CN107893036A - 亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法 - Google Patents

亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，属于生物硒制备领域，利用选育出的亚硒酸钠脱毒效率高的保藏号为CGMCC No.9507的酿酒酵母，通过发酵条件优化得到了将高毒亚硒酸钠脱毒转化，生成低毒生物硒的微生物发酵条件。本发明优点是：本发明所提供亚硒酸钠脱毒方法可以大幅度减小亚硒酸钠的急性毒性，简单有效，容易操作，所生成的有机生物硒安全性高，更易被人体吸收转化和利用。

Description

亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体属于一种将高毒亚硒酸钠脱毒转化为低毒生物硒的微生物发酵方法。
背景技术
硒是人体生命活动中不可缺少的一种微量元素。已有研究表明，硒具有抗氧化、提高机体免疫水平、缓解重金属毒性、抗衰老、防癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病等重要的生理作用。人体内硒的总积聚量约15 mg，在摄入与排泄中保持动态平衡，联合国卫生组织指出，膳食摄取硒是最理想的补硒方式，天然食物中的硒含量普遍较低，果蔬中硒含量一般小于10μg/kg。我国营养学会推荐正常成人摄入硒的安全和合适范围为 50-250 μg/d。调查表明，在我国大约有72%的国土呈现出不同程度的缺硒情况，缺硒问题十分严峻，对于广大硒缺乏人群而言，补充硒元素对于预防和辅助治疗硒缺乏相关疾病以及提高人体免疫力有着重要的现实意义。
目前，广泛使用的补硒方法是添加无机补硒剂，如亚硒酸钠、亚硒酸氢钠、硒酸钠等。无机硒已成功用于克山病、大骨节病等地方病的防治。但是，应用效果证明亚硒酸钠等无机硒毒性大，活性和毒性范围窄，最低致死量相对较小，利用率相对较低，安全性方面存在较大隐患。因此，通过脱毒转化作用，将亚硒酸钠的毒性大幅减低，并开发新型、保健、低毒、安全的生物硒已经成为目前硒添加剂制备的发展趋势。
发明内容
针对目前常用补硒剂亚硒酸钠毒性高、半数致死量小的问题，本发明提供一种将高毒亚硒酸钠脱毒转化为低毒生物硒的微生物发酵方法。
本发明利用微生物菌株，通过该微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为没有毒性的生物硒，此方法可用于制备高效安全的硒添加剂。
本发明所述的微生物菌株，是从市售的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）经过长期选育得到，其将亚硒酸钠脱毒转化的效率较高。该菌株已于2014年8月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 ：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为 CGMCC No. 9507。
本发明利用保藏号为CGMCC No. 9507的酿酒酵母，在培养基中加入亚硒酸钠，通过酿酒酵母自身的生长代谢繁殖，将原料中添加的高毒亚硒酸钠脱毒转化成生物有机硒。本发明利用微生物发酵技术可以将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为毒性较低、安全系数更高的天然生物硒添加剂。
本发明提供一种利用选育的微生物菌株，通过其自身的生长代谢将高毒亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，具体包括如下步骤：
（1）菌悬液的制备
挑取一环已活化两到三次的微生物菌种于5 mL液体培养基中，置于28℃摇床培养24 h后成为菌体培养液，取200 μL菌体培养液加入液体培养基中，在28 ℃摇床培养24 h成为菌悬液，再从培养好的菌悬液中取2 mL加入到无菌水中，在28 ℃摇床培养，菌液浓度达107cfu/mL时停止培养。
（2）亚硒酸钠脱毒转化发酵条件的优化
