CN113694179B - 一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物蛋白质精深加工技术领域，具体涉及一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法及其应用。本发明提供基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，包括：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白与水混合得到混合体系，先采用碱性溶液将所述混合体系的pH调至≥11，经水化后，再采用酸性溶液将水化后的体系的pH调至6‑8，使蛋白质之间共架结合。利用该方法可制备得到粒径为50‑200nm的纳米颗粒，粒径均一性高，且具有良好的溶解性和稳定性，同时，该方法可在最大限度保留蛋白质一级结构完整的基础上，通过相互作用改变蛋白质的二级结构，通过不同蛋白质间的组合达到营养互补，改善牦牛骨肽的潜在价值。
Description
技术领域
本发明涉及动物蛋白质精深加工技术领域，具体涉及一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，经济的快速发展推动着生活水平的提高，人们对于饮食的要求已经不再停留在果腹的阶段，健康合理的饮食成为人们追求的主流。蛋白质作为日常饮食中的重要组成部分，每日都需要保证一定量优质蛋白质的摄入。但目前蛋白质的供应，特别是优质蛋白质的供应，仍存在不足。
而与此同时，动物屠宰产物资源丰富，畜禽骨作为肉类生产中的副产物并没有得到充分利用，大量优质蛋白质遭到浪费。其中，牦牛骨含有丰富的蛋白质、脂肪和矿物质等营养元素，且形态组成与人骨相似，人体对其有较强的亲和力和较高的利用率。
牦牛骨肽是利用定向酶技术将牦牛骨蛋白降解后得到的分子量800Da左右的活性多肽，具有较高含量的钙磷等矿物质，且人体内消化吸收性能相较于单个氨基酸优异。但是，牦牛骨蛋白主要为胶原蛋白，其自身氨基酸组成存在一定缺陷，需要与其他种类的蛋白质进行复配使用，改善其营养性能。而且仅将牦牛骨肽作为蛋白质供应源并没有达到对其充分开发利用的目的。通过将牦牛骨肽制备成纳米颗粒，不但可以将其与其他种类蛋白质进行复配组合，改善其营养组成，而且可以装载其他活性成分，拓宽牦牛骨肽的应用范围，提高牦牛骨肽的经济附加值。
但是，目前并没有相关加工技术可以进行多种蛋白质二级结构水平的组装，使得牦牛骨肽形成纳米颗粒并能够装载其他活性物质。开发构建牦牛骨肽与其他蛋白的复杂共架复合体系具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法。本发明的另一目的是提供该制备方法的应用。
本发明以牦牛骨肽为基础，开发基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法。基于牦牛骨肽的特性，通过改变其二级结构并使其与其他营养多肽共架复合，形成新的稳定的二级结构，将其制备为多肽纳米颗粒。通过共架复合体系的形成，增加了复合体系中各多肽的溶解性和分散性，且纳米颗粒具有较高的粒径均一性和稳定性。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，该方法包括：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白与水混合得到混合体系，先采用碱性溶液将所述混合体系的pH调至≥11，经水化后，再采用酸性溶液将水化后的体系的pH调至6-8，使蛋白质之间共架结合。
对于碱性溶液的种类，可在符合《食品添加剂食用卫生标准》的碱性溶液中进行选择。
以上所述的方法中，牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的质量比优选为1:1:(0.2-1)。
本发明对能够与牦牛骨肽形成稳定的共架复合体系的多肽进行了大量的筛选，发现与其他蛋白相比，大米蛋白和酪蛋白形成的多肽能够很好地与牦牛骨肽进行共架复合，形成稳定的二级结构。将上述三种蛋白质的质量控制在上述范围内，能够更好地促进三种多肽形成稳定的共架复合体系。更优选的牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的质量比为1:1:(0.5-1)。
优选地，上述制备原料中，牦牛骨肽分子量为750-850Da，大米蛋白分子量为30-40kDa，酪蛋白分子量为30-50kDa。
将上述三种多肽分子量控制在上述范围内，能够更好地促进三种多肽形成稳定的共架复合体系。
本发明发现，对于牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白，将其置于pH≥11的碱性水溶液中，能够促进其溶解和结构展开，有利于后续新的二级结构的形成。
用于调节体系pH的碱性溶液的浓度优选为0.1mol/L～1mol/L。
在上述pH范围内的碱性溶液中，优选氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化钾水溶液中的一种或多种的混合物作为碱性溶液。
本发明发现，采用上述碱性溶液能够在保证牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的溶解和结构充分展开、改变各蛋白质二级结构间的相互作用的同时，不破坏其一级结构，最大程度地保留各多肽的功能。
本发明进一步发现，在水化后，将体系pH控制在6-8范围内，更有利于牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的多肽相互作用，形成稳定的共架复合体系。
用于调节体系pH的酸性溶液的浓度优选为0.01mol/L～0.1mol/L。
对于用于调节pH的酸性溶液的种类，可在符合《食品添加剂使用卫生标准》的酸性溶液中进行选择。
在上述酸性溶液中，优选盐酸水溶液、柠檬酸水溶液、醋酸水溶液中的一种或多种的混合物作为酸性溶液。
本发明发现，采用上述酸性溶液能够更有利于牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的多肽相互作用，形成稳定的共架复合体系。
在以上所述的方法中，在将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白与水混合时，牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的总质量与水的质量比为1：(90-110)。
水化的作用为使得牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的结构展开，优选的水化条件为：在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌20-60min。
在水化后加入酸性溶液回调pH后，共架结合的条件为：在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌60-120min。
以上所述的制备方法还包括：经共架结合后，还包括透析除盐、去除不可溶性杂质和冷冻干燥的步骤。
其中，去除不可溶性杂质可采用离心、过滤等方法。
作为本发明的优选方案，所述基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：
(1)调碱溶解：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白以1:1:0.5-1:1:1的质量比加入到三种蛋白总质量90-110倍质量的水中，滴加适量碱性溶液，调节体系的pH≥11，充分搅拌溶解；
(2)结构展开：将步骤(1)所得到的料液在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌20-60min，使得牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的高级空间结构充分展开；
(3)共架结合：向步骤(2)所得到的料液中滴加适量酸性溶液，调节整体pH为6-8，在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌60-120min，使得呈现展开状态的不同蛋白质间相互作用形成共架复合物；
(4)透析除盐：将步骤(3)所得到的料液置于透析袋中，加入料液15-20倍体积的水透析18-36h，除去制备过程中产生的杂质盐；
(5)离心去杂：将步骤(4)所得到的料液在4000-8000g条件下高速离心15-25min，除去不可溶性杂质，保留上清液；
(6)冷冻干燥：将步骤(5)所得到的上清液进行冷冻干燥，得到粒径范围为50-200nm的纳米颗粒，即以牦牛骨肽为主要原料的纳米颗粒成品。
采用本发明所述的制备方法制备得到的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的平均粒径范围为50-200nm。优选为80-120nm。
本发明还提供采用以上所述的制备方法制备得到的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒。
本发明提供的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒不仅具有牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的营养和功能，而且具有较好的溶解性和分散性，粒径均一，溶解体系稳定，可用于多肽类食品、药品和保健品的制备。
本发明还提供基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法在食品、药品或保健品制备中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒，针对蛋白质的二级结构进行结构改性，通过多肽之间的相互作用改变蛋白质的二级结构：首先，通过碱溶液调节pH使得蛋白质在碱性环境中二级结构充分展开；然后，通过加入酸溶液进行酸碱中和使得不同蛋白质间相互作用；最后，将料液调节至可食用范围，不同蛋白质复合形成新的二级结构，达到较强的稳定性。本发明提供的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法能够在不破坏一级结构的前提下，完整保留原料蛋白质主要亚基，使得不同蛋白质间营养特性和功能特性得到互补增强，改善牦牛骨肽的潜在应用价值；同时，该三元多肽纳米颗粒具有良好的溶解性，溶解度可达到90％以上，具有良好的分散性，粒径均一，纳米颗粒的水溶液和粉末均具有较高的稳定性，具有较好的应用价值。
2、本发明提供的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，相对于传统牦牛骨肽的处理方法，可得到更精细的结构，有助于人体对营养成分的吸收利用；该制备方法操作便捷、耗能较低、对于操作和设备要求较低，工业化应用可能性较大；反应条件和过程温和，添加试剂安全可食用，成品无化学试剂或有毒有害成分残留风险。
附图说明
图1为本发明实验例1中实施例1-3所得的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的成品图。
图2为本发明实验例1中实施例1-3所得的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的粒径检测结果图。
图3为本发明实验例1中实施例3所得的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的SEM检测图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的牦牛骨肽购自安徽国肽生物科技有限公司，其分子量为800Da。
以下实施例中使用的大米蛋白购自无锡金农生物科技有限公司，其分子量为35kDa。
以下实施例中使用的酪蛋白购自国药集团化学试剂有限公司，其分子量为30-50kDa。
实施例1
本实施例提供一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，其步骤如下：
(1)调碱溶解：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白以1:1:0.5的质量比加入到100倍质量的蒸馏水中，滴加适量浓度为1mol/L氢氧化钠水溶液，调节体系的pH为12，充分搅拌溶解；
(2)结构展开：将步骤(1)所得到的料液在600r/min搅拌速率下均匀搅拌60min，使得牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的高级空间结构充分展开；
(3)共架结合：向步骤(2)所得到的料液中滴加适量浓度为0.1mol/L盐酸水溶液，调节体系的pH为7，在600r/min搅拌速率下均匀搅拌60min，使得呈现展开状态的不同蛋白质间相互作用形成共架复合物；
(4)透析除盐：将步骤(3)所得到的料液置于透析袋中，加入料液20倍体积的去离子水透析24h，除去制备过程中产生的杂质盐；
(5)离心去杂：将步骤(4)所得到的料液在7000g条件下高速离心20min，除去不可溶性杂质，保留上清液；
(6)冷冻干燥：将步骤(5)所得到的上清液进行冷冻干燥，得到粒径为115±5nm的纳米颗粒，即基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒成品。
本实施例还提供采用以上方法制备得到的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒。
实施例2
本实施例提供一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，其步骤如下：
(1)调碱溶解：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白以1:1:0.75的质量比加入到100倍质量的蒸馏水中，滴加适量浓度为0.5mol/L氢氧化钙水溶液，调节体系的pH为11.5，充分搅拌溶解；
(2)结构展开：将步骤(1)所得到的料液在650r/min搅拌速率下均匀搅拌55min，使得牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的高级空间结构充分展开；
(3)共架结合：向步骤(2)所得到的料液中滴加适量浓度为0.05mol/L柠檬酸水溶液，调节体系的pH为6，在650r/min搅拌速率下均匀搅拌55min，使得呈现展开状态的不同蛋白质间相互作用形成共架复合物；
(4)透析除盐：将步骤(3)所得到的料液置于透析袋中，加入料液20倍体积的去离子水透析24h，除去制备过程中产生的杂质盐；
(5)离心去杂：将步骤(4)所得到的料液在7000g条件下高速离心20min，除去不可溶性杂质，保留上清液；
(6)冷冻干燥：将步骤(5)所得到的上清液进行冷冻干燥，得到粒径为95±5nm的纳米颗粒，即基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒成品。
本实施例还提供采用以上方法制备得到的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒。
实施例3
本实施例提供一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，其步骤如下：
(1)调碱溶解：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白以1:1:1的质量比加入到100倍质量的蒸馏水中，滴加适量浓度为0.1mol/L氢氧化钾水溶液，调节体系的pH为12，充分搅拌溶解；
(2)结构展开：将步骤(1)所得到的料液在700r/min搅拌速率下均匀搅拌50min，使得牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的高级空间结构充分展开；
