CN109966323A - 一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，所述抗哮喘炎症提取物为紫杉烷类提取物、含总黄酮提取物或含萜类的挥发油，包括：将红豆杉粉经过超临界CO2和有机溶剂萃取，再利用高速逆流色谱仪分离纯化得到紫杉烷类提取物；或将红豆杉粉利用超临界CO2萃取得到含总黄酮提取物；或将红豆杉粉经过醇提后，两次分子蒸馏浓缩得到含萜类的挥发油。得到的紫杉烷类提取物能显著减少哮喘的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，能较好的抑制哮喘炎症，显著地改善哮喘肺功能。得到的含总黄酮提取物和含萜类的挥发油均能显著减少肺组织炎症面积，改善了肺功能，降低了肺阻力，增加了肺顺应性，在治疗哮喘中具有极强的应用前景。

Description

一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法及应用
技术领域
本发明属于药用植物开发领域，具体涉及一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法及应用。
背景技术
红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物的总称。红豆杉的药用价值早在《本草纲目》中就有记载，主要用于治疗霍乱、伤寒及用于排毒。《现代中医大辞典》、《本草推陈》中都有记载，其性味苦、平、有小毒，归心经，功效消肿散结，主治肿瘤、肾病、风湿等，现代中医亦将其用于治疗糖尿病、肾病及妇科疾病等。目前已从红豆杉植物中分离出400多种化合物，主要成分为紫杉烷类和非紫杉烷类两种。紫杉烷类为紫杉烷二萜类化合物，非紫杉烷类化合物主要为三萜、甾体、高萜、黄酮、苯丙素类和酚类等。
现有技术中公开了大量从红豆杉中提取有效成分的方法，如公开号为CN103099826A的专利申请文献公开了一种从南方红豆杉叶中提取紫杉黄酮的方法，通过超临界萃取釜萃取，甲醇吸收，AB-8树脂层析后，再100 目聚酰胺层析，乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥得到含有紫杉黄酮的淡黄色粉末。
公开号为CN104248649A的中国发明专利申请文献公开了一种红豆杉提取物的制备方法，包括：1)准备红豆杉原料；2)超声破壁处理；3)酶解；4)回流提取处理，过滤、浓缩、喷雾干燥，得到的红豆杉提取物含有黄酮、多糖、低聚糖、小分子蛋白、肽、氨基酸等多种具有生物功能的水溶性成分，可以用来制备抗肿瘤、糖尿病、提高免疫力、调节血脂水平、降压、治疗风湿、预防冠心病的药物。
哮喘又名支气管哮喘，支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，此种炎症常伴随引起气道反应性增高，导致反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽等症状，多在夜间和/或凌晨发生，有的患者会由于缺氧而呈现焦躁不安、出汗、精力委靡、表情惨白等症状，严重的还会有性命危险。因此，提取能抑制哮喘炎症从而改善哮喘肺功能的有效成分，在医学领域具有极强的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，操作简单便捷，得到的抗哮喘炎症提取物均具能较好的抑制哮喘炎症，显著地改善哮喘肺功能。
本发明的另一目的在于提供了上述抗哮喘炎症提取物在制备治疗哮喘药物中的应用。
具体的技术方案如下：
一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，所述抗哮喘炎症提取物为紫杉烷类提取物，包括如下步骤：
(1)将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到的红豆杉粉利用超临界CO2萃取，将得到的红豆杉浸膏再经过有机溶剂萃取得红豆杉粗提物；
(2)将红豆杉粗提物制成样品溶液后利用高速逆流色谱仪(HSCCC) 分离纯化，具体条件为：溶剂体系以体积比计量为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙醇：水＝5∶5∶5∶1∶6.5，上相为固定相，下相为流动相，流速2～5 ml/min，转速800～1000r/min，检测波长254nm，收集80～150min的流分得到所述紫杉烷类提取物。
本发明用SFC萃取后，再用二氯甲烷提取，再经过HSCCC，收集所需的馏分制得了紫杉烷类红豆杉提取物，该提取物中主要含有紫杉醇、 10-DAB等具有相同母核的化合物，这类化合物能显著减少白细胞总数和嗜酸性粒细胞的百分比，能较好的抑制哮喘炎症，显著地改善哮喘肺功能。
哮喘属于慢性气道炎症，这个炎症是一种由多种细胞特别是肥大细胞和嗜酸粒细胞参与的慢性气道炎症，嗜酸粒细胞作为气道炎症最主要的标志之一，与哮喘存在直接因果关系。导致哮喘发病的主要原因是嗜酸粒细胞在气道局部的大量聚集，且嗜酸性粒细胞作为哮喘的炎症效应细胞，其数量与哮喘的严重程度密切相关。
步骤(1)中，所述超临界CO2萃取的具体条件为：温度30℃～40℃，萃取压力200～300bar，以乙醇为夹带剂，CO2流速1～5ml/min，静态萃取 0.4～0.8h，动态萃取1.5～2.5h。
所述有机溶剂萃取具体为：将得到的红豆杉浸膏依次经过石油醚/水层和二氯甲烷/水层，将二氯甲烷层收集旋干得红豆杉粗提物。
步骤(2)中，所述样品溶液的制备：将红豆杉粗提物以1：5～15的体积比溶于上相溶液，超声5～20min，过滤即得。
一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，所述抗哮喘炎症提取物为含总黄酮的提取物，包括如下步骤：将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到的红豆杉粉利用超临界CO2萃取，萃取温度60～70℃，分离温度 90～100℃，萃取压力为150～250bar，以甲醇为夹带剂，静态萃取0.4～0.8h，动态萃取1.5～2.5h得到。
上述方法得到的含总黄酮的提取物能显著减少肺组织炎症面积，有效的改善了哮喘肺组织炎症，改善了肺功能，降低了肺阻力，增加了肺顺应性，在治疗哮喘中具有极强的应用前景。
一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，所述抗哮喘炎症提取物为含萜类的挥发油，包括如下步骤：
(1)将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到红豆杉粉经过乙醇浸提，得到红豆杉浸提液；
(2)将得到的红豆杉浸提液利用分子蒸馏进行浓缩，具体条件为：蒸发温度为30～50℃，内冷凝温度-10～-15℃，外冷凝温度-15～-20℃，系统真空度为60～80mbar，转子速度为110～130r/min；
(3)将步骤(2)得到的浓缩液再次利用分子蒸馏进行浓缩得到，蒸发温度为90～100℃，内冷凝温度为5～10℃，转子速度为90～110r/min，得到含萜类的挥发油。
步骤(1)中，所述红豆杉粉经过85～95％乙醇浸提40～50h，重复2～4 次，得到红豆杉浸提液。
上述提取方法制得的含萜类的挥发油同样能显著减少肺组织炎症面积，改善了肺功能，降低肺阻力，增加肺顺应性，可用于治疗哮喘。
本发明还公开了上述方法提取得到的抗哮喘炎症提取物在制备治疗哮喘药物中的应用。其中，所述药物的剂型为口服制剂、雾化剂或滴鼻剂。
本发明还公开了上述方法提取得到的紫杉烷类提取物、含总黄酮的提取物和含萜类的挥发油组成的组合物。
该组合物中包含了三种抗哮喘炎症提取物，在协同作用下能进一步减少哮喘的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，且进一步减少肺组织炎症面积，有效的改善了哮喘肺组织炎症，该组合物在治疗哮喘上疗效显著。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1)本发明通过将超临界CO2萃取工艺与高速逆流色谱法分离工艺联合，对红豆杉进行提取得到得到紫杉烷类红豆杉提取物，该提取工艺简单可控，可将具有相同母核的紫杉烷类化合物聚集在一起，发挥共同的抗哮喘炎症作用。适合大规模生产应用，得到的提取物能显著减少哮喘的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，在制备抗哮喘药物中具有极强的应用价值。
2)本发明将红豆杉原料经超临界CO2萃取得到含黄酮的红豆杉抗炎提取物，仅通过简单的萃取工艺即可得到抗哮喘有效成分，能显著改善哮喘肺组织炎症。
3)本发明将红豆杉原料经乙醇浸提后再用分子蒸馏两次提取即可制得含萜类的挥发油，该有效成分显著减少了肺组织炎症面积，有效的改善了哮喘肺组织炎症。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：红豆杉紫杉烷类抗炎提取物的制备
(1)将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到的红豆杉粉利用超临界CO2萃取，萃取温度35℃，分离温度40℃，压力250bar，以乙醇为夹带剂，流速2ml/min，25min，静态萃取0.5h，动态萃取2h；
(2)将超临界CO2得到的红豆杉浸膏，经过石油醚/水层和二氯甲烷 /水层萃取至水层无颜色，将二氯甲烷层收集旋干，静置，得红豆杉粗提物；
(3)将红豆杉粗提物利用HSCCC分离纯化，溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙醇-水＝5∶5∶5∶1∶6.5，上相为固定相，下相为流动相，将所述红豆杉粗提物以1：10的体积比溶于上相溶液中，超声10min，过滤，即制备得样品溶液，在流速为3ml/min，转速为900r/min，检测波长254nm的工作条件下用HSCCC分离纯化，收集80～150min的流分，得到紫杉烷类红豆杉提取物。
实施例2：含黄酮的红豆杉抗炎提取物的制备
将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到的红豆杉粉利用超临界CO2萃取，萃取温度65℃，分离温度95℃，萃取压力为200bar，以甲醇为夹带剂，静态萃取0.5h，动态萃取2h，得到含总黄酮的红豆杉提取物。
实施例3：含萜类的挥发油的制备：
(1)将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，取得到的红豆杉粉1.4kg，以1:5 的比例加入90％乙醇浸提48h，重复三次，得到浸提液共15.7L；
(2)用分子蒸馏对红豆杉浸提液进行浓缩，回收乙醇，浓缩蒸发温度为40℃，内冷凝温度-10℃～-15℃，外冷凝温度-15℃，系统真空度为 70mbar，转子速度为120r/min，浓缩后共得到3.45L浓缩液；
(3)将浓缩液进一步分子蒸馏，条件为蒸发温度95℃，内冷凝温度 5℃，外冷凝温度-15℃，系统真空度为70mbar，转子速度为100r/min，得到目标产物1.8L，经HPLC等分析为含萜类的挥发油。
药理学实验
将上述实施例1～3分别制得的红豆杉紫杉烷类抗炎提取物、含总黄酮的红豆杉抗炎提取物以及含萜类挥发油分组进行如下实验：
建立SD大鼠哮喘模型：将56只大鼠随机分成7组，分别为正常组、模型组、地塞米松组、红豆杉紫杉烷类有效成分组(A组)、含萜类挥发油的红豆杉有效成分组(B组)、含总黄酮的红豆杉有效成分组(C组) 及紫杉烷类有效成分和萜类挥发油的红豆杉有效成分1:1混合滴鼻同时联合口服总黄酮的红豆杉有效成分(D)组，每组8只。
提取物A、B分别用1％吐温-80及10％乙醇生理盐水配成0.5g/ml溶液，提取物C用10％乙醇配制成0.25mg/ml溶液。在第1天和第8天时，模型组和各给药组腹腔注射1mL 10％OVA致敏液。
大鼠致敏第15天起，地塞米松组、A组、B组滴鼻给予对应药物，给药体积为30μl/孔，60μl/只；C组2.5g/kg灌胃给药；D组滴鼻给予对应药物的同时口服给予总黄酮的红豆杉有效成分组，给药体积为30μl/孔及0.83g/kg。模型组滴鼻给予等体积10％乙醇生理盐水，正常组不做处理。连续给药7天，各组动物给予正常饮食、饮水。
同时，第15天起，模型组及各给药组大鼠于滴鼻15min后，分别将其置于一自制密闭的玻璃容器中，采用超声雾化器雾化激发液，雾粒直径为3-6μm，每天1次，每次30min，连续7天，正常组不做处理。以模型组大鼠出现明显点头样呼吸、呼吸急促、呛咳、行动迟缓、腹肌明显收缩、嘴唇发绀、全身瘙痒，甚至大小便失禁、反应迟钝、俯伏不动等表现为成功的动物模型标志。
1、肺功能检测
末次激发后，于密闭的自制身体容积描记箱内，测肺功能，计算气道阻力(RL)和肺顺应性(Cdyn)。RL以单位时间流量所需的压差来表示 cmH2O/ml.s；Cdyn的单位以ml/cm H2O来表示。
2、支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞分类计数
收集BALF，用血细胞计数板在显微镜下计数有核细胞总数。
制作涂片，行瑞士—吉姆萨染色后，于显微镜下行细胞分类计数。每个标本计数200个白细胞，并分别计数其中嗜酸性粒细胞(Eosinophils)、中性粒细胞(Neutrophils)、淋巴细胞(Lymphocytes)和巨噬细胞(Macrophages)，得各种类型细胞的百分比，计算得绝对值。
3、HE染色观察肺组织炎症面积
收集BALF前，先结扎取左肺组织，切片后做HE染色，在显微镜(40X) 下观察肺组织病理学改变。
运用NIS-Elements D 3.2软件手动积分测量所有视野下肺组织切片总面积及炎症面积，累积各个视野下总面积，并计算炎症累积面积所占总面积的百分比，炎症面积所占百分比＝炎症累积面积/总面积*100％。
4、统计学方法
所有数据以均数±标准差表示，数据运用SPSS 20.0统计软件处理，多样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为有统计学意义。
5、结果
5.1红豆杉不同提取物对哮喘大鼠肺功能的影响
与正常对照组比较，模型对照组大鼠Cdyn明显降低，RL明显升高 (P<0.01)；与模型对照组比较，A、B、C、D均能提高大鼠Cdyn水平，降低RL水平，具体结果见下表1。
表1红豆杉不同提取物对哮喘大鼠肺功能的影响
注：与正常对照组比较，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
5.2红豆杉不同提取物对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的影响
与正常对照组比较，模型对照组嗜酸性粒细胞及中性粒细胞百分比明显增加(P<0.01)；与模型对照组比较，A组能够明显降低嗜酸性粒细胞及中性粒细胞百分比(P<0.01)，具体结果下见表2。
表2红豆杉不同提取物对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的影响
注：与正常对照组比较，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
5.3HE染色观察肺组织炎症面积
与模型对照组比较，B、C组肺组织炎症有所改善(P<0.05)，具体结果见下表4。
表4肺组织炎症面积
注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

Claims (10)

1.一种从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，所述抗哮喘炎症提取物为紫杉烷类提取物，包括如下步骤：
(1)将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到的红豆杉粉利用超临界CO2萃取，将得到的红豆杉浸膏再经过有机溶剂萃取得红豆杉粗提物；
(2)将红豆杉粗提物制成样品溶液后利用高速逆流色谱仪分离纯化，具体条件为：溶剂体系以体积比计量为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：乙醇：水＝5∶5∶5∶1∶6.5，上相为固定相，下相为流动相，流速2～5ml/min，转速800～1000r/min，检测波长254nm，收集80～150min的流分得到所述紫杉烷类提取物。
2.根据权利要求1所述的从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超临界CO2萃取的具体条件为：温度30℃～40℃，萃取压力200～300bar，以乙醇为夹带剂，CO2流速1～5ml/min，静态萃取0.4～0.8h，动态萃取1.5～2.5h。
3.根据权利要求1所述的从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂萃取具体为：将得到的红豆杉浸膏依次经过石油醚/水层和二氯甲烷/水层，将二氯甲烷层收集旋干得红豆杉粗提物。
4.根据权利要求1所述的从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样品溶液的制备：将红豆杉粗提物以1：5～15的体积比溶于上相溶液，超声5～20min，过滤即得。
5.根据权利要求1所述的从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，所述抗哮喘炎症提取物为含总黄酮的提取物，包括如下步骤：将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到的红豆杉粉利用超临界CO2萃取，萃取温度60～70℃，分离温度90～100℃，萃取压力为150～250bar，以甲醇为夹带剂，静态萃取0.4～0.8h，动态萃取1.5～2.5h得到。
6.根据权利要求1所述的从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，所述抗哮喘炎症提取物为含萜类的挥发油，包括如下步骤：
(1)将红豆杉枝叶粉碎后，过筛，将得到红豆杉粉经过乙醇浸提，得到红豆杉浸提液；
(2)将得到的红豆杉浸提液利用分子蒸馏进行浓缩，具体条件为：蒸发温度为30～50℃，内冷凝温度-10～-15℃，外冷凝温度-15～-20℃，系统真空度为60～80mbar，转子速度为110～130r/min；
(3)将步骤(2)得到的浓缩液再次利用分子蒸馏进行浓缩，蒸发温度为90～100℃，内冷凝温度为5～10℃，转子速度为90～110r/min，得到含萜类的挥发油。
7.根据权利要求6所述的从红豆杉中提取抗哮喘炎症提取物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述红豆杉粉经过85～95％乙醇浸提40～50h，重复2～4次，得到红豆杉浸提液。
8.根据权利要求1～7任一项所述方法提取得到的抗哮喘炎症提取物在制备治疗哮喘药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂、雾化剂或滴鼻剂。
10.一种组合物，其特征在于，由权利要求1、5、6所述的方法制得的紫杉烷类提取物、含总黄酮的提取物和含萜类的挥发油组成。
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