CN108004151A - 一种从海带中分离的翅孢壳真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从海带中分离的翅孢壳真菌，其保藏编号CGMCC No.14640。本发明再一个方面提供上述真菌的次生代谢产物，所提供的次生代谢产物在制备抗老年痴呆制品中的应用。本发明从海带中分离纯化出内生菌，并对菌株进行体外AChE抑制活性的筛选，对活性菌株进行鉴定和发酵条件的优化。该真菌代谢物的乙酸乙酯相具有抗氧化损伤和抑制乙酰胆碱酯酶的双重活性，能够改善D‑半乳糖致AD模型小鼠学习记忆能力。

Description

一种从海带中分离的翅孢壳真菌及其应用

技术领域

本发明属于海洋有益菌筛选技术领域，具体涉及一种从海带中分离的真菌及其次生代谢产物的应用。

背景技术

特境微生物作为新的药物来源已经显示出巨大的开发潜力。作为一种特境微生物，植物内生菌是指寄生于宿主体内并且不引起宿主致病症状的一类微生物，在与宿主长期共进化的过程中进行“基因重组”，既有可能产生与宿主相同或相似的活性成分，也有可能产生与宿主完全不同的活性成分。

海带(Laminaria japonica)是一种大型海生褐藻植物，在我国海域分布非常广泛。海带不仅能防止肥胖、胆结石、便秘、肠胃炎等代谢性疾病，还具有防癌抗癌、降血压、降血糖、预防动脉硬化和血栓形成、排出体内铅毒等功效，素有“长寿菜”的美誉。而与海带共生并可以产生如抗生素、毒素等物质以利于海带生长代谢或增强海带的抵御能力的内生真菌必然会产生可加以利用的功能活性成分。

发明内容

本发明的目的是提供一种从海带中分离的翅孢壳真菌及其次生代谢产物的应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种从海带中分离的翅孢壳真菌(Emericellopsis sp.)QDUL-1株，于2017年12月01日保存在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14640。

本发明再一个方面提供一种上述真菌的培养方法，是将真菌接种到察氏培养基中，在28℃进行培养；

本发明再一个方面提供上述真菌的次生代谢产物；

所述的次生代谢产物，其制备方法如下：将真菌QDUL-1进行液体发酵，培养基为察氏培养基，接种量为10％，28℃培养14d；发酵结束后，过滤得到滤液；将滤液经旋转蒸发仪浓缩，乙酸乙酯萃取后得到次生代谢产物；

所提供的次生代谢产物在制备抗老年痴呆制品中的应用。

本发明从海带中分离纯化出内生菌，并对菌株进行体外AChE抑制活性的筛选，对活性菌株进行鉴定和发酵条件的优化。该真菌代谢物的乙酸乙酯相具有抗氧化损伤和抑制乙酰胆碱酯酶的双重活性，能够改善D-半乳糖致AD模型小鼠学习记忆能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：真菌的筛选

取海带样品，用自来水冲洗干净表面的泥沙，将其分别置于75％的乙醇溶液、1％的NaClO溶液和75％的乙醇溶液进行表面消毒3、5和1min，然后用无菌水冲洗2次，用消毒的手术剪将其分割成1cm×1cm的小块，将处理好的样品置于加有青霉素和链霉素的WA培养基上，于28℃的培养箱中倒置培养。待平板中长出菌体时，采用菌丝尖端切割法对其进行分离纯化；将获得的纯培养物置于4℃冰箱保存备用。

分离获得的菌株首先接种到PD液体培养基中，于28℃，140r/min恒温振荡培养3d，作为种子液。然后将其接种到察氏培养基中，接种量为10％、在28℃下继续培养10d。发酵结束后，将发酵液于离心机10000r/min离心8～10min，取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相，浓缩得浸提物。将浸提物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为5mg/mL的溶液。AChE活性抑制率的测定参照改良过的Ellman法，筛选具有抑制AChE的活性菌株。

同时借助薄层色谱生物自显影方法进行发酵活性筛选：将浸提物样品溶液在硅胶板上展开，均匀喷上AChE和乙酸-1-萘酯，37℃孵育20min，均匀喷上固蓝B盐溶液，有活性的化合物会在板上出现白色斑点(紫色背景)。

通过筛选，最终获得了发酵能力最高的菌株，将该菌株命名为QDUL-1株，经过遗传分析表明该菌株属于翅孢壳真菌属(Emericellopsis sp.)，于2017年12月01日保存在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14640。

