CN107890116A - 亮氨酸衍生物、包含其的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有优异的皮肤改善效果、疲劳改善效果和/或女性更年期症状缓和效果的化妆材料组合物、药学组合物、类药品组合物及食品组合物。本发明的作为有效成分包含甘氨酰‑L‑亮氨酸肽和/或L‑亮氨酰甘氨酸肽、或者其盐的组合物，对皮肤弹性改善、皮肤保湿、抗皮肤老化、疲劳改善、抗炎症、抗氧化和/或女性更年期症状的缓和显示出优异的效果。本发明的作为有效成分包含甘氨酰‑L‑亮氨酸肽和/或L‑亮氨酰甘氨酸肽、或者其盐的组合物，可用作对皮肤安全且目标效果优异的化妆品原料、药学成分、类药品原料或功能性食品原料被利用，可作为指标成分或有效成分包含。

Description

亮氨酸衍生物、包含其的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及亮氨酸衍生物、包含其的组合物及其用途。具体而言，本发明涉及亮氨酸衍生物的新的化妆学用途、药学用途、食品学用途，以及包含亮氨酸衍生物的化妆材料组合物、药学组合物、类药品组合物及食品组合物。
背景技术
老化是生命现象，所有生命体一出生就开始老化。随着卫生和健康环境的改善，人类的寿命比过去延长了很多，高龄人口的比率有持续增加的趋势(姜太真，BioWave 2011，Vol.13，No.3(1))。老化在全身上发生，如整体身体功能的低下以及心血管疾病、糖尿病等生活习惯病，引发脏器的生理功能的低下(崔贤哲，大韩皮肤科学会刊，1997；35：292-302)。
皮肤是，不仅在身体的最外层阻止体内水分、电解质、蛋白质的流失，并且同时执行体温调节、皮肤的感觉功能、免疫功能等多种功能的重要器官。
与其它器官同样地，皮肤也随着年龄的增长发生老化。皮肤老化由内源性皮肤老化(intrinsic skin aging)和光老化(photoaging)构成，内源性皮肤老化不以肉眼的形态学变化为特征，而是以功能变化为特征。由慢性紫外线暴露引起的光老化与内源性老化重叠，虽然不是全身性的或者不可避免的，但是显示出明显的结构变化、生理变化。在老化的表皮上，不仅产生皮肤皱纹、屏障消失、免疫异常等固有功能的丧失，而且对身体的外观产生美观上的影响。虽然不能阻止皮肤的老化，但为了预防并延迟皮肤的老化，人们尝试着各种各样的方法。
胶原蛋白是在皮肤的成纤维细胞(Fibroblast)中生成的主要的基质蛋白，存在于细胞外间质中，作为其重要的功能，已知有：皮肤的机械坚固性、结合组织的抵抗力和组织的结合力、细胞附着的支撑、细胞分裂和分化(有机体的生长或者伤口治愈时)的诱导等。该胶原蛋白根据年龄和因紫外线照射引起的光老化而减少，而且，通过分解胶原蛋白的胶原酶活性，加快胶原蛋白的减少。已知该现象与皮肤的皱纹形成有着密切的关联。
另外，弹性蛋白是在与皮肤弹性相关的皱纹生成中重要的皮肤构成成分。已知弹性蛋白(Elastin)纤维的缺乏和凝聚、作为弹性蛋白分解酶的弹性蛋白酶(Elastase)活性的显著增加，是皮肤皱纹的生成因素之一。弹性蛋白酶是能够分解弹性蛋白的唯一酶，已知阻碍该弹性蛋白酶，能够根本性地减少皮肤皱纹。
另外，已知胶原蛋白和弹性纤维是对真皮层内的保湿产生重要作用的基质蛋白，这种基质蛋白吸附水分，并提高其所构成的结构内部的保湿力，以使皮肤保持含有适当水分的状态，并由此影响皮肤弹性的保持。
另外，在皮肤的成纤维细胞(Fibroblast)中生成的弹性纤维(Elastic fiber)，与胶原蛋白形成交联，是在与皮肤弹性相关的皱纹生成中重要的皮肤构成成分。已知弹性纤维的缺乏以及分解，是皮肤皱纹的生成和弹性低下的主要因素之一。
目前，作为改善皱纹的化妆材料，已知有：类视黄醇(retinoid)、腺苷、来自动物胎盘的蛋白质、小球藻提取物等。最典型的视黄醇，是促进胶原蛋白合成并阻碍弹性蛋白酶的物质，但其不稳定，并且由于在适用于皮肤时出现刺激、红肿等安全性问题，因此，其使用量受限。小球藻提取物等由于效果微小，很难起到实质性的皮肤皱纹改善效果。
因此，迫切需要开发出：对生物体安全，有效成分对皮肤安全且稳定性高，更重要的是，与已知的在皮肤中具有弹性改善、保湿或者抗老化效果的物质相比，效果更优异的改善皮肤弹性、保湿、防止皮肤老化的成分。
