CN107898804A - 一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用 - Google Patents

一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用，具体为细胞分裂素ortho‐Topolin Riboside作为一种去抗肿瘤药物对人白血病细胞株的抗肿瘤作用，实验采用不同浓度oTR及现有的三种临床药物处理白血病细胞株THP‐1，对比发现oTR的抗肿瘤效果可达到临床药物的水平。此研究属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明的数据建立在oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，且效果强于临床药物，其中对白血病细胞株的药物敏感性较强的基础之上。

Description

一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用
技术领域
本发明涉及细胞分裂素ortho‐Topolin Riboside(oTR)作为一种去抗肿瘤药物对人白血病细胞株的抗肿瘤作用，属于生物化学与分子生物学技术领域。
背景技术
急性髓系白血病是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病，是一个具有高度异质性的疾病群，可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化。根据美国FBA分型确定了AML有MO～M7共八种亚型，其中M4和M5是目前最难治且复发率最高的类型。THP‐1细胞株属于M4亚型的一种，目前对这种亚型的治疗主要是骨髓移植及化疗，而现如今临床上应用的化疗药物如阿糖胞苷(cytarabine，Ara‐C)、地西他滨(decitabine，DCA)以及氟达拉滨(fludarabine，Flu)等等都存在一系列问题，如完全缓解率低、治疗不良反应大、伴有严重的骨髓抑制。
本研究致力于在达到同等效果的前提下尽量减少药量并且抑制白血病细胞的增殖，对比了oTR与目前临床药物的抑癌效果。采用的药物主要有一下几种：DCA的主要成分5‐氮杂‐2’‐脱氧胞苷酸，为目前已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂，主要用于治疗中高危骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)，效果较佳，已超越传统药物。Ara‐C是治疗急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)的主要药物，因其有剂量依赖性而低浓度的药物达不到理想效果，采用大剂量Ara‐C且与常规剂量的Ara‐C相比白血病细胞内药物浓度明显增高，对肿瘤细胞杀伤作用增强，但是存在耐药和副作用如ALT升高、发热、恶心、呕吐、呃逆、腹泻和骨髓抑制。Flu是在Ara‐C的2位上加了氟增强对腺苷脱氨酶(ADA)的脱氨基作用，而在糖的部位加了磷酸增强了其水溶性。二者有协同作用，但仍存在骨髓抑制期产生的感染。
近年来越来越多的研究方向定为针对白血病患者的个体化治疗，其中细胞凋亡的研究成为个体化治疗的热点之一。细胞增殖的幅度和细胞凋亡的幅度之间是否动态平衡决定着肿瘤组织对放化疗及激素疗法的反应效果，而这些肿瘤的治疗疗法都与诱导细胞凋亡有密切的关系。
N6‐2‐苄胺羟基‐9‐呋喃核糖基嘌呤(ortho‐Topolin Riboside，oTR)是一种存在于黎明时杨树叶子内合成的天然核苷类芳香族细胞分裂素。2010年根据美国国立癌症研究中心(NIC)测试结果发现，oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系(NIC60)具有非常显著的体外增殖抑制活性，其中对白血病细胞株的药物敏感性较强(IC50≦10μM)。并且通过药物体内筛选模型‐中空纤维法发现oTR在体内对一些肿瘤模型小鼠无明显的急性毒性反应。上述结果充分表明oTR作为一种核苷类细胞分裂素具有很强的抗肿瘤临床应用潜力和临床药用研发价值。目前关于oTR与现有临床药物如DCA、Ara‐C和Flu的比较未见报道。
发明内容
本发明针对上述现有技术，本发明提供了oTR在人白血病细胞株中抗肿瘤的应用。
本发明的技术方案：
一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用，步骤如下：
(1)细胞培养：将人白血病细胞株THP‐1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌RPMI1640培养液中，使用25cm2培养瓶培养，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养；THP‐1细胞为悬浮细胞，48h后离心传代，在转速1000rpm，离心5min条件下分离细胞，弃上清，使用新鲜含有灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液重悬细胞，传代于同规格培养瓶中；
(2)药物配制：药物oTR、DCA和Flu均用0.1％DMSO溶解，继续用无菌RPMI1640培养基将溶解好的药物稀释至浓度为0.01μM～50μM；Ara‐C用无菌RPMI1640培养基直接溶解至浓度为0.01μM～50μM，过滤除菌，室温保存；
