CN107998120A - 银杏双黄酮类化合物在制备预防和治疗哮喘药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了银杏双黄酮类化合物在制备预防和治疗哮喘药物中的应用。该银杏双黄酮类化合物为7‑去甲基双黄酮、银杏黄素、紫杉双黄酮和异银杏双黄酮中的至少一种。本发明公开了一种预防和治疗哮喘药物的组合物，该组合物包含银杏双黄酮类化合物，还包含甘草、桑白皮和苦杏仁中的至少一种。本发明还公开了一种所述的银杏双黄酮类化合物和药学上可接受的赋形剂混合的药物组合物，所述银杏双黄酮类化合物的质量百分比大于等于2.5％。所述银杏双黄酮能抑制炎症细胞在肺部募集，降低肺部炎症因子的表达，并降低炎症通路PI3K相关蛋白的表达；且无明显毒副作用，长期用药安全可靠。

Description

银杏双黄酮类化合物在制备预防和治疗哮喘药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及银杏双黄酮在制备预防和治疗哮喘的药物中的应用。

背景技术

哮喘是一种以可逆性支气管痉挛和气道高反应为特点的气道慢性炎症。19世纪以来，人们对哮喘的发病机制和治疗措施的认识都有了长足的进展，哮喘的治疗有了质的飞跃。但令人惊讶的是，近年来哮喘患病率和死亡率仍然呈逐年上升的趋势，越来越多的证据表明，哮喘仍然是现代人类面临的一个医学难题。据2015年6月发表的一份统计结果表示，全球约有2.35亿人患有哮喘。可见，寻找控制与治疗哮喘的药物迫在眉睫。

现阶段治疗哮喘药物的开发主要集中在化学药物与单克隆抗体。现有的药物主要有糖皮质激素、色甘酸钠、酮替芬、白三烯受体拮抗剂、组胺H1受体拮抗剂以及缓解性药物β2受体激动剂如沙丁胺醇、抗胆碱药物如异丙托溴铵和茶碱类药物。另外，许多针对细胞炎症因子的单克隆抗体的研究也较多，如抗IL-5单抗、IgE抗体Omalizumab等。

以上药物存在一定的缺陷，β2受体激动剂存在药物耐受性的问题以及心悸、震颤、头痛等不良反应。糖皮质激素作为主要的治疗哮喘的药物，能增加白内障和骨质疏松症的风险，以及抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的功能，造成局部并发症。天然药物由于其毒副作用小，天然药物来源广泛，可筛选的活性成分众多，有多种不同功能的有效的抗炎作用成分，在开发出哮喘的临床药物有很大的潜力。

银杏(ginkgo biloba L)，又名公孙树，《本草纲目》记载银杏果在咳嗽、哮喘、遗尿、化脓性的皮肤感染等方面的应用。在《中国药典》中，银杏归心、肺经，功能主治敛肺平喘，肺虚咳喘等。银杏叶提取物主要用来治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等病症。但银杏提取物治疗哮喘的药品未见上市，标准提取物治疗哮喘的研究亟待进行。

