CN109535448B - 一种载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，包括：分别制备胶原蛋白溶液、PVA水溶液和藻胆蛋白溶液，然后将胶原蛋白溶液、PVA水溶液和藻胆蛋白溶液按照体积比(4～6):(2～4):2进行混合得到混合液；搅拌后进行离心除去气泡得到离心液；采用氢氧化钠和盐酸调节所述离心液pH至6.8～7.4后转移至模具中，在25～35℃温度下进行水浴处理；静置8‑16小时后得到水凝胶，将所述水凝胶置于‑20℃温度下冷冻4‑8h，然后在25℃温度下融化，反复上述冷冻‑融化过程3～7次，获得载有藻胆蛋白的双网络水凝胶。上述制备方法得到的双网络水凝胶性能稳定，且成本低，环境友好。

Description

一种载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法。
背景技术
鱼源胶原蛋白在pH＝7.0左右时会产生自组装效应。自组装(self-assemble)是天然胶原的重要分子行为特征，即具有完整三螺旋结构的胶原分子单体可以通过分子间的有序排列，形成具有交错条纹结构(D周期)的胶原纤维(赵燕,鲁亮,杨玲,等.草鱼皮胶原的体外自组装动力学研究[J].食品科学,2014,35(11):21-26.)。借助此性能，可以制备胶原蛋白水凝胶(中国科学院烟台海岸带研究所，一种水产鱼皮胶原蛋白水凝胶的制备方法)。纯胶原蛋白制备水凝胶，力学性能差，降解快，需要改善其性能。
科学研究表明，藻胆蛋白是一种既可以作为天然色素用于食品、化妆品、染料等工业上，也可制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中。另外，还可以制成食品和药品用于医疗保健上，应用范围广阔，具有很高的开发、利用价值。但藻胆蛋白对于光、热、酸等条件下性质不够稳定，经常会出现变性等现象。传统的保存方法需要低温避光等条件，大大限制了藻胆蛋白的应用。
传统水凝胶包载药物或生物大分子(如藻胆蛋白)，多使用化学合成类交联剂，而这类交联剂本身具有相对较高的细胞毒性，导致该水凝胶在接触人体后，影响组织的正常生长。利用物理交联法制备的水凝胶一般力学性能差，性质不稳定。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种性能稳定且无毒性的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
一种载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，包括：
采用0.01～0.5M醋酸将鱼源胶原蛋白冻干海绵溶解，获得1～12mg/mL的胶原蛋白溶液，并采用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH至4.5～6；
将聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,vinylalcohol polymer,PVA)溶解在在去离子水，获得质量体积百分比为0.5～5％的PVA水溶液；
将藻胆蛋白粉末溶于0.01～0.02M的PBS缓冲液中，配置成浓度为0.1～2mg/mL的藻胆蛋白溶液；
将所述胶原蛋白溶液、PVA水溶液和藻胆蛋白溶液按照体积比(4～6):(2～4):2进行混合得到混合液；
搅拌后进行离心除去气泡得到离心液；
采用氢氧化钠和盐酸调节所述离心液pH至6.8～7.4后转移至模具中，在25～35℃温度下进行水浴处理；
静置8-16小时后得到水凝胶，将所述水凝胶置于-20℃温度下冷冻4-8h，然后在25℃温度下融化，反复上述冷冻-融化过程3～7次，获得载有藻胆蛋白的双网络水凝胶。
在其中一个实施例中，所述搅拌后进行离心除去气泡得到离心液为：将所述混合液充分搅拌20～60min后，在500～4000rpm 4℃离心1～5min以除去气泡得到离心液。
在其中一个实施例中，所述氢氧化钠和盐酸的浓度均为0.1～1M。
在其中一个实施例中，所述藻胆蛋白为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白、别藻蓝蛋白或藻胆素。
在其中一个实施例中，所述鱼源胶原蛋白冻干海绵的制备方法包括：
将鱼皮脱脂后冲洗干净，在NaOH水溶液中浸泡除去非胶原成分，然后水洗至中性；
加入醋酸溶液溶解后离心取上清液，加入胃蛋白酶，于4℃～8℃搅拌，然后加入0.9M NaCl，静置，收集沉淀，将沉淀溶于醋酸溶液中；
采用Na2HPO4溶液透析后再分别用醋酸溶液、水透析，得到酶溶性胶原蛋白溶液，将酶溶性胶原蛋白溶液冷冻干燥，得到鱼源胶原蛋白冻干海绵。
在其中一个实施例中，所述鱼皮为罗非鱼鱼皮、狭鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼或三文鱼鱼皮。
在其中一个实施例中，所述鱼皮脱脂为：配制体积分数为10％～15％的正丁醇溶液，按照鱼皮：正丁醇溶液的质量体积比为1:30，加入适量正丁醇溶液浸泡24h～36h进行脱脂，每隔8～12h更换一次。
在其中一个实施例中，所述除去非胶原成分为：配制浓度为0.05～0.1mol/L的NaOH水溶液，将所述脱脂后的鱼皮在NaOH水溶液中浸泡24～36h，且所述NaOH水溶液每隔8～12h更换一次。