另外，疲劳是现代社会中最普遍的疾病之一，是指体能低下的状态(Uthayathaset al.,2007)。疲劳可能因过度的压力(Uthayathas et al.,2007)或者免疫功能和抗氧化体系的异常产生(Cleare,2003)。作为疲劳相关的指标，有：尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、谷丙转氨酶(alanine aminotransaminase，ALT),乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH),葡萄糖(glucose)等血液内生物标志物(Klimas et al.,2012)。乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(creatine kinase)(CK)值通常作为与肌肉损伤有关的标志物广为人知(Coombes and McNaughton,2000)。苹果酸脱氢酶(MDH)也与疲劳的氧化新陈代谢有关(Callister et al.，2004)。另外，在氧化压力途径和多种炎症途径中免疫异常症状的发生，会诱发疲劳(Liu et al.，2000)。过度运动后产生的活性氧，会加重疲劳(Powers etal.，1999)。为了减少该活性氧，会生成超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase)(Liu et al.,2000)。一氧化氮NO在慢性疲劳患者中增加(Suarez etal.，2010)，炎症性细胞因子也是与疲劳症状有关联(Liburt et al.,2010)。
目前，为了治疗疲劳进行着许多研究，但迄今为止尚未发现合适的方案。
疲劳的原因区分为：体内储存能源的缺乏或不能利用、由代谢作用引起的体内炎症反应、抗氧化体系的异常、疲劳物质的蓄积、体内的稳态失调等，已知大部分由多种因素的相乘作用引起。为了这种疲劳的恢复，需要充分的能源供给和休息，抑制和去除体内疲劳物质的生成等，但是在繁忙的现代社会中，实际上无法满足充分的营养摄取和休息，因此，需要挖掘用于疲劳恢复的功能性材料。
另外，女性的闭经(menopause)是指，遗传学上决定的从出生后到约50年的卵巢功能到达寿命所表现出的月经中断现象，意味着生殖能力的消失，其并不是病理现象而是生理上的变化。目前，韩国女性的平均寿命是81.2岁(2011年：统计厅)，假设韩国妇产科学会所规定的韩国女性的平均闭经年龄为50岁，则意味着女性一生的约1/3以上是以女性激素枯竭的状态生活(药学情报院，金成哲)。
女性自从面临闭经，由于女性激素分泌的不均衡以及减少，会引发血管系统、肌骨系统、泌尿生殖系统以及脑神经等全身性的变化。即，伴随有：作为血管运动性症状和心理症状的颜面潮红、盗汗、睡眠障碍、疲劳感、忧郁症、焦虑、注意力障碍、记忆障碍、因泌尿生殖系统萎缩引起的性交痛、尿频、胶原质减少引起的皮肤弹性的消失、乳房下垂，以及心血管和肌骨系统症状、痴呆等多种疾病。更年期症状每个人都有差异，但普遍认为更年期症状越多、程度越严重、且期间越长，女性的生活质量就越低，而且更年期症状与身体上的老化一同转变成慢性疾病的概率很大。
更年期症状的治疗可以适用激素疗法、药物疗法、运动疗法、饮食疗法，但是，医学上广泛使用的女性激素治疗有可能增加乳房癌等的危险，长期使用时，有可能增加子宫癌、血栓血管疾病、胆囊疾病、高血压的比率。
因此，不断地进行着既对人体安全又能够获得优异的治疗效果的疗法的研究。
发明内容
因此，本发明要解决的课题是，提供一种能够解决如上所述的问题，副作用少，而且既对人体安全又能够获得优异的皮肤弹性改善,保湿或防止皮肤老化的效果的新的活性成分，即提供活性成分的这种有益的用途。
另外，本发明要解决的课题是，提供一种副作用少，对人体安全且疲劳改善、炎症改善或抗氧化效果优异的新的活性成分，即提供活性成分的这种有益的用途。
另外，本发明要解决的课题是，提供一种更年期症状的改善效果优异的新的活性成分，即提供活性成分的这种有益的用途。
换言之，本发明要解决的课题是，提供一种包含上述效能优异的活性成分的组合物，进而，提供一种包含上述效能优异的活性成分作为有效成分或指标成分的组合物。
为了解决上述课题，本发明提供皮肤弹性改善、皮肤保湿或者抗皮肤老化用的组合物，优选提供化妆材料组合物、药学组合物、类药品(quasi drugs)组合物或食品组合物(优选为功能性食品组合物)，这些组合物作为有效成分，包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐。
即，本发明提供甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐作为化妆材料组合物、药学组合物、类药品组合物或食品组合物的用途，以及作为皮肤弹性改善用、皮肤保湿用或抗皮肤老化用的新用途。
