次相关分析中，通过3种标记物的组合显示出最高的相关系数。
图18是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的组合的判别评分的散点图。同样地，图19是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的判别评分的散点图。图20是示出对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的判别评分的散点图。图21是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的判别评分的散点图。
[实验例2]
[2-1.使用了基于全部样品的分布的标准化的标记物的组合方法]
在组合各标记物的值时，若将各数值直接平均或相加，则使该组合值受到数值大的标记物的影响变大。因此，为了将各标记物同等地组合，首先，对于Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42，分别进行了基于全部76个病例的分布的标准化。对于标准化，求出全全部76个病例的标记物值的平均值(X)和标准偏差(S)，利用下式将各样品的标记物值(xi)换算为z-score(zi)。
zi＝(xi-X)/S
平均所组合的标记物的z-score后，进行了以下统计分析。
实施了通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、以及通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合。
[2-2.通过标记物的组合的组间比较]
对于组合了各标记物的z-score进行了PiB-与PiB+的组间比较(图22、23、24、25)。进行t检验时的P值均为P＜0.001，在组合的情况下，也确认了与PiB-相比PiB+在统计学上显著地增加。
图22是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。同样地，图23是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图24是示出对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图25是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
[2-3.通过标记物的组合的ROC分析]
为了评价组合的标记物的判定性能，将PiB+作为阳性，进行了PiB+组相对于PiB-组的ROC分析(图26、27、28、29)。其结果，对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42(图27)、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42(图28)这2种标记物的组合、以及通过3种标记物的组合(图29)，是与各自单独标记物相比还高的AUC，显示出0.9以上(图27、28、29、表3)。即，通过组合标记物而使判别性能提高，能够以非常高的精度判别PiB-和PiB+。这次ROC分析中，Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合显示出最高的AUC。
图26是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。同样地，图27是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。图28是有关通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。图29是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合的ROC曲线。
各组合的ROC曲线中，将“灵敏度+特异性-1”最高的值设定为截断值。将设定的截断值和该值中的灵敏度、特异性和准确度示于表3(编号：21、22、23、24)。所有的组合中，显示出与各自单独标记物相比还高的准确度。即，通过组合标记物而使正确判定的概率提高。这次分析中，通过3种标记物的组合显示出最高的准确度。表3中，编号21～24是针对各标记物值进行基于全部样品的分布进行标准化后，将组合的标记物平均而得到的数值用于分析的结果。
[表3]
Figure BDA0001596756930000311
[2-4.通过标记物的组合的与mcSUVR的相关性分析]
为了调查组合的标记物的z-score是否反映了脑内淀粉样蛋白蓄积量，对各自的z-score与mcSUVR的相关性进行了分析。对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42、以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、以及通过3种标记物的组合，与各自单独标记物相比，皮尔逊积矩相关系数(r)提高，得到更好地反映PiB累积度的结果(图30、31、32、33、表3)。这次相关分析中，通过3种标记物的组合显示出最高的相关系数。
图30是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。同样地，图31是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。图32是示出对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的z-score的散点图。图33是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
[实验例3]
[3-1.使用了基于空白组的分布的标准化的标记物的组合方法]
实验例2中为了组合各标记物值而基于包括全部PiB-组和PiB+组在内的76个病例的分布进行了标准化。该实验例3中，进行了基于空白的PiB-组的50病例的分布的标准化，实施了组合的评价。对于标准化，求出PiB-组50个病例的标记物值的平均值(X)和标准偏差(S)，利用下式将各标记物值(xi)换算为z-score(zi)。
zi＝(xi-X)/S
将所组合的标记物的z-score平均后，进行了以下统计分析。