选择硒添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量六个因素进行Plackett-Burman试验，研究影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素；采用单因素试验和最陡爬坡试验确定各主要因素水平；采用三因素三水平的响应面试验，研究酿酒酵母的亚硒酸钠脱毒转化的发酵条件，得出亚硒酸钠脱毒转化的最佳发酵条件为亚硒酸钠添加量81.3 mg/L、初始pH 6.3、培养温度28.6℃，发酵时间30天。
（3）生物硒的分离与纯化
将经过脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋MD34（8000-14000）内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化之后的生物硒样品液。
（4）硒含量测定
采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析内生物有机硒样品液中硒含量，测得样品液中生物有机硒含量为1.52 mg/kg（以硒计）。
（5）生物硒和亚硒酸钠的急性毒性试验结果对比
试验选用6～8周龄，体重18～20 g的昆明种小白鼠60只，采用改良寇氏法，采用一定浓度的亚硒酸钠溶液和生物硒进行灌胃实验。一次经口灌胃。经口灌胃后，对小白鼠进行观测，记录日常行为、群体行为、毒性表现情况以及死亡情况，观测的周期为两周并记录其异常表现以及死亡状况。
根据公式计算半数致死量LD50：
i为组距（相邻两试验组的对数的差）；
Xm为最大剂量对数；
∑P为各剂量组死亡率之和；
计算得出亚硒酸钠的半数致死量LD50 = 21.17mg/kg，根据急性毒性分级标准，亚硒酸钠属于5级（剧毒）。通过微生物发酵作用将亚硒酸钠进行脱毒转化之后得到的生物硒的LD50为935 mg/kg，根据急性毒性分级标准，生物硒属于2级（实际无毒），通过本发明方法可以显著降低亚硒酸钠的毒性，达到脱毒转化的效果。
亚硒酸钠脱毒转化菌株是经过长期选育得到的脱毒转化能力强的微生物菌株，利用微生物自身的合成代谢作用，在微生物培养过程中不断加入可溶于水的高毒无机硒盐（亚硒酸钠），使其通过微生物发酵作用合成硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖等生物大分子从而实现亚硒酸钠脱毒转化，经过超声破碎菌体后透析可以得到安全性高的生物硒制品。通过微生物发酵方法将高毒亚硒酸钠脱毒转化得到的生物硒安全性更好，更易被人体吸收、转化和利用，有利于其在食品工业等领域的进一步应用。本发明具有操作简便、条件易于控制和实现、脱毒效率高等优点，而且得到的生物硒可以进一步的作为硒添加剂进行应用。
具体实施方式
以下实施例中使用的酿酒酵母菌株，是从市售的酿酒酵母经过选育得到的，该菌株将无机硒转化为生物有机硒的转化率比较高，该菌株已于2014年8月12日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.9507。
实施例1亚硒酸钠的脱毒转化
（1）菌悬液的制备
挑取一环已活化两到三次的菌种于5 mL液体培养基中，置于28℃摇床培养24 h后成为菌液，取200 μL菌液加入液体培养基中，在28 ℃摇床培养24 h为菌悬液，再从培养好的菌悬液中取2 mL加入到无菌水中，在28 ℃摇床培养，菌液浓度达107 cfu/mL时停止培养。
（2）亚硒酸钠脱毒转化发酵条件优化
a. Plackett-Burman法筛选影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素
选用N=8的实验设计，对亚硒酸钠添加量（X1）、培养温度（X2）、培养时间（X3）、初始pH（X4）、接种量（X5）、装液量（X6）6个因素进行考察，每个因素分别设高水平和低水平两个水平，高水平是低水平的1.25倍，以亚硒酸钠脱毒转化后生成的生物硒含量(Y)作为响应值，结果表明：亚硒酸钠添加量、初始pH、培养温度、装液量、接种量和培养时间的不同组合对亚硒酸钠脱毒转化生成生物硒的影响各不相同。采用Minitab进行各因素主效应分析，得到6个因素中对响应值影响的显著性顺序为：亚硒酸钠添加量>初始pH >培养温度>装液量>接种量>培养时间。因此，把培养时间、装液量、接种量固定在较好水平上。选择亚硒酸钠添加量、初始pH和培养温度这三个因素进一步做单因素试验和正交试验。
b. 不同因素对亚硒酸钠脱毒转化为生物硒的影响