(3)检测细胞增殖抑制率：将处于对数生长期的5×103～1×104个THP‐1细胞接种于每孔含有100μl RPMI 1640培养液的96孔板中，设置18组实验，每组3个复孔，第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.01μM oTR组；第4组：0.1μM oTR组；第5组：1μM oTR组；第6组：10μM oTR组；第7组：0.01μM Ara‐C组；第8组：0.1μM Ara‐C组；第9组：1μM Ara‐C组；第10组：10μM Ara‐C组；第11组：0.01μM DCA组；第12组：0.1μM DCA组；第13组：1μM DCA组；第14组：10μM DCA组；第15组：0.01μM Flu组；第16组：0.1μM Flu组；第17组：1μM Flu组；第18组：10μM Flu组；分别向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～3天，利用CCK‐8法检测各组细胞增殖抑制率，每孔加入10μLCCK‐8溶液，孵育2.5h后，在450nm吸收波长处检测各组细胞吸光度A值，按照公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率＝(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100％，记录数据；
(4)细胞亚倍体峰检测凋亡：同样将处于对数生长期的THP‐1细胞分别用药物oTR、Ara‐C、DCA及Flu处理，取1×105～3×105个THP‐1细胞接种于每孔含有3ml RPMI 1640培养液的6孔板中，设置9组实验，第1组：空白对照组；第2组：0.1μM oTR组；第3组：1μM oTR组；第4组：0.1μM Ara‐C组；第5组：1μM Ara‐C组；第6组：0.1μM DCA组；第7组：1μM DCA组；第8组：0.1μM Flu组；第9组：1μM Flu组；分别加入各组对应的药物，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～3天，收集细胞；按照Annexin V‐FITC凋亡检测试剂盒说明书配制染色缓冲液，用蒸馏水将4×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer供后续使用；用流式管收集对照组和实验组细胞成九个样品，用PBS充分洗涤后，每组取总数为2×105～5×105个细胞；用195μL稀释得到的染色缓冲液重悬各组细胞，再分别加入5μLAnnexin V‐FITC混匀，室温避光孵育10～15min，洗涤一次细胞后再用200μL稀释得到的染色缓冲液重悬，加入10μL Propidium Iodide，混匀，4h内上流式细胞仪检测分析，重复3次，计算细胞凋亡率。
本发明的有益效果：本发明的数据建立在oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，且效果强于临床药物，其中对白血病细胞株的药物敏感性较强的基础之上。
附图说明
图1为不同浓度oTR及临床药物对人白血病THP‐1细胞株增殖的抑制作用对比。
图2为不同浓度oTR及临床药物处理THP‐1细胞株的凋亡情况。
图3为不同浓度oTR与临床药物促人白血病细胞凋亡率定量分析。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：人白血病THP‐1细胞株，胎牛血清，谷氨酰胺(Gln)，双抗(青霉素/链霉素)，RPMI 1640培养基，CCK‐8试剂盒，Annexin V‐FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，oTR，Ara‐C，DCA，Flu。
实施例1
oTR及临床药物对人白血病细胞的体外增殖抑制活性：将复苏的人白血病细胞THP‐1培养于含有10％FBS灭活胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％青霉素/1％链霉素(双抗)的无菌RPMI 1640培养液中，置于25cm2细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2及饱和湿度下的培养箱中培养，2d左右传代1次。继续培养得到生长状态活跃的人白血病细胞，收集细胞。将处于对数生长期的5×103个细胞接种于每孔含有100μl RPMI 1640培养液的96孔板中，按照实验需求，处理组分别加入0.1％DMSO、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM浓度的四种药物，放入培养箱中孵育1～3天，各3个复孔。采用CCK‐8试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加10μl CCK‐8溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育2.5h。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的方差分析方法来分析各组数据，结果如图1所示。图1可见，施用不同浓度的oTR及临床药物对人白血病细胞THP‐1的增殖速率显著低于con和DMSO组，且oTR抑制增殖效果强于其他临床药物组。表明oTR可以优于临床药物的效果抑制人白血病细胞THP‐1的增殖。
实施例2
oTR、Ara‐C、DCA及Flu四种药物诱导THP‐1细胞凋亡：将生长状态活跃的THP‐1细胞用0.01μM和1μM的各药物处理36h后，按照Annexin V‐FITC凋亡检测试剂盒说明书配制染色缓冲液，收集对照组和实验组细胞，PBS充分洗涤后，取总数为2×105～5×105个细胞；用缓冲液195μL悬浮细胞，分别加入Annexin V‐FITC混匀，室温避光孵育10～15min，洗涤细胞后用200μL染色缓冲液重悬，加入10μL PI，混匀，4h内上流式细胞仪检测分析，计算细胞凋亡率。结果如图2和图3所示，图2可见，出现早期以及晚期凋亡细胞群。与空白对照组(0.83％)相比，各药物处理组THP‐1细胞凋亡比例显著增加(图2)，各组细胞凋亡率均呈剂量依赖性增加。通过对比凋亡率发现，低浓度下oTR与三种临床药物效果相当，高浓度条件下oTR凋亡率(2.66％)与DCA(1.16％)存在极极显著差异，说明在相同实验条件下，oTR能诱导THP‐1细胞发生凋亡，且诱凋亡能力与某些临床药物相类似或优于现有的药物。