发明内容

本发明解决了现有技术中预防和治疗哮喘药物的毒副作用大或治疗效果不佳的问题，从银杏中开发提取出新的预防和治疗哮喘的有效药物。

按照本发明的一个方面，提供了银杏双黄酮类化合物在制备预防和治疗哮喘药物或保健品中的应用。

优选地，所述银杏双黄酮类化合物为7-去甲基双黄酮、银杏黄素、紫杉双黄酮和异银杏双黄酮中的至少一种。

所述药物或保健品中的银杏双黄酮类化合物用于抑制炎症细胞在肺部募集；

优选地，所述炎症细胞为嗜酸性粒细胞。

所述药物或保健品中的银杏双黄酮类化合物用于抑制炎症因子的表达。

按照本发明的另一方面，提供了一种预防和治疗哮喘的药物组合物，该组合物包含银杏双黄酮类化合物，还包含甘草、桑白皮和苦杏仁中的至少一种。

优选地，所述药物组合物按照重量份的主要原料为：银杏双黄酮类化合物1-5份、甘草1-3份、桑白皮1-5份、苦杏仁1-5份；

优选地，所述药物组合物按照重量份的主要原料为：银杏双黄酮类化合物3份、甘草1份、桑白皮3份、苦杏仁3份。

优选地，所述组合物还包含葶苈子和枇杷叶中的至少一种。

按照本发明的另一方面，提供了一种预防和治疗哮喘的药物组合物，其特征在于，包括所述的银杏双黄酮类化合物和药学上可接受的赋形剂；

优选地，所述赋形剂为淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁和微粉硅胶中的至少一种。

优选地，所述银杏双黄酮类化合物的质量百分比大于等于2.5％。

优选地，该药物组合物剂型为片剂、口服液、颗粒剂、喷雾剂、注射液、粉针剂或胶囊剂。

按照本发明另一方面，提供了一种药物组合物的制备方法，将所述的银杏双黄酮类化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)银杏双黄酮类化合物具有极强的抗炎平喘作用，效果明显优于银杏其他成分。抗炎机理为银杏双黄酮能抑制炎症细胞在肺部募集，降低肺部炎症因子的表达，并降低炎症通路PI3K相关蛋白的表达。以哮喘的重要指标肺部炎症因子IL-5为参考，阳性对照组小鼠肺泡灌洗液中IL-5浓度为885pg/ml，地塞米松组117.5pg/ml，银杏双黄酮给药组127.8pg/ml，银杏内酯组368.7pg/ml，银杏黄酮组491.3pg/ml，银杏提取物低剂量组462.6pg/ml，高剂量给药组421.3pg/ml。银杏双黄酮抑制炎症因子的作用与地塞米松组相当，而且远优于银杏中的其他成分。

(2)银杏双黄酮类药物无明显毒副作用。急性毒性实验和长期毒性试验的血常规数据等各项指标表明，长期用药安全可靠。

附图说明

图1为实施例1的银杏双黄酮的液相图谱与质谱图谱。

图2为实施例2的银杏双黄酮对哮喘小鼠肺泡灌洗液中白细胞的影响。

图3为实施例2的肺部气管组织切片图。

图4为实施例3的各种不同银杏活性成分对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中炎症因子的影响图。

图5为实施例4的哮喘小鼠肺泡灌洗液中炎症因子的表达图。

图6为实施例5的肺泡灌洗液中细胞的信号通路western-bolt图以及各个通路表达图。

图7为实施例6的含有双黄酮的组合药物不同给药剂量对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中炎症因子的影响图。

图8为实施例8的血常规指标中的总白细胞数指标。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：银杏双黄酮类化合物的提取

取干燥银杏叶粗粉500g，5L的乙醚或乙酸乙酯回流提取2次，回收溶剂，初提液用石油醚洗涤至无色，上硅胶柱，乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，得银杏双黄酮粗品。采用一定比例的吡啶和水对粗品进行重结晶，上硅胶柱，一定比例的乙酸乙酯与甲醇进行洗脱，收集四种双黄酮部分，合并，干燥，得含四种银杏双黄酮的黄色干燥固体7.5g。取含四种银杏双黄酮的黄色干燥固体，甲醇溶解，利用LC-MS进行含量检测与杂质分析。液相条件如下：

液相产品型号:1100LC/MSD Trap，生产厂家:美国Agilent公司，检测波长为280nm，350nm，流速为1.0ml/min，液相柱型号XDB-C18。质谱条件为ESI源，检测模式为正离子模式与负离子模式。

结果参见附图1，液相色谱的结果(图1a和b)显示，四种双黄酮总量HPLC≥90％。质谱结果见(图1中cdef)，经质谱图库对比，发现四个主要峰分别为：7-去甲基双黄酮，银杏黄素，异银杏黄酮以及紫杉双黄酮。其中，少量杂质为穗花杉双黄酮(图1g)以及银杏黄素的异构体。银杏双黄酮类化合物的结构式如下：

当R₁＝OH、R₂＝OH时，该化合物为7-去甲基双黄酮；当R₁＝OCH₃、R₂＝OH时，该化合物为银杏黄素；当R₁＝OH、R₂＝OCH₃时，该化合物为异银杏双黄酮；当R₁＝OCH₃、R₂＝OCH₃时，该化合物为紫杉双黄酮，又名金松双黄酮。