采用单因素试验法，以亚硒酸钠添加浓度，初始pH，培养温度为自变量，以酿酒酵母生物量和生物硒含量为评价指标，确定每个因素的最佳水平。
培养基中其他组分及培养条件保持不变，分别添加不同浓度的亚硒酸钠（60、70、80、90、100、110、120 mg/L），测定其酵母细胞生物量与脱毒转化后生物硒含量，结果表明，酿酒酵母生物量和生物硒含量均随着硒浓度的增加先增加后降低，且在亚硒酸钠浓度为90mg/L时达到最高值。
培养基及其他培养条件保持不变，改变其初始pH（4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0），测定酿酒酵母生物量与硒含量，结果表明酿酒酵母生物量和生物硒含量均随着初始pH的增加先增加在初始pH 6.4后趋于平缓，综合考虑确定最佳初始pH为6.4。
培养基及其他培养条件保持不变，分别在不同温度下培养（20、24、28、32、36 ℃），测定酿酒酵母生物量与生物硒含量，结果表明，在培养温度为24 ℃和32 ℃时酿酒酵母生物量较高，在培养温度为20 ℃和32 ℃时生物硒含量较高，综合考虑酿酒酵母生物量和生物硒含量，确定最佳培养温度为32 ℃。
c. 最陡爬坡试验
按陡爬坡法以从实验低数值到高数值，根据各因素效应值的大小确定梯度进行试验。以微生态硒含量最高的实验组作为响应面的中心点。用最陡爬坡试验确定响应面的中心点，进一步确定亚硒酸钠脱毒转化的因素水平，实验设计与结果见表1。
表1 最陡爬坡实验设计及其实验结果
由表1可知，最优培养条件在试验 2与试验3之间，所以响应面实验的中心点设为试验2的条件。
d. 响应面条件优化及最终亚硒酸钠脱毒转化条件的确定
根据最陡爬坡实验和Plackett- Burman 实验来确定该试验的因素与水平，三因素的三个水平分别选取硒添加量（70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L），初始pH（6.0、6.4、6.8），培养温度（26 ℃、30 ℃、34 ℃）。具体实施方案如表2。
表2 响应面分析试验因素水平表
对响应面分析试验结果利用Minitab的响应优化器优化，获得优化条件为：亚硒酸钠添加量（X1）为81.3 mg/L,初始pH（X2）为6.3，培养温度（X3）为28.6 ℃，预测响应值为1550.994 μg/L。在此条件下共进行5批次250 mL摇瓶试验，结果分别为：1574.329 μg/L、1654.009 μg/L、1654.009 μg/L、1474.73 μg/L、1654.572 μg/L、1372.284 μg/L，平均值为1544.165 μg/L。结果与预测值接近。最后确定得出亚硒酸钠脱毒转化的最佳培养条件为亚硒酸钠添加量81.3 mg/L、初始 pH 6.3、培养温度28.6℃。
（3）生物硒的分离纯化与含量测定
将经过一定时间脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋MD34（8000-14000）内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化之后的生物硒样品液。采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析内生物有机硒样品液中硒含量，测得样品液中生物有机硒含量为1.52 mg/kg（以硒计）。
实施例2亚硒酸钠和生物硒LD50的测定
试验选用6～8周龄，体重18～20 g的昆明种小白鼠60只，采用改良寇氏法，采用一定浓度的亚硒酸钠溶液和生物硒进行灌胃实验。一次经口灌胃。经口灌胃后，对小白鼠进行观测，记录日常行为、群体行为、毒性表现情况以及死亡情况，观测的周期为两周并记录其异常表现以及死亡状况。
根据公式计算LD50：
i为组距（相邻两试验组的对数的差）；
Xm为最大剂量对数；
∑P为各剂量组死亡率之和；
计算得出亚硒酸钠的LD50 = 21.17mg/kg，根据急性毒性分级标准，亚硒酸钠属于5级（剧毒）。通过微生物发酵作用将亚硒酸钠进行脱毒转化之后得到的生物硒的LD50为935 mg/kg，根据急性毒性分级标准，生物硒属于2级（实际无毒），通过本发明方法可以显著降低亚硒酸钠的毒性，达到脱毒转化的效果。

Claims (5)