Claims (1)

1.一种抗肿瘤试剂在人白血病细胞中的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞培养：将人白血病细胞株THP‐1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液中，使用25cm2培养瓶培养，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养；THP‐1细胞为悬浮细胞，48h后离心传代，在转速1000rpm，离心5min条件下分离细胞，弃上清，使用新鲜含有灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液重悬细胞，传代于同规格培养瓶中；
(2)药物配制：药物oTR、DCA和Flu均用0.1％DMSO溶解，继续用无菌RPMI 1640培养基将溶解好的药物稀释至浓度为0.01μM～50μM；Ara‐C用无菌RPMI 1640培养基直接溶解至浓度为0.01μM～50μM，过滤除菌，室温保存；
(3)检测细胞增殖抑制率：将处于对数生长期的5×103～1×104个THP‐1细胞接种于每孔含有100μl RPMI 1640培养液的96孔板中，设置18组实验，每组3个复孔，第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.01μM oTR组；第4组：0.1μM oTR组；第5组：1μM oTR组；第6组：10μM oTR组；第7组：0.01μM Ara‐C组；第8组：0.1μM Ara‐C组；第9组：1μM Ara‐C组；第10组：10μM Ara‐C组；第11组：0.01μM DCA组；第12组：0.1μM DCA组；第13组：1μM DCA组；第14组：10μM DCA组；第15组：0.01μM Flu组；第16组：0.1μM Flu组；第17组：1μM Flu组；第18组：10μM Flu组；分别向各组中加入对应的药物，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～3天，利用CCK‐8法检测各组细胞增殖抑制率，每孔加入10μL CCK‐8溶液，孵育2.5h后，在450nm吸收波长处检测各组细胞吸光度A值，按照公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率＝(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100％，记录数据；
(4)细胞亚倍体峰检测凋亡：同样将处于对数生长期的THP‐1细胞分别用药物oTR、Ara‐C、DCA及Flu处理，取1×105～3×105个THP‐1细胞接种于每孔含有3ml RPMI 1640培养液的6孔板中，设置9组实验，第1组：空白对照组；第2组：0.1μM oTR组；第3组：1μM oTR组；第4组：0.1μM Ara‐C组；第5组：1μM Ara‐C组；第6组：0.1μM DCA组；第7组：1μM DCA组；第8组：0.1μMFlu组；第9组：1μM Flu组；分别加入各组对应的药物，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育1～3天，收集细胞；按照Annexin V‐FITC凋亡检测试剂盒说明书配制染色缓冲液，用蒸馏水将4×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer供后续使用；用流式管收集对照组和实验组细胞成九个样品，用PBS充分洗涤后，每组取总数为2×105～5×105个细胞；用195μL稀释得到的染色缓冲液重悬各组细胞，再分别加入5μLAnnexin V‐FITC混匀，室温避光孵育10～15min，洗涤一次细胞后再用200μL稀释得到的染色缓冲液重悬，加入10μL Propidium Iodide，混匀，4h内上流式细胞仪检测分析，重复3次，计算细胞凋亡率。
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