实施例2：银杏双黄酮类化合物对哮喘小鼠肺部炎症细胞的影响

按照《药理学试验方法》中的哮喘模型实验方法，建立哮喘小鼠模型。动物：BALB/c小鼠，6～8年周龄，雌性，体重20～25g。卵清蛋白致敏，小鼠出现烦躁不安，呼吸急促，腹肌痉挛，两便失禁为阳性反应。

给药方法为：银杏双黄酮类化合物(按实施例1制得，包含四种银杏双黄酮，HPLC≥90％)剂量分别为10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg。预防组为超声雾化前2h给药；治疗组为15-20d雾化结束后连续给药6d。

支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数及分类检测：实验结束后处死小鼠，取完整气管和肺，用生理盐水0.8ml灌洗双肺，回收灌洗液，共2次。收集的BALF于4℃，离心10min，转速1000r/min。沉淀细胞用0.5mlPBS重悬，使用血细胞分析仪对细胞进行计数。

肺组织病理变化：处死动物后取双肺置于4％的多聚甲醛固定，常规制备病理切片，HE染色后观察肺组织病理炎症等病变。

对照结果参见附图2和3。结果显示：银杏双黄酮能显著降低肺部炎症细胞的总量，抑制炎症细胞在肺部募集。尤其是对于嗜酸性粒细胞EOS，具有显著的降低作用，且与给药剂量成一定的相关性。如图2所示：其中纵坐标为细胞数量，横坐标依次为白细胞总数totalcells，嗜酸性粒细胞EOS，嗜中性粒细胞Neut，单核细胞Mono，淋巴细胞Lym，嗜碱性粒细胞Baso。共有五个实验组，分别为空白组NC，模型组PC以及双黄酮三种不同浓度给药组剂量分别为10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，记为BG(10)，BG(40)，BG(80)。由图2中可以清楚的显示出，相比于模型组PC，双黄酮给药组中的白细胞总数与各类白细胞明显降低。另外，给药剂量越大，白细胞数量下降更为明显。因此可以看出，给药双黄酮后，肺部的炎症细胞数量明显下降，双黄酮能抑制哮喘小鼠肺部炎症细胞的浸润。给药浓度越高，抑制炎症细胞浸润效果越明显。

如图3所示：A、B、C组分别代表空白组、模型组合给药组，左边的图是原始切片图，右边的图是放大后的切片图。由此可见，在肺部组织切片中，可见给药后，支气管杯状细胞脱落减少，肺部炎症细胞浸润明显减少。可见在哮喘模型中，给药双黄酮后，对肺部炎症细胞的浸润具有一定的抑制作用，对哮喘具备预防和治疗作用。

实施例3：银杏双黄酮与银杏中其他活性成分对哮喘预防和治疗作用的比较

本实施中哮喘小鼠造模与实施例2相同。

给药分组为：阳性对照药为地塞米松(1mg/kg)(A,A’)，药物有：标准银杏提取物(其中包含银杏总黄酮苷≥24％，银杏内酯≥6％)(10mg/kg(B,B’)，40mg/kg(C,C’))组；银杏双黄酮(10mg/kg)组(D,D’)；银杏内酯(含量≥85％，2.4mg/kg)组(E,E’)；银杏总黄酮苷(含量≥85％，9.6mg/kg)组(F,F’)。每种药物分预防和治疗两种给药方式。离心BLFA后，取上清，使用ELASA试剂盒检测与哮喘相关的炎症因子IL-4、IL-5、IL-13。

对照结果参见附图4，其中，纵坐标为各类炎症因子的浓度，单位pg/ml，横坐标为相应各类实验组。结果显示：银杏双黄酮给药组(DD’)的炎症因子IL-4、IL-5和IL-13水平明显低于银杏中其他活性成分(BB’,CC’,EE’,FF’)的分组，而与地塞米松组(AA’)相当。以哮喘的重要指标肺部炎症因子IL-5为参考，阳性对照组小鼠肺泡灌洗液中IL-5浓度为885.pg/ml，地塞米松组117.5pg/ml，银杏双黄酮给药组127.8pg/ml，银杏内酯组368.7pg/ml，银杏黄酮组491.3pg/ml，银杏提取物低剂量组462.6pg/ml，高剂量给药组421.3pg/ml。银杏双黄酮抑制炎症因子的作用与地塞米松组相当，而且远优于银杏中的其他成分。可见，相比于银杏中的其他活性成分，银杏双黄酮对哮喘具备更好的预防与治疗效果。