1.亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是通过微生物发酵作用将高毒的亚硒酸钠脱毒转化为生物硒。
2.根据权利要求1所述的亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是发酵方法包括如下步骤 ：
（1）菌悬液的制备
挑取一环已活化两到三次的生物菌种置于5 mL液体培养基中，并置于28℃摇床培养24h后成为菌体培养液，取200 μL菌体培养液加入液体培养基并在28 ℃摇床培养24 h成为菌悬液，再从菌悬液中取2 mL加入到无菌水中，在28 ℃摇床培养，菌液浓度达107 cfu/mL时停止培养；
（2）脱毒转化发酵条件的优化
选择硒添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量六个因素进行Plackett-Burman试验，研究影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素；采用单因素试验和最陡爬坡试验确定各主要因素水平；采用三因素三水平的响应面试验，研究微生物菌种的亚硒酸钠脱毒转化的发酵条件；通过条件优化得到最佳的脱毒转化发酵条件是亚硒酸钠硒添加量81.3 mg/L、初始pH 6.3、培养温度28.6 ℃；
（3）脱毒转化之后的微生物中生物硒分离纯化
将脱毒转化发酵的生物发酵液经过超声破碎后全部装入透析袋内，扎紧上端，于蒸馏水中透析得到亚硒酸钠脱毒转化的生物硒样品液；
（4）硒含量测定
采用氢化物-火焰原子吸收法测定透析袋内生物硒样品液中生物硒含量。
3.如权利要求2所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征是所述的微生物菌株是保藏号为CGMCC No.9507的酿酒酵母。
4.如权利要求1或2所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，其特征在于所述生物硒的含量为1.52 mg/kg，半数致死量LD50为935 mg/kg。
5.如权利要求2中所述亚硒酸钠脱毒转化的微生物发酵方法，包括下述内容：
a. 采用Plackett-Burman法筛选影响亚硒酸钠脱毒转化的主要因素，对亚硒酸钠添加量、培养温度、培养时间、初始pH、接种量、装液量6个因素进行考察，每个因素分别设高水平和低水平两个水平，高水平是低水平的1.25倍，以亚硒酸钠脱毒转化后生成的生物硒含量作为响应值；
采用Minitab进行各因素主效应分析，得到6个因素中对响应值影响的显著性顺序为：亚硒酸钠添加量>初始pH >培养温度>装液量>接种量>培养时间；把培养时间、装液量、接种量固定在较好水平上；选择亚硒酸钠添加量、初始pH和培养温度这三个因素进一步做单因素试验和正交试验；
b. 采用单因素试验法，以亚硒酸钠添加浓度，初始pH，培养温度为自变量，以生物菌种生物量和生物硒含量为评价指标，确定每个因素的最佳水平；
培养基中其他组分及培养条件保持不变，分别添加不同浓度的亚硒酸钠，测定生物菌种细胞生物量与脱毒转化后生物硒含量，结果表明，生物菌种生物量和生物硒含量均随着硒浓度的增加先增加后降低，且在亚硒酸钠浓度为90 mg/L时达到最高值；
培养基及其他培养条件保持不变，改变初始pH，测定生物菌种生物量与生物硒含量，结果表明生物菌种生物量和生物硒含量均随着初始pH的增加先增加，在初始pH为6.4时达到最高值；
培养基及其他培养条件保持不变，分别在不同温度下培养，测定生物菌种生物量与生物硒含量，结果表明，在培养温度为24 ℃和32 ℃时生物菌种生物量较高，在培养温度为20℃和32 ℃时生物硒含量较高；
c. 按陡爬坡法从实验低数值到高数值，根据各因素效应值的大小确定梯度进行试验；以微生物硒含量最高的实验组作为响应面的中心点，用最陡爬坡试验确定响应面的中心点，进一步确定亚硒酸钠脱毒转化的因素水平；
d. 根据最陡爬坡实验和Plackett-Burman实验来确定正交试验的因素与水平，三因素的三个水平分别选取硒添加量是70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L，初始pH分别是6.0、6.4、6.8，培养温度分别是26 ℃、30 ℃、34 ℃。
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