实施例2 次生代谢产物的制备

1、海带内生真菌Emericellopsis sp.QDUL-1代谢产物乙酸乙酯相与培养基浸提物的制备步骤如下：

2、将内生真菌QDUL-1进行液体发酵，培养基为察氏培养基，接种量为10％，28℃培养14d。发酵结束后，用4层无菌纱布过滤，得到过滤液。将过滤液和察氏培养基分别经旋转蒸发仪浓缩，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相，得待测样品浸提物和培养基浸提物。

3、实验分组及造模方法

小鼠经3天适应性喂养后，随机分为6组，每组10只。分别为:空白对照组、模型对照组、他克林阳性对照组、乙酸乙酯相低、中、高剂量组。除空白组，其余各组每日皮下注射200mg/(kg bw·d)D-半乳糖，空白组皮下注射等体积生理盐水。他克林阳性对照组按10mg/(kg·d bw)每日灌胃，并使其灌胃量与空白组、模型组相同。乙酸乙酯相低、中、高剂量组分别按13.33mg/(kg·d bw)、38.33mg/(kg·d bw)和63.33mg/(kg·d bw)灌胃，空白组和模型组每日灌胃等体积生理盐水。小鼠饲养温度为18～22℃，自然光照，自由进食和饮水。每日定时灌胃、皮下注射一次，连续饲喂6周，记录小鼠体重增加量。

4、Morris水迷宫实验

定位航行实验使用Morris水迷宫测定小鼠的学习和记忆能力。第43天开始进行试验，共5d。实验开始前小鼠自由游泳2min。正式实验每天训练2次，每次120s，随机选择东、南、西、北4个象限中的一个，将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠寻找并爬上平台所需时间，该时间即为逃避潜伏期。如果实验小鼠在120s内未找到平台，则由实验者将其引至平台，停留30s，该实验小鼠的逃避潜伏期记为120s。每只小鼠训练次数共10次。计算每天各组小鼠2次逃避潜伏期。

空间搜索实验用于测定小鼠对平台空间位置的记忆保持能力。试验小鼠训练5天后，于第6天将平台撤离，随机选取一个象限将小鼠放入池中，使小鼠在水中游泳120s，记录120s内小鼠第1次穿越平台所在位置所需的时间以及穿越平台所在象限的次数。

5、生化指标测定

在空间搜索实验后将小鼠禁食12h，称重。摘除眼球取血处死，加入抗凝血剂，静置3h后，血样在4℃下5000r/min离心10min，收集上清液即血清；取血后立即解剖小鼠，迅速取出肝脏和脑部用生理盐水清洗，用滤纸吸干，将肝脏和脑部组织研磨，以制备10％匀浆液(匀浆过程始终处于冰水中)，在4℃下5000r/min离心10min后除去细胞碎片，取上清液备用。按照试剂盒说明书测定血清、肝脏和脑部组织SOD、GSH－Px、CAT酶活力及MDA含量以及小鼠脑部AchE和ChAT活性。

6、数据处理

实验数据采用SPSS 18.0软件进行分析，平均值±标准差来表示，组间均值比较采用单因素方差分析和Duncan多重比较分析，显著性水平p＝0.05。

实验的结果如下：

1.Morris水迷宫实验结果

1.1小鼠体重变化结果

模型建造期间，空白对照组仅体重稳定增加，其他指标无变化。模型对照组小鼠体重亦增加，但活动量减少，精神萎靡，反应迟钝。体重测定结果表明：6组小鼠处死前与给药前相比体重均有所增加，无显著性差异。

表1 小鼠体重增加量

注:同列不同小写字母代表差异显著(p＜0.05)，表1～表7同。

1.2对AD模型小鼠学习和记忆能力的影响

定位航行试验：培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。各组小鼠随着训练时间的延长，逃避潜伏期均有所缩短。与空白组相比，模型组逃避潜伏期明显高于空白组小鼠(p<0.05)。与模型组相比，他克林组和低、中、高剂量组逃避潜伏期时间明显延长于模型对照组(p<0.05)，随着样品剂量的增加，小鼠的逃避潜伏期相对应缩短。与他克林组相比，高剂量组逃避潜伏期短于阳性对照组，效果优于阳性对照。说明待测样品尤其是高剂量组有增强D-半乳糖模型小鼠学习记忆能力的作用。

空间探索实验：培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。撤出平台后，与模型组相比，空白组在Morris水迷宫穿越平台次数和象限停留的时间明显延长(p<0.05)。中、高剂量组相对于模型组明显缩短(p<0.05)，随着待测样品剂量的增高，受试动物组有逐步延长的趋势。高剂量组穿越平台次数与阳性对照组基本一致，说明待测样品具有改善D-半乳糖模型小鼠对空间位置记忆能力作用的趋势。