实施例4：不同给药剂量的银杏双黄酮对哮喘小鼠炎症因子的影响

本实施例中哮喘小鼠造模与实施例2相同。离心BLFA后，取上清，使用ELASA试剂盒检测与哮喘相关的炎症因子IL-4、IL-5、IL-13。

对照结果如图5所示：其中，纵坐标为肺部炎症因子浓度pg/ml，纵坐标为实验分组。其中共有8个实验组，分别为空白组NC，模型组PC以及双黄酮三种不同浓度给药组剂量分别为10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，预防组记为BG(10)，BG(40)，BG(80)，治疗组记为BG(10)’，BG(40)’，BG(80)’。给药双黄酮后，相比于模型组PC，预防组和治疗组的炎症因子IL-4、IL-5、IL-13均有降低，且与给药剂量具备相关性,无论是预防组还是治疗组，给药双黄酮剂量越大，肺部炎症因子降低越明显。实验证明，给药银杏双黄酮后，肺部炎症因子的表达减少，且给药剂量越大，肺部炎症因子的表达降低越明显，因此双黄酮对哮喘具备预防与治疗的作用。

实施例5：银杏双黄酮对炎症信号通路的影响

哮喘小鼠造模与实施例2相同。离心BLFA后，取沉淀细胞。使用Western-bolt检测几种影响哮喘的炎症通路相关蛋白表达情况，包括PKC，JAK-STAT，PI3K，MAPK(ERK,p38)等相关通路。

对照结果如图6所示：共有五个实验组，分别为空白组NC，模型组PC以及双黄酮三种不同浓度给药组剂量分别为10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，记为BG(10)，BG(40)，BG(80)。其中，Western-bolt检测条带的灰度表明蛋白表达情况，灰度越高，表明蛋白表达越高。给药银杏双黄酮后，PI3K通路相关蛋白条带灰度明显降低，而且给药双黄酮浓度越高，灰度降低越多。因此可以看出，双黄酮对PI3K通路相关蛋白表达具有显著的抑制作用，且与给药剂量成相关性。炎症因子是由肺部炎症细胞分泌产生的，而炎症细胞中的炎症通路的表达会影响炎症细胞分泌炎症因子。在实施例4可以看出，银杏双黄酮会影响炎症因子含量，而本实验提示，银杏双黄酮可能通过影响PI3K通路，而抑制炎症细胞的分泌表达炎症因子，从而降低肺部炎症因子的浓度，对哮喘具备治疗效果。

实施例6：一种含银杏双黄酮的药物组合物对哮喘的预防与治疗作用

一种药物组合物，按照重量份的主要原料为：银杏双黄酮提取物粉末3份、桑白皮3份、甘草1份、苦杏仁3份。过筛，机械混匀后添加超纯水，放置制药混合机中混合。混合后压片，低温干燥即得。

哮喘小鼠造模与实施例2相同。给药剂量为10mg/kg,40m/kg,80mg/kg。混合药物分治疗组与预防组。离心BLFA后，取上清，使用ELASA试剂盒检测与哮喘相关的炎症因子IL-4、IL-5、IL-13。取沉淀细胞用0.5mlPBS重悬，使用血细胞分析仪对细胞进行计数。对照结果如图7所示，共有五个实验组，分别为空白组NC，模型组PC以及含有双黄酮的药物组合的三种不同浓度给药组剂量分别为10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，纵坐标为炎症因子的检测浓度。由图可以明显的看出，给药含双黄酮的组合药物后，炎症因子IL-4、IL-5、IL-13对比未给药的PC组，浓度有明显的下降。而且给药剂量越大，炎症因子的下降越为明显。