在其中一个实施例中，所述胃蛋白酶的质量体积百分比为1～4‰。
在其中一个实施例中，所述冷冻干燥温度为-60℃～-80℃。
在上述载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法中，只需要将胶原蛋白、PVA和PC混合溶液配好后，放置在特定环境中形成载有藻蓝蛋白的双网络水凝胶即可。制备过程简单，未添加化学交联剂，也未产生有毒物质，从而安全无毒，本方制备的藻蓝蛋白双网络水凝胶，胶原蛋白可较容易的从多种动物组织中获得，聚乙烯醇也是非常经济的一种高分子聚合物，无需昂贵的生化试剂，降低了成本。由于天然提取的纯藻蓝蛋白在光热条件下容易分解，从而失去营养价值。本方法在保留藻蓝蛋白本身性质稳定的同时，让藻蓝蛋白通过一种稳定的水凝胶的形式，使其广泛应用成为可能。
附图说明
图1为一实施方式的双网络水凝胶抗氧化活性失活测试结果示意图，图中(A)、(B)、(C)、(D)分别为Col:PVA:PC＝6:2:2，5:3:2，4:4:2和0:0:10(空白对照)样品。
图2中为一实施方的双网络水凝胶的电镜图，其中(A)、(B)、(C)分别表示Col:PVA:PC＝6:2:2，5:3:2，4:4:2样品放大200倍电镜观察图，(a)、(b)、(c)分别表示Col:PVA:PC＝6:2:2，5:3:2，4:4:2样品放大100倍的电镜观察图。
具体实施方式
请参阅图1，本发明提供的一实施方式的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，包括：
S110、采用0.01～0.5M醋酸将鱼源胶原蛋白冻干海绵溶解，获得1～12mg/mL的胶原蛋白溶液，并采用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH至4.5～6；
在一实施方式中，所述鱼源胶原蛋白冻干海绵的制备方法包括：
将鱼皮脱脂后冲洗干净，在NaOH水溶液中浸泡除去非胶原成分，然后水洗至中性；
加入醋酸溶液溶解后离心取上清液，加入胃蛋白酶，于4℃～8℃搅拌，然后加入0.9M NaCl，静置，收集沉淀，将沉淀溶于醋酸溶液中；
采用Na2HPO4溶液透析后再分别用醋酸溶液、水透析，得到酶溶性胶原蛋白溶液，将酶溶性胶原蛋白溶液冷冻干燥，得到鱼源胶原蛋白冻干海绵。
在一实施方式中，具体地，所述鱼皮为罗非鱼鱼皮、狭鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼或三文鱼鱼皮。
在一实施方式中，具体地，所述鱼皮脱脂为：配制体积分数为10％～15％的正丁醇溶液，按照鱼皮：正丁醇溶液的质量体积比为1:30，加入适量正丁醇溶液浸泡24h～36h进行脱脂，每隔8～12h更换一次。
在一实施方式中，具体地，所述除去非胶原成分为：配制浓度为0.05～0.1mol/L的NaOH水溶液，将所述脱脂后的鱼皮在NaOH水溶液中浸泡24～36h，且所述NaOH水溶液每隔8～12h更换一次。
在一实施方式中，具体地，除去非胶原成分后，取酸溶后的溶液以12000-15000r/min速度离心1-10min取上清液，加入质量分数为1-4‰(w/v)的胃蛋白酶。取酶溶后的溶液，加入0.9M的NaCl，静置沉淀24-48h。取盐析沉淀，按照鱼皮：溶液料液比1:20-30，加入0.05-0.1mol/L醋酸溶液复溶。装入透析袋依次用0.01M的醋酸溶液、0.02M的Na2HPO4溶液和去离子水各透析24-36h，每8-12h换液一次，得到酶溶性胶原蛋白溶液，将酶溶性胶原蛋白溶液在-60℃～-80℃温度下冷冻干燥，得到鱼源胶原蛋白冻干海绵。
S120、将PVA溶解在在去离子水，获得质量体积百分比为0.5～5％的PVA水溶液；
S130、将藻胆蛋白粉末溶于0.01～0.02M的PBS缓冲液中，配置成浓度为0.1～2mg/mL的藻胆蛋白溶液；
在一实施方式中，藻胆蛋白可以为藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、藻蓝蛋白(phyeocyanin，PC)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，PEC)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)和藻胆素(phycobilin，PB)等。
S140、将所述胶原蛋白溶液、PVA水溶液和藻胆蛋白溶液按照体积比(4～6):(2～4):2进行混合得到混合液；
S150、搅拌后进行离心除去气泡得到离心液；
在一实施方式中，所述搅拌后进行离心除去气泡得到离心液为：将所述混合液充分搅拌20～60min后，在500～4000rpm 4℃离心1～5min以除去气泡得到离心液。
S160、采用氢氧化钠和盐酸调节所述离心液pH至6.8～7.4后转移至模具中，在25～35℃温度下进行水浴处理；
S170、静置8-16小时后得到水凝胶，将所述水凝胶置于-20℃温度下冷冻4-8h，然后在25℃温度下融化，反复上述冷冻-融化过程3～7次，获得载有藻胆蛋白的双网络水凝胶。
在一实施方式中，所述氢氧化钠和盐酸的浓度均为0.1～1M。
为了检测双网络水凝胶的性能，将PC载入上述双网络水凝胶，对PC的抗氧化活性能进行检测。PC是一种优异的抗氧化活性蛋白，随着PC自身的失活，抗氧化性能也逐渐消失，因此考察PC的抗氧化活性能够反映其变性程度。将PC载入不同浓度的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶。具体地，将双网络水凝胶(Col:PVA):PC＝6:2:2(A)，5:3:2(B)，4:4:2(C)和0:0:10(D)(空白对照)的样品溶解于溶液中，保持PC的浓度一致。在40摄氏度、强光照射12h后，测定PC的还原力。结果如图1所示，结果表明，在同样浓度的PC溶液中，双网络凝胶组的还原力显著高于普通溶液中的还原力。这证明PC载入双网络水凝胶能够增强其稳定性。
采用SEM电镜对载有藻胆蛋白的双网络水凝胶进行扫描，得到图2，可对材料进行直观的分析。可以观察到载有藻蓝蛋白的双网络水凝胶具有一定的孔隙率，满足了一定的组织材料用要求，拓展了藻蓝蛋白的应用，证明本申请的制备方法是可行的。
在上述载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法中，只需要将胶原蛋白、PVA和PC混合溶液配好后，放置在特定环境中形成载有藻蓝蛋白的双网络水凝胶即可。制备过程简单，未添加化学交联剂，也未产生有毒物质，从而安全无毒，本方制备的藻蓝蛋白双网络水凝胶，胶原蛋白可较容易的从多种动物组织中获得，聚乙烯醇也是非常经济的一种高分子聚合物，无需昂贵的生化试剂，降低了成本。由于天然提取的纯藻蓝蛋白在光热条件下容易分解，从而失去营养价值。本方法在保留藻蓝蛋白本身性质稳定的同时，让藻蓝蛋白通过一种稳定的水凝胶的形式，使其广泛应用成为可能。
以上仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
采用0.01～0.5M醋酸将鱼源胶原蛋白冻干海绵溶解，获得1～12mg/mL的胶原蛋白溶液，并采用氢氧化钠和盐酸调节溶液pH至4.5～6；
将PVA溶解在在去离子水，获得质量体积百分比为0.5～5％的PVA水溶液；
将藻胆蛋白粉末溶于0.01～0.02M的PBS缓冲液中，配置成浓度为0.1～2mg/mL的藻胆蛋白溶液；
将所述胶原蛋白溶液、PVA水溶液和藻胆蛋白溶液按照体积比(4～6):(2～4):2进行混合得到混合液；
搅拌后进行离心除去气泡得到离心液；
采用氢氧化钠和盐酸调节所述离心液pH至6.8～7.4后转移至模具中，在25～35℃温度下进行水浴处理；
静置8-16小时后得到水凝胶，将所述水凝胶置于-20℃温度下冷冻4-8h，然后在25℃温度下融化，反复上述冷冻-融化过程3～7次，获得载有藻胆蛋白的双网络水凝胶。
2.根据权利要求1所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述搅拌后进行离心除去气泡得到离心液为：将所述混合液充分搅拌20～60min后，在500～4000rpm 4℃离心1～5min以除去气泡得到离心液。
3.根据权利要求1所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠和盐酸的浓度均为0.1～1M。
4.根据权利要求1所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述藻胆蛋白为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白、别藻蓝蛋白或藻胆素。
5.根据权利要求1所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述鱼源胶原蛋白冻干海绵的制备方法包括：
将鱼皮脱脂后冲洗干净，在NaOH水溶液中浸泡除去非胶原成分，然后水洗至中性；
加入醋酸溶液溶解后离心取上清液，加入胃蛋白酶，于4℃～8℃搅拌，然后加入0.9MNaCl，静置，收集沉淀，将沉淀溶于醋酸溶液中；
采用Na2HPO4溶液透析后再分别用醋酸溶液、水透析，得到酶溶性胶原蛋白溶液，将酶溶性胶原蛋白溶液冷冻干燥，得到鱼源胶原蛋白冻干海绵。
6.根据权利要求5所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述鱼皮为罗非鱼鱼皮、狭鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼或三文鱼鱼皮。
7.根据权利要求5所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述鱼皮脱脂为：配制体积分数为10％～15％的正丁醇溶液，按照鱼皮：正丁醇溶液的质量体积比为1:30，加入适量正丁醇溶液浸泡24h～36h进行脱脂，每隔8～12h更换一次。
8.根据权利要求5所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述除去非胶原成分为：配制浓度为0.05～0.1mol/L的NaOH水溶液，将所述脱脂后的鱼皮在NaOH水溶液中浸泡24～36h，且所述NaOH水溶液每隔8～12h更换一次。
9.根据权利要求5所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶的质量体积百分比为1～4‰。
10.根据权利要求5所述的载有藻胆蛋白的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥温度为-60℃～-80℃。
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