与实验例2中同样地，实施了通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42、Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42、以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、以及通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合。
[3-2.通过标记物的组合的组间比较]
对于组合了各标记物的z-score，进行了PiB-与PiB+的组间比较(图34、35、36、37)。进行t检验时的P值均为P＜0.001。使用了基于PiB-组的标准化的情况下，也确认了与PiB-相比PiB+在统计学上显著地增加。
图34是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。同样地，图35是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图36是示出对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。图37是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合进行PiB-与PiB+的组间比较的箱线图。
[3-3.通过标记物的组合的ROC分析]
为了评价组合的标记物的判定性能，将PiB+作为阳性，进行了PiB+组相对于PiB-组的ROC分析(图38、39、40、41)。其结果，通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42(图39)、以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42(图40)这2种标记物的组合以及通过3种标记物的组合(图41)，是与各自单独标记物相比还高的AUC，显示出0.9以上(图39、40、41、表4)。即，在使用了基于PiB-组的标准化的情况下，通过组合标记物而使判别性能提高，能够以非常高的精度判别PiB-和PiB+。在该ROC分析中，Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合显示出最高的AUC。
图38是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。同样地，图39是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。图40是有关通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的ROC曲线。图41是有关通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合的ROC曲线。
各组合的ROC曲线中，将“灵敏度+特异性-1”最高的值设定为截断值。将设定的截断值和该值中的灵敏度、特异性和准确度示于表4。所有组合中，显示出与各自单独标记物相比还高的准确度。即，通过组合标记物而使正确判定的概率提高。该分析中，Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合显示出最高的准确度。表4中，编号31～34是针对各标记物值基于PiB-组50个病例的分布进行标准化后，将组合的标记物平均而得到的数值用于分析的结果。
[表4]
Figure BDA0001596756930000351
[3-4.通过标记物的组合的与mcSUVR的相关性分析]
为了调查组合的标记物的z-score是否反映了脑内淀粉样蛋白蓄积量，分析了各自的z-score与mcSUVR的相关性。对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42、以及Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、以及通过3种标记物的组合，与各自单独标记物相比，皮尔逊积矩相关系数(r)提高(图42、43、44、45、表4)。即，在使用了基于PiB-组的标准化的情况下，通过组合而得到了更良好地反映PiB累积度的结果。该相关分析中，Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合显示出最高的相关系数。
图42是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。同样地，图43是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。图44是示出对于通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示通过Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这2种标记物的组合的z-score的散点图。图45是示出对于通过Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42这3种标记物的组合、横轴表示PiB累积平均值(mcSUVR)、纵轴表示Aβ1-39/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的组合的z-score的散点图。
根据以上的分析结果，判明了与单独使用标记物相比，通过组合而使PiB-和PiB+的判别精度提高，与PiB累积度的相关性也增强。即，显示出通过组合Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42和APP669-711/Aβ1-42的血中标记物，各标记物互补地对脑内淀粉样蛋白蓄积精度更良好地进行检测的效果。另外，作为组合方法，无论作为使用了各标记物的判别分析、还是作为对各标记物值进行标准化后进行组合的方法，均显示出通过组合标记物带来的效果。作为对各标记物值进行标准化的方法，无论是作为基于全部样品的标准化还是基于PiB-组的标准化，均显示出通过组合标记物带来的效果。
以上例证的结果显示出：本发明的组合标记物作为判断脑内Aβ蓄积状态的血中标记物是有用的。另外，由此结果表明，它能够用于辅助阿尔茨海默病诊断以及发病前诊断。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所(SHIMADZU CORPORATION)
国立研究开发法人国立长寿医疗研究中心(NATIONAL CENTER FORGERIATRICS AND GERONTOLOGY)
<120> 评价脑内的淀粉样蛋白β蓄积状态的多重生物标记物及其分析方法
<130> G116251WO
<150> JP 2015-183372
<151> 2015-09-16
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val
35
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 4
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 4
Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His
1 5 10 15
His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly
20 25 30
Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40

Claims (6)

1.一种判断脑内的Aβ蓄积状态的标记物，其包括：
生物体来源试样中的氨基酸序列如序列号1所示的Aβ1-39水平相对于氨基酸序列如序列号3所示的Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42，和
选自由氨基酸序列如序列号2所示的Aβ1-40水平相对于氨基酸序列如序列号3所示的Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；以及
氨基酸序列如序列号4所示的APP669-711水平相对于氨基酸序列如序列号3所示的Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少1个比
的组合，其中所述生物体来源试样为血液。
2.源自受试对象的生物体来源试样中的标记物在制备判断脑内的Aβ蓄积状态的试剂中的应用，其包括如下工序：
测定工序，将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
氨基酸序列如序列号3所示的Aβ1-42、
氨基酸序列如序列号1所示的Aβ1-39、和
选自由氨基酸序列如序列号2所示的Aβ1-40和氨基酸序列如序列号4所示的APP669-711组成的组中的至少1个
的标记物的检测，得到所述生物体来源试样中的、
Aβ1-42、
Aβ1-39、和
选自由Aβ1-40和APP669-711组成的组中的所述至少1个
的各测定水平；
算出工序，求出
Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42，和
选自由Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；以及
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少1个比；
导出工序，利用数学方法由所述算出的各比导出组合的复合变量；以及
评价工序，以脑内的Aβ蓄积阴性者的所述复合变量作为基准水平，受试对象的所述复合变量高于所述复合变量的基准水平的情况下，判定为受试对象的脑内Aβ的蓄积量大于所述Aβ蓄积阴性者的脑内Aβ的蓄积量，
其中所述生物体来源试样为血液。
3.源自受试对象的生物体来源试样中的标记物在制备针对脑内的Aβ蓄积状态判断医学干预的有效性的试剂中的应用，其分别在对受试对象进行的医学干预的前后，进行包括如下工序的检查：
测定工序，将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
氨基酸序列如序列号3所示的Aβ1-42、
氨基酸序列如序列号1所示的Aβ1-39、和
选自由氨基酸序列如序列号2所示的Aβ1-40和氨基酸序列如序列号4所示的APP669-711组成的组中的至少1个
的标记物的检测，得到所述生物体来源试样中的、
Aβ1-42、
Aβ1-39、和
选自由Aβ1-40和APP669-711组成的组中的所述至少1个
的各测定水平；
算出工序，求出
Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42，和
选自由Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；以及
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少1个比；以及
导出工序，利用数学方法由所述算出的各比导出组合的复合变量，
将医学干预前的受试对象的所述复合变量与医学干预后的受试对象的所述复合变量进行比较，针对脑内的Aβ蓄积状态判断所述医学干预的有效性，
其中所述生物体来源试样为血液。
4.源自受试对象的生物体来源试样中的标记物在制备针对受试对象的脑内的Aβ蓄积状态进行未来症状的进展预测、痴呆发病风险的试剂中的应用，其对受试对象通过1次或经时多次地进行包括如下工序的检查：
测定工序，将源自受试对象的生物体来源试样供于包含：
氨基酸序列如序列号3所示的Aβ1-42、
氨基酸序列如序列号1所示的Aβ1-39、和
选自由氨基酸序列如序列号2所示的Aβ1-40和氨基酸序列如序列号4所示的APP669-711组成的组中的至少1个
的标记物的检测，得到所述生物体来源试样中的、
Aβ1-42、
Aβ1-39、和
选自由Aβ1-40和APP669-711组成的组中的所述至少1个
的各测定水平；
算出工序，求出
Aβ1-39水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-39/Aβ1-42，和
选自由Aβ1-40水平相对于Aβ1-42水平的比：
Aβ1-40/Aβ1-42；以及
APP669-711水平相对于Aβ1-42水平的比：
APP669-711/Aβ1-42
组成的组中的至少1个比；以及
导出工序，利用数学方法由所述算出的各比导出组合的复合变量，
基于1次或经时多次的受试对象的所述复合变量的值，针对受试对象的脑内的Aβ蓄积状态进行未来症状的进展预测、痴呆发病风险的预测，
其中所述生物体来源试样为血液。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的应用，其中，所述数学方法是使用判别分析、多元回归分析、主要成分回归分析、偏最小二乘、逻辑回归的方法。
6.根据权利要求2～4中任一项所述的应用，其中，所述数学方法是对所述算出工序中的各比进行标准化后，导出经标准化的至少2个比的平均值或总计值的方法。
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