由图中的结果显示，给药含双黄酮的组合药物后，预防组和治疗组的炎症细胞与炎症因子均有降低，且有一定量效关系。证明，给药含银杏双黄酮的组合药物后，肺部炎症因子的表达减少，含有银杏双黄酮对哮喘具备预防与治疗的作用。

实施例7：急性毒性试验

以本发明实施例1制得的银杏双黄酮粉末为试验，采用灌胃给药方式，在24h内连续给药2次，每次间隔8h，每次给药500mg/kg药量，每天累积药物总量达1000mg/kg。观察7天，小鼠活动、进食、排泄均正常，生长良好，毛色光亮，其平均体重均随实验时间的延长而增加。第8d处死后解剖每只小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、胃、肠等均未发现颜色及形态异常，未能测出半数致死量(LD50)。结果表明：银杏双黄酮类药物无急性毒性反应。

实施例8：长期毒性试验

以本发明实施例1制得的银杏双黄酮粉末为试验，采用灌胃给药方式，将本发明复合药物分为低剂量、中剂量、高剂量三组，各组的药物用量分别为10、40、80mg/kg/d。灌胃给药24周后，本发明药物对动物的一般状况、血液学指标、血液生化指标均无明显的影响，系统解剖、脏器系数及组织病理学检查也未发现异常病理改变。停药2周也未见明显改变。结果如图7所示：血常规指标中的总白细胞数指标中，银杏双黄酮给药组的总白细胞数稳定，给药24周及停药2周后均无明显的影响。本发明复合药物在长期毒性试验中，未发现明显毒性反应和延迟毒性反应。可见，银杏双黄酮类药物无毒性反应，长期用药安全可靠。

实施例9

将制得的银杏双黄酮与辅料混合，辅料的用量小于等于97.5％，过筛后，按照制备胶囊剂的常规工艺制成胶囊剂，作为防治和预防哮喘的药物和保健品。辅料可以为：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶。

实施例10

将陈皮水提浸膏、柠檬酸与白糖加热煮沸制备成糖浆液，银杏双黄酮用甘油超声溶解，然后与糖浆液合并，加入谷氨酸钠，蒸汽灭菌，制备成口服液，作为预防与治疗哮喘的药物和保健品。

实施例11

将PEG6000加热熔融，用适量无水乙醇加热溶解银杏双黄酮，然后与熔融的PEG6000混合，高温挥去无水乙醇，然后迅速倾倒入板上，制备薄层，低温下冷却固化，干燥后研细，过筛，再加入淀粉、微晶纤维素，糊精制粒，烘干，加入硬脂酸镁，混匀，压片，包衣，即得片剂，作为防治和预防哮喘的药物和保健品。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.银杏双黄酮类化合物在制备预防和治疗哮喘药物或保健品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述银杏双黄酮类化合物为7-去甲基双黄酮、银杏黄素、紫杉双黄酮和异银杏双黄酮中的至少一种。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物或保健品中的银杏双黄酮类化合物用于抑制炎症细胞在肺部募集；

优选地，所述炎症细胞为嗜酸性粒细胞。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物或保健品中的银杏双黄酮类化合物用于抑制炎症因子的表达。

5.一种预防和治疗哮喘的药物组合物，其特征在于，该组合物包含银杏双黄酮类化合物，还包含甘草、桑白皮和苦杏仁中的至少一种；

优选地，所述药物组合物包含1-5份重量份的银杏双黄酮类化合物，还包含1-3份重量份的甘草、1-5份重量份的桑白皮和1-5份重量份的苦杏仁中的至少一种；

优选地，所述药物组合物包含3份重量份的银杏双黄酮类化合物、1份重量份的甘草、3份重量份的桑白皮和3份重量份的苦杏仁。

6.如权利要求书5所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含葶苈子和枇杷叶中的至少一种。

7.一种预防和治疗哮喘的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的银杏双黄酮类化合物和药学上可接受的赋形剂；

优选地，所述赋形剂为淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁和微粉硅胶中的至少一种。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述银杏双黄酮类化合物的质量百分比大于等于2.5％。

9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物剂型为片剂、口服液、颗粒剂、喷雾剂、注射液、粉针剂或胶囊剂。

10.如权利要求7～9任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的银杏双黄酮类化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。