本发明提供皮肤弹性改善、皮肤保湿或防止皮肤老化的方法，该方法在皮肤上处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽，或者其盐。
上述甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽可以是有效成分或指标成分。
本发明人为了开发对皮肤改善有效果的肽或者包含该肽的天然材料进行了悉心研究，结果确认了甘氨酰-L-亮氨酸肽和/或L-亮氨酰甘氨酸作为有效成分包含的组合物对皮肤弹性改善、皮肤保湿、防止皮肤老化有效果，从而完成了本发明。
本发明人通过实验确认到：将甘氨酰-L-亮氨酸和/或L-亮氨酰甘氨酸、或者其盐作为有效成分包含的组合物，通过促进透明质酸(Hyaluronic acid)的合成、促进前胶原的合成，阻碍弹性蛋白酶活性，显示出皮肤改善效果。
本发明中，“皮肤弹性改善”是指缓解皮肤松弛程度。另外，上述弹性是指弹性蛋白和胶原蛋白足量存在的状态下保持皮肤的弹性。
本发明中，“皮肤保湿”是指增加皮肤的水润感，保持湿润状态。皮肤保湿效果有助于皮肤的皱纹改善以及弹性增加。
本发明中，“抗皮肤老化”是指预防和缓和皮肤中皱纹的产生，弹性下降等。作为一例，通过阻碍弹性蛋白酶的活性，能够抑制皮肤老化。
根据本发明的另一实施方式，提供疲劳改善、炎症改善或者抗氧化用的组合物，优选提供保健功能食品组合物、化妆材料组合物、药学组合物或者类药品组合物，这些组合物作为有效成分，包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽，或者其盐。
即，本发明提供甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐作为保健功能食品组合物、化妆材料组合物、药学组合物或者类药品组合物的用途，以及作为疲劳改善、炎症改善或者抗氧化用的新用途。
本发明提供疲劳改善、炎症改善或者抗氧化的方法，该方法处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐。
上述甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽可以是有效成分或指标成分。
本发明的发明人通过实验确认到，甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐在因运动诱发疲劳的小鼠模型中防止肌肉内乳酸和肌酸激酶(CK)的蓄积，发现了具有疲劳改善效果，从而完成了本发明。另外，通过实验确认到，上述甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐减少脾细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的分泌，具有炎症改善效果，并通过实验确认到能够提高血液内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，从而确认了具有抗氧化效果。
本说明书中使用的术语“疲劳改善”，是指消除累积的疲劳或者消除疲劳症状，上述疲劳是指因身体或精神上的活动，细胞、肌肉、器官的力量或敏感度暂时性减退的状态。若在没有恢复疲劳的状态下持续精神和体力活动，疲劳会加重，从而有可能成为过劳或慢性疲劳的状态，导致运动障碍，甚至还有可能发展成健康障碍。如此地，当进行过度的身体活动时，会产生疲劳，这是因为葡萄糖、糖原等能源由于身体的活动被消耗的缘故，对因运动消耗的能源而言，运动强度越高，越加快肌糖原的消耗，虽然低强度下消耗相对少，但即使在低强度的运动下，随着时间的经过消耗也增加，从而成为疲劳的原因。作为其它疲劳的原因，是乳酸、二氧化碳等代谢中间产物在体内蓄积而成为疲劳的原因。需要说明的是，疲劳的生理学机制并非限定于以上的说明。作为人体能源的碳水化合物在体内分解为葡萄糖，剩余部分以糖原的形态被储存于肝和肌肉，并根据需要用作能源，当运动中糖原发生分解时，若提供充分的氧气，则发生完全分解并生成大量的能量而使运动持续，但是，当氧气供给不充分时，生成乳酸而被蓄积，当乳酸被蓄积时，化学反应不顺畅从而成为疲劳的原因。本发明中，通过实验确认到，在因运动诱发疲劳的小鼠模型中，能够防止肌肉内乳酸和肌酸激酶(CK)的蓄积，从而确认了上述肽的疲劳改善效果。