(3)共架结合：向步骤(2)所得到的料液中滴加适量浓度为0.01mol/L醋酸水溶液，调节整体pH为8，在700r/min搅拌速率下均匀搅拌50min，使得呈现展开状态的不同蛋白质间相互作用形成共架复合物；
(4)透析除盐：将步骤(3)所得到的料液置于透析袋中，加入料液20倍体积的去离子水透析24h，除去制备过程中产生的杂质盐；
(5)离心去杂：将步骤(4)所得到的料液在7000g条件下高速离心20min，除去不可溶性杂质，保留上清液；
(6)冷冻干燥：将步骤(5)所得到的上清液进行冷冻干燥，得到粒径为90±5nm的纳米颗粒，即基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒成品。
本实施例还提供采用以上方法制备得到的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒。
对比例
本对比例提供一种基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，其步骤如下：
将实施例1中的酪蛋白去除，仅将牦牛骨肽和大米蛋白以1:1的质量比进行制备，其余步骤与实施例1相同。
实验例1纳米颗粒的粒径、溶解度检测
对实施例1-3和对比例制备所得的基于牦牛骨肽的多肽纳米颗粒成品的性能进行检测，结果如表1所示。
表1纳米颗粒成品性能
实施例1-3所得的基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒成品如图1所示，结果显示，制备所得纳米颗粒具有良好的溶解性，可稳定使用和保存。
各实施例制备得到的纳米颗粒的粒径检测结果如图2所示，结果显示，各实施例制备所得的纳米颗粒的粒径大小集中在100nm左右，且粒径分布较窄，是均匀单一的分散体系。而对比例制备得到的共架复合物并不能稳定存在，通过7000g高速离心20min后，形成较多沉淀，溶解度仅为43.26％，纳米颗粒的平均粒径为247.1nm，且均一性较差，PDI为0.548。
SEM检测结果显示，各实施例制备所得的纳米颗粒呈现出球状颗粒形态，具有良好单分散性。其中，实施例3制备得到的纳米颗粒的SEM检测结果如图3所示。
实验例2纳米颗粒的稳定性分析
分别将实施例1-3和对比例制得的纳米颗粒以溶解形式和粉末形式进行稳定性检测。将各实施例和对比例制备所得纳米颗粒形成的水溶液在4℃下放置保存，经过48h后，各实施例的溶液中仅有少量絮状沉淀产生，经过轻微震荡后再次溶解，基本无不溶性沉淀产生。将各实施例和对比例制备所得纳米颗粒粉末在-20℃下放置保存，经过7d后，复溶，各实施例的溶解度较之前基本没有变化，再对其进行粒径检测，结果如表2所示。结果表明，实施例1-3制备所得纳米颗粒的水溶液和粉末均具有良好的稳定性，可稳定使用和保存。
表2纳米颗粒的稳定性分析
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：将牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白与水混合得到混合体系，先采用碱性溶液将所述混合体系的pH调至≥11，经水化后，再采用酸性溶液将水化后的体系的pH调至6-8，使蛋白质之间共架结合；
其中，牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的质量比为1:1:（0.2-1）；
所述水化的条件为：在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌20-60min；
所述共架结合的条件为：在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌60-120min。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液的浓度为0.1mol/L~1mol/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化钾水溶液中的一种或多种的混合物。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液的浓度为0.01mol/L~0.1 mol/L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液为选自盐酸水溶液、柠檬酸水溶液、醋酸水溶液中的一种或多种的混合物。
6.根据权利要求1~3、5任一项所述的制备方法，其特征在于，与水混合时，牦牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的总质量与水的质量比为1：（90-110）。
7.根据权利要求1~3、5任一项所述的制备方法，其特征在于，经共架结合后，还包括透析除盐、去除不可溶性杂质和冷冻干燥的步骤。
8.根据权利要求1~3、5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述基于牦牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的平均粒径范围为50-200nm。
9.权利要求1~8任一项所述的制备方法在食品、药品或保健品制备中的应用。
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