表2 定位航行和空间探索结果

3.生化指标测定结果

3.1 QDUL-1次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和脑部组织MDA含量的影响

从表3可知，培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。模型组小鼠血清、肝脏和大脑中MDA含量显著高于空白组(p<0.05)，说明建模成功。各组织中受试动物组MDA含量明显低于模型组(p<0.05)。与他克林组相比，高剂量组小鼠的3个组织中MDA含量均少于他克林组，效果优于他克林。

表3 小鼠血清和肝脏MDA含量

3.2 次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和脑部组织SOD活力的影响

由表4可知，培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。与空白组相比，模型组小鼠血清、肝脏和脑部组织中SOD酶活力明显降低(p<0.05)。低、中、高剂量组小鼠血清、肝脏和脑部组织中SOD活力高于模型组，且各组织中、高剂量组与模型组差异显著(p<0.05)。与他克林组相比，高剂量组小鼠肝脏组织SOD活力较高。

表4 小鼠血清和肝脏SOD活力

3.5 次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和脑部组织GSH-Px活力的影响

由表5可知，培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。模型组小鼠血清、肝脏和脑部组织中GSH-Px活力较空白对照组显著降低(p<0.05)。与模型组相比，小鼠血清低、中、高剂量组和肝脏中、高剂量组以及大脑中、高剂量组中GSH-Px活力显著降低(p<0.05)。与他克林组相比，小鼠血清高剂量组GSH-Px活力较高。

表5 小鼠血清和肝脏GSH-Px活力

3.6 次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和脑部组织CAT活力的影响

由表6可知，培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。模型组小鼠肝脏、脑部组织和血清中CAT活力较空白对照组显著降低(p<0.05)。高剂量组大脑、血清中CAT活力与模型组差异显著(p<0.05)。与他克林组相比，小鼠血清高剂量组CAT活力较高。

表6 小鼠血清和肝脏CAT活力

3.7 次生代谢产物对小鼠脑部AchE、ChAT活力的影响

由表7可知，培养基浸提物对照组与空白组基本一致，无显著性差异。与空白组相比，模型组小鼠脑组织AchE活性显著升高(P＜0.05)，ChAT活性显著降低(P＜0.05)，可以认为D-半乳糖导致小鼠衰老和记忆障碍的机制之一是胆碱能系统损伤。与模型对照组相比，小鼠脑部低、中、高剂量组AchE活性明显降低(P＜0.05)，小鼠脑部中、高剂量组ChAT活性明显升高(P＜0.05)。与阳性对照组相比，小鼠脑部高剂量组AchE活力低于阳性对照组，ChAT活力高于阳性对照组。说明该菌株次生代谢产物尤其是高剂量组可以在一定程度上改善D-半乳糖对小鼠脑部造成的胆碱能系统损伤，提高小鼠的学习和记忆能力。

表7 小鼠脑部AchE、ChAT活力

上述结果表明，Emericellopsis sp.QDUL-1次生代谢产物显著提高了小鼠血清、肝脏和脑部组织中SOD、CAT、GSH-Px水平、降低MDA水平，而且能够显著降低小鼠脑部组织AchE活性，提高ChAT活性，部分高剂量组效果优于阳性对照他克林。说明QDUL-1次生代谢产物能够降低氧化应激程度，减轻自由基对脑组织的损伤，延缓大脑衰老，恢复小鼠中枢胆碱功能，从而改善D-半乳糖所致衰老模型小鼠的学习记忆能力。

Claims (8)

1.一种翅孢壳真菌，其特征在于，所述的翅孢壳真菌的保藏编号为CGMCC No.14640。

2.权利要求1所述的翅孢壳真菌在制备次生代谢产物中的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的次生代谢产物具有抗氧化损伤和抑制乙酰胆碱酯酶的活性。

4.一种培养权利要求1所述的翅孢壳真菌的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求1所述的翅孢壳真菌接种到察氏培养基中，在28℃进行培养。

5.一种真菌的次生代谢产物，其特征在于，所述的次生代谢产物为权利要求1所述的真菌的发酵液通过乙酸乙酯萃取获得的。

6.如权利要求5所述的次生代谢产物，其特征在于，所述的次生代谢产物的制备方法是将真菌接种到察氏培养基中进行液体发酵，发酵结束后，过滤得到滤液；将滤液经旋转蒸发仪浓缩，乙酸乙酯萃取后得到次生代谢产物。

7.权利要求5所述的次生代谢产物在制备抗老年痴呆制品中的应用。

8.一种抗老年痴呆制品，其特征在于，所述的制品中包含有药理有效浓度的权利要求5所述的次生代谢产物。