本说明书中使用的术语“炎症改善”，是指不仅抑制炎症，而且消除和/或缓和所发生的炎症，上述炎症是人体组织对某种刺激的防御反应中的一种，是指并发组织变质、循环障碍和渗出、组织增殖等三种的复杂的病变。更具体而言，炎症是先天性免疫的一部分，如同其它动物，人类的先天性免疫能够识别在病原体特异性存在的细胞表面的图案。噬菌细胞将具有该表面的细胞识别为异物并攻击病原体。如果病原菌破碎身体的物理屏障并进入身体内，则引起炎症反应。炎症反应是当身体因多种因素受到损伤时，想要恢复、再生该损伤部位的免疫学防御机制，但是，若过度或持续地发生，会诱发急性或慢性的炎症疾病，并且有可能会成为以后引起循环障碍、多发性硬化症、帕金森病等疾病的病因。炎症发生在激素分泌、细胞因子、C-反应蛋白质(C-reactive protein，CRP)等体内多种机制中发生，相关的物质也非常多。其中，从免疫细胞分泌的多种细胞因子调节免疫系统，而一部分也会促进炎症。因此，细胞内细胞因子的表达量成为炎症反应活性化的指标。在本发明，通过实验确认了在因运动诱发疲劳的小鼠模型中，能够减少脾细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的分泌，从而确认了上述肽的炎症改善效果。
本说明书中使用的术语“抗氧化”，是指抑制氧化压力(stress)。人体中会产生导致氧化压力的物质。当用作体内能源的氧被不完全还原时，活性氧向细胞质内游离。该活性氧损伤周边细胞并加快炎症进展带来的组织损伤。该活性氧在正常情况下也会产生，如果体内没有抗氧化防御机制，我们无法延续生命。因此，人体中构筑有多种形态的抗氧化防御体系，以对抗正常的氧化压力。但是，若发生超过正常标准的氧化压力，身体受到严重的损伤，因此，需要氧化压力的对策。抗氧剂作为天然或合成物质，起到预防或抑制氧化压力的功能。为了评价这种物质在体内发挥的抗氧化效果，用多种方法评价作为体内抗氧化物质的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Catalase)、过氧化物酶(Peroxidase)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的含量，这种物质主要发挥去除活性氧的功能。本发明中，通过实验确认到，在因运动诱发疲劳的小鼠模型中，能够提高血液内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)水平，从而确认上述肽显示抗氧化效果。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供更年期症状缓和用、改善用或治疗用的组合物，优选提供保健功能食品组合物、化妆材料组合物、药学组合物或类药品组合物，所述组合物作为有效成分，包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐。
即，本发明提供甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐作为保健功能食品组合物、化妆材料组合物、药学组合物或者类药品组合物的用途，以及更年期症状缓和用、改善用或治疗用的新用途。
本发明提供缓和、改善或治疗更年期症状的方法，该方法处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐。
上述甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽可以是有效成分或指标成分。
本发明中，“更年期症状”是，随着因卵巢老化等出现的雌激素分泌减少，闭经前后在女性身上出现的症状及疾病的总称。也称为“更年期综合征”或“闭经期症状”。例如，更年期或闭经期症状有：颜面潮红、出汗、神经质、忧郁症、眩晕症、疲劳感、关节痛、肌肉痛、头痛、心悸、蚁走感、盗汗、睡眠障碍、皮肤干燥、阴道干燥症、阴道萎缩、下尿路萎缩、性交痛、阴道炎、膀胱炎、排尿痛、尿急、注意障碍、记忆障碍、焦虑、神经过敏、记忆力减退、皮肤干燥、关节痛或骨质疏松症等，但并非限定于此。另外，也有可能是心脏病、高血压、脑卒中等心血管系统异常。
本发明中，“预防”是指通过给药本发明的组合物，抑制或延迟目标症状的所有行为。
本发明中，“治疗”是指通过给药本发明的组合物，使目标症状或疾病好转或消失的所有行为。
本发明中，“改善”是指通过给药本发明的组合物，使目标症状比给药前好转或者向有利的方向变化的所有行为。
为了解决如上所述的问题并达成本发明的目的，本发明提供组合物，该组合物包含由下述化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物，可以是有效成分或指标成分。
化学式1：
由上述化学式1表示的化合物的分子式是C8H16N2O3，分子量是188.22，命名为甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)。其是由甘氨酸(Glycine)和L-亮氨酸(L-Leