CN107936579A - 一种双网络水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种双网络水凝胶的制备方法,包括以下步骤:将鱼源胶原蛋白冻干海绵用0.5%‑1%醋酸溶液溶解,得到鱼源胶原蛋白原溶液;将所述鱼源胶原蛋白原溶液与0.01‑0.02mol/L的磷酸缓冲盐溶液等体积混合,得到鱼源胶原蛋白初溶液;将所述鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5%‑10%的聚乙烯醇水溶液混合,得到混合溶液;调节所述混合溶液的pH至6.8‑7.8;在25‑30℃条件下静置8‑24h,使鱼源胶原蛋白自组装成单网络水凝胶,接着,将所述单网络水凝胶置于‑20℃条件下冷冻8‑12h,然后置于25‑30℃条件下融化,重复冷冻‑解冻过程至少3次,得到所述双网络水凝胶。上述双网络水凝胶的制备方法,通过鱼源胶原蛋白与PVA双物理交联,不需要添加交联剂,即可制备得到性能优异的双网络水凝胶,不具有毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,尤其涉及一种双网络水凝胶的制备方法。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是人体的一种非常重要的蛋白质,主要存在于结缔组织中。它具有很强的伸张能力,是韧带和肌键的主要成份,胶原蛋白还是细胞外基质的主要组成成分。它使皮肤保持弹性,而胶原蛋白的老化,则使皮肤出现皱纹。胶原蛋白亦是眼睛角膜的主要成份,但以结晶形式组成。胶原蛋白可以用于制备胶原蛋白水凝胶,而纯胶原蛋白水凝胶的力学性能差,降解快,需要改善其性能。聚乙烯醇(PVA)是一种安全无毒的高分子材料,具有较好的成膜性,制备成PVA水凝胶后,力学性能优异,用于体内药物载体时,不经过降解和吸收可以直接排出体外。用作体外医药用材料时,PVA可以经生物降解。
而传统的双网络水凝胶的制备方法通常要使用化学合成类交联剂,而这类交联剂本身具有相对较高的细胞毒性,导致该水凝胶在接触人体后,影响组织的正常生长。
发明内容
鉴于此,有必要提供一种不需要使用交联剂,没有毒性的双网络水凝胶的制备方法。
一种双网络水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
将鱼源胶原蛋白冻干海绵用0.5%-1%醋酸溶液溶解,得到鱼源胶原蛋白原溶液;
将所述鱼源胶原蛋白原溶液与0.01-0.02mol/L的磷酸缓冲盐溶液等体积混合,得到鱼源胶原蛋白初溶液;
将所述鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5%-10%的聚乙烯醇水溶液混合,得到混合溶液;
调节所述混合溶液的pH至6.8-7.8;
在25-30℃条件下静置8-24h,使鱼源胶原蛋白自组装成单网络水凝胶,接着,将所述单网络水凝胶置于-20℃条件下冷冻8-12h,然后置于25-30℃条件下融化,重复冷冻-解冻过程至少3次,得到所述双网络水凝胶。
在其中一个实施例中,所述鱼源胶原蛋白冻干海绵采用如下方法制备:
将鱼皮脱脂后冲洗干净,在NaOH水溶液中浸泡除去非胶原成分,然后水洗至中性,接着,加入醋酸溶液和胃蛋白酶,于4-8℃搅拌提取48-72h,离心后,上清液即为酶促溶性胶原蛋白,接着往所述上清液中加入NaCl至1.5-2.4M,离心,收集沉淀,将所述沉淀溶于0.1-0.5mol/L醋酸溶液中,用Na2HPO4溶液透析24h后,再用0.05-0.1mol/L醋酸溶液透析1-2d,再用水透析1-2d,得到酶溶性胶原蛋白溶液,将所述酶溶性胶原蛋白溶液冷冻干燥,得到所述鱼源胶原蛋白冻干海绵。
在其中一个实施例中,所述鱼皮为罗非鱼鱼皮。
在其中一个实施例中,将鱼皮脱脂的操作为将所述鱼皮置于体积分数为10%-15%的正丁醇溶液中浸泡24h-36h进行脱脂,且体积分数为10%-15%的正丁醇溶液每隔8-12h更换一次。
在其中一个实施例中,NaOH水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L,在NaOH水溶液中浸泡的时间为24-36h,且NaOH水溶液每隔8-12h更换一次。
在其中一个实施例中,所述质量百分数为5%-10%的聚乙烯醇水溶液采用如下方法制备:按照质量体积比为5-10g:100mL的比例,将聚乙烯醇加入水中,加热使其充分溶解,得到所述质量百分数为5%-10%的聚乙烯醇水溶液。
在其中一个实施例中,将聚乙烯醇加入水中,加热使其充分溶解的操作为:将加入了聚乙烯醇的水溶液置于60-80℃溶胀2h,接着在90-100℃使其充分溶解。
在其中一个实施例中,所述鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5-10%的聚乙烯醇水溶液的体积比为90-60:10-40。
在其中一个实施例中,所述调节所述混合溶液的pH至6.8-7.8的操作中,采用盐酸和氢氧化钠调节所述混合溶液的pH。
上述双网络水凝胶的制备方法,鱼源胶原蛋白通过在30℃条件下静置自组装成单网络水凝胶,再通过冷冻使PVA分子链之间彼此接触并以范德华力和氢键紧密结合形成物理交联点,解冻后,分子链之间位置重新变换,再次冷冻时又形成新的物理交联点,如此冷冻-解冻重复几次,从而使PVA形成二重网络,因此,上述双网络水凝胶的制备方法,通过鱼源胶原蛋白与PVA双物理交联,不需要添加交联剂,即可制备得到性能优异的双网络水凝胶,不具有毒性。
附图说明
图1为一实施方式的双网络水凝胶的制备方法的流程图。
图2为鱼源胶原蛋白初溶液和PVA水溶液的不同体积比制备得到的双网络水凝胶的降解性能图。
图3为鱼源胶原蛋白初溶液和PVA水溶液的不同体积比制备得到的双网络水凝胶的力学性能图。
图4为鱼源胶原蛋白单网络水凝胶的电镜图和采用双网络水凝胶的制备方法制备得到的双网络水凝胶的电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
如图1所示,一实施方式的双网络水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
S10、将鱼源胶原蛋白冻干海绵用0.5%-1%醋酸溶液溶解,得到鱼源胶原蛋白原溶液。
鱼源胶原蛋白冻干海绵采用如下方法制备:
将鱼皮脱脂后冲洗干净,在NaOH水溶液中浸泡除去非胶原成分,然后水洗至中性,接着,加入醋酸溶液和胃蛋白酶,于4℃-8℃搅拌提取48-72h,离心后,上清液即为酶促溶性胶原蛋白,接着往上清液中加入NaCl至1.5-2.4M,离心,收集沉淀,将沉淀溶于0.1-0.5mol/L醋酸溶液中,用Na2HPO4溶液透析24h后再用0.05-0.1mol/L醋酸溶液透析1-2d,再用水透析1-2d,得到酶溶性胶原蛋白溶液,将酶溶性胶原蛋白溶液冷冻干燥,得到鱼源胶原蛋白冻干海绵。
其中,鱼皮可以为罗非鱼鱼皮。
在一个实施例中,将鱼皮脱脂的操作为将鱼皮置于体积分数为10%-15%的正丁醇溶液中浸泡24h-36h进行脱脂,且体积分数为10%-15%的正丁醇溶液每隔8-12h更换一次。
在一个实施例中,NaOH水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L,在NaOH水溶液中浸泡的时间为24-36h,且NaOH水溶液每隔8-12h更换一次。
在一个实施例中,加入醋酸溶液和胃蛋白酶,于4-8℃搅拌提取48-72h的操作中,醋酸溶液的浓度可以为0.1-0.5mol/L,胃蛋白酶的质量分数可以为2‰-4‰(w/v)。
在一个实施例中,离心的速度可以为8000-15000r/min,离心的时间可以为5-10min。
在一个实施例中,往上清液中加入NaCl的操作中,加入NaCl直至NaCl的终浓度为1.5-2.4mol/L。
在一个实施例中,Na2HPO4溶液的浓度可以为0.01-0.02-mol/L,pH可以为8.4-8.6。
在一个实施例中,冷冻干燥的温度可以为-60℃——-80℃。
S10中,制备得到的鱼源胶原蛋白原溶液的浓度可以为6-10mg/mL。
S20、将鱼源胶原蛋白原溶液与0.01-0.02mol/L的磷酸缓冲盐溶液等体积混合,得到鱼源胶原蛋白初溶液。
S30、将鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5%-10%的PVA水溶液混合,得到混合溶液。
在一个实施例中,质量百分数为5%-10%的PVA水溶液采用如下方法制备:按照质量体积比为5-10g:100mL的比例,将PVA加入水中,加热使其充分溶解,得到质量百分数为5%-10%的PVA水溶液。
进一步的,将PVA加入水中,加热使其充分溶解的操作为:将加入了PVA的水溶液置于60-80℃溶胀2h,接着在90-100℃使其充分溶解。
鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5-10%的聚乙烯醇水溶液的体积比可以为90-60:10-40。
S40、调节混合溶液的pH至6.8-7.8。
S40中,可以采用盐酸和氢氧化钠调节混合溶液的pH。
S50、在25-30℃条件下静置8-24h,使鱼源胶原蛋白自组装成单网络水凝胶,接着,将单网络水凝胶置于-20℃条件下冷冻8-12h,然后置于25-30℃条件下融化,重复冷冻-解冻过程至少3次,得到双网络水凝胶。
上述双网络水凝胶的制备方法,鱼源胶原蛋白通过在30℃条件下静置自组装成单网络水凝胶,再通过冷冻使PVA分子链之间彼此接触并以范德华力和氢键紧密结合形成物理交联点,解冻后,分子链之间位置重新变换,再次冷冻时又形成新的物理交联点,如此冷冻-解冻重复几次,从而使PVA形成二重网络,因此,上述双网络水凝胶的制备方法,通过鱼源胶原蛋白与PVA双物理交联,不需要添加交联剂,即可制备得到性能优异的双网络水凝胶,不具有毒性。
上述双网络水凝胶的制备方法,通过使用不同体积比的鱼源胶原蛋白初溶液与PVA水溶液制备双网络水凝胶,可以提高双网络水凝胶的降解可控性。如图2所示,不同配比的双网络水凝胶均比纯胶原蛋白水凝胶难以降解,随着PVA水溶液所占比例增加,制备得到的双网络水凝胶的越难降解。还可以提高胶原蛋白水凝胶的力学性能,如图3所示,不同配比的双网络水凝胶均比纯胶原蛋白水凝胶力学性质佳,且随着PVA水溶液所占比例升高,应力增大。上述双网络水凝胶的制备方法,只需要将鱼源胶原蛋白与PVA水溶液配好后,放置在不同的温度下,等待形成双网络水凝胶即可,节约了成本,经济高效。
经过物理化学性能测试实验,在应变为40%时,相对于纯胶原蛋白水凝胶应力为4.2KPa,而在PVA/Col双网络水凝胶力学性质可以达到32KPa。随着环境的选择和PVA/Col的配比的改变,可以实现降解速率的可控性。请参考图4,其中图A、图B和图C分别为放大不同倍数的鱼源胶原蛋白单网络水凝胶的电镜图片;图D、图E和图F分别为放大不同倍数的PVA/鱼源胶原蛋白双网络水凝胶的电镜图片。可以看出,鱼源胶原蛋白单网络水凝胶为稀疏膜片状,PVA/鱼源胶原蛋白双网络水凝胶为坚实骨架状。
下面为具体实施例部分。
实施例1
取15g罗非鱼鱼皮,用体积分数为12%正丁醇溶液脱脂24-36h,其中,罗非鱼鱼皮和正丁醇溶液的质量体积比为1:25,正丁醇溶液每8h更换一次。再采用蒸馏水冲洗后用浓度为0.1mol/L的NaOH水溶液中浸泡24h,以除去非胶原成分,其中,罗非鱼鱼皮和NaOH水溶液的质量体积比为1:25,NaOH水溶液每10h更换一次。接着水洗至中性。然后向得到的鱼皮中,加入0.4mol/L醋酸溶液,其中,罗非鱼鱼皮和醋酸溶液的质量体积比为1:45,4℃磁力搅拌提取48h,10000r/min离心8min。得到的上清液加入3‰(w/v)的胃蛋白酶,酶溶,得到的溶液即为酶促溶性胶原蛋白(Pepsin-soluble collagen,PSC)。在上清液中加入NaCl,至NaCl最终浓度为1.5mol/L,离心,收集沉淀。将所有沉淀重新溶解于0.3mol/L醋酸溶液中,用0.02mol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析30h后,用0.1mol/L醋酸溶液透析30h,再用蒸馏水透析40h,即可得到酶溶性胶原蛋白溶液。将上述蛋白溶液在-70℃冷冻干燥呈海绵状鱼源胶原蛋白。
取0.8g鱼源胶原蛋白冻干海绵溶于10mL 0.4mol/L的醋酸溶液中制备成8mg/mL的胶原蛋白原溶液。配制pH=7.4的0.01mol/L的PBS缓冲液。取PVA3g,溶于100mL去离子水中,然后先在60℃溶胀2h,接着在90℃使其充分溶解,制备得到质量百分数为3%的PVA溶液。
取10mL的浓度为10mg/mL的胶原蛋白原溶液,加入10mL 0.01M PBS混合均匀,得到浓度为5mg/mL的胶原蛋白初溶液。按照胶原蛋白Col:PVA=80:20的体积比例混合胶原蛋白初溶液和PVA溶液,搅拌3h,得到混合溶液。将上述混合溶液搅拌均匀后,使用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH至7.0,26℃水浴静置20小时使鱼胶胶原蛋白自组装生成单网络水凝胶。之后,将单网络水凝胶置于-20℃冰箱中冷冻10h,然后在25℃融化,如此重复上述冷冻-解冻过程4次,得到双网络水凝胶。该双网络水凝胶保水率高,降解可控,网络孔隙率高,孔径大小均一。
实施例2
取15g罗非鱼鱼皮用体积分数为10%正丁醇溶液脱脂24h,其中,罗非鱼鱼皮和正丁醇溶液的质量体积比为1:20,正丁醇溶液每8h更换一次。再采用蒸馏水冲洗后用浓度为0.1mol/L的NaOH水溶液中浸泡24h,以除去非胶原成分,其中,罗非鱼鱼皮和NaOH水溶液的质量体积比为1:20,NaOH水溶液每8h更换一次。接着水洗至中性。然后加入0.3mol/L醋酸溶液和2‰的胃蛋白酶,其中,罗非鱼鱼皮和醋酸溶液的质量体积比为1:40,4℃磁力搅拌提取48h,10000r/min离心5min,上清液即为酶促溶性胶原蛋白(Pepsin-soluble collagen,PSC)。在上清液中加入NaCl,至NaCl最终浓度为2.0mol/L,离心,收集沉淀溶于0.1mol/L醋酸溶液中,用0.02mol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析24h后离心收集沉淀,重新溶解于0.1mol/L醋酸溶液中,用0.1mol/L醋酸溶液透析24h,再用蒸馏水透析36h,即可得到酶溶性胶原蛋白溶液。将上述蛋白溶液在-80℃冷冻干燥呈海绵状鱼源胶原蛋白。
取0.6g鱼源胶原蛋白冻干海绵溶于10mL 0.1mol/L的醋酸溶液中制备成6mg/mL的胶原蛋白原溶液。配制pH=7.4的0.01mol/L的PBS缓冲液。取PVA1g,溶于100mL去离子水中,然后先在60℃溶胀2h,接着在80℃使其充分溶解,制备得到质量百分数为1%的PVA溶液。
取10mL的浓度为8mg/mL的胶原蛋白原溶液,加入等量PBS混合均匀,得到浓度为4mg/mL的胶原蛋白初溶液。按照Col:PVA=90:10的体积比例混合胶原蛋白初溶液和PVA溶液,得到混合溶液。将上述混合溶液搅拌均匀后,使用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH至6.8,25℃水浴静置6小时使鱼胶胶原蛋白自组装生成单网络水凝胶。之后,将单网络水凝胶置于-20℃冰箱中冷冻6h,然后在25℃融化,如此重复上述冷冻-解冻过程3次,得到双网络水凝胶。该双网络水凝胶保水率高,降解可控,网络孔隙率高,孔径大小均一。
实施例3
取15g罗非鱼鱼皮用体积分数为15%正丁醇溶液脱脂36h,其中,罗非鱼鱼皮和正丁醇溶液的质量体积比为1:30,正丁醇溶液每8h更换一次。再采用蒸馏水冲洗后用浓度为0.1mol/L的NaOH水溶液中浸泡24h,以除去非胶原成分,其中,罗非鱼鱼皮和NaOH水溶液的质量体积比为1:30,NaOH水溶液每12h更换一次。接着水洗至中性。然后加入0.5mol/L醋酸溶液和4‰(w/v)的胃蛋白酶,其中,罗非鱼鱼皮和醋酸溶液的质量体积比为1:50,8℃磁力搅拌提取48h,10000r/min离心10min,上清液即为酶促溶性胶原蛋白(Pepsin-solublecollagen,PSC)。在上清液中加入NaCl,至NaCl最终浓度为1.8mol/L,离心,收集沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液中,用0.02mol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析36h后离心收集沉淀,重新溶解于0.5mol/L醋酸溶液中,用0.1mol/L醋酸溶液透析36h,再用蒸馏水透析48h,即可得到酶溶性胶原蛋白溶液。将上述蛋白溶液在-60℃冷冻干燥呈海绵状鱼源胶原蛋白。
取1.2g鱼源胶原蛋白冻干海绵溶于10mL 0.5mol/L的醋酸溶液中制备成12mg/mL的胶原蛋白原溶液。配制pH=7.4的0.01mol/L的PBS缓冲液。取PVA 5g,溶于100mL去离子水中,然后先在70℃溶胀2h,接着在90℃使其充分溶解,制备得到质量百分数为5%的PVA溶液。
取10mL的浓度为16mg/mL的胶原蛋白原溶液,加入等量PBS混合均匀,得到浓度为8mg/mL的胶原蛋白初溶液。按照Col:PVA=50:50的体积比例混合胶原蛋白初溶液和PVA溶液,搅拌得到混合溶液。将上述混合溶液搅拌均匀后,使用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH至7.4,30℃水浴静置24小时使鱼胶胶原蛋白自组装生成单网络水凝胶。之后,将单网络水凝胶置于-20℃冰箱中冷冻12h,然后在30℃融化,如此重复上述冷冻-解冻过程5次,得到双网络水凝胶。该双网络水凝胶保水率高,降解可控,网络孔隙率高,孔径大小均一。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将鱼源胶原蛋白冻干海绵用0.5%-1%醋酸溶液溶解,得到鱼源胶原蛋白原溶液;
将所述鱼源胶原蛋白原溶液与0.01-0.02mol/L的磷酸缓冲盐溶液等体积混合,得到鱼源胶原蛋白初溶液;
将所述鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5%-10%的聚乙烯醇水溶液混合,得到混合溶液;
调节所述混合溶液的pH至6.8-7.8;
在25-30℃条件下静置8-24h,使鱼源胶原蛋白自组装成单网络水凝胶,接着,将所述单网络水凝胶置于-20℃条件下冷冻8-12h,然后置于25-30℃条件下融化,重复冷冻-解冻过程至少3次,得到所述双网络水凝胶。
2.如权利要求1所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,所述鱼源胶原蛋白冻干海绵采用如下方法制备:
将鱼皮脱脂后冲洗干净,在NaOH水溶液中浸泡除去非胶原成分,然后水洗至中性,接着,加入醋酸溶液和胃蛋白酶,于4-8℃搅拌提取48-72h,离心后,上清液即为酶促溶性胶原蛋白,接着往所述上清液中加入NaCl至1.5-2.4M,离心,收集沉淀,将所述沉淀溶于0.1-0.5mol/L醋酸溶液中,用Na2HPO4溶液透析24h后,再用0.05-0.1mol/L醋酸溶液透析1-2d,再用水透析1-2d,得到酶溶性胶原蛋白溶液,将所述酶溶性胶原蛋白溶液冷冻干燥,得到所述鱼源胶原蛋白冻干海绵。
3.如权利要求2所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,所述鱼皮为罗非鱼鱼皮。
4.如权利要求2所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,将鱼皮脱脂的操作为将所述鱼皮置于体积分数为10%-15%的正丁醇溶液中浸泡24h-36h进行脱脂,且体积分数为10%-15%的正丁醇溶液每隔8-12h更换一次。
5.如权利要求2所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,NaOH水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L,在NaOH水溶液中浸泡的时间为24-36h,且NaOH水溶液每隔8-12h更换一次。
6.如权利要求1所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,所述质量百分数为5%-10%的聚乙烯醇水溶液采用如下方法制备:按照质量体积比为5-10g:100mL的比例,将聚乙烯醇加入水中,加热使其充分溶解,得到所述质量百分数为5%-10%的聚乙烯醇水溶液。
7.如权利要求6所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,将聚乙烯醇加入水中,加热使其充分溶解的操作为:将加入了聚乙烯醇的水溶液置于60-80℃溶胀2h,接着在90-100℃使其充分溶解。
8.如权利要求1所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,所述鱼源胶原蛋白初溶液与质量百分数为5-10%的聚乙烯醇水溶液的体积比为90-60:10-40。
9.如权利要求1所述的双网络水凝胶的制备方法,其特征在于,所述调节所述混合溶液的pH至6.8-7.8的操作中,采用盐酸和氢氧化钠调节所述混合溶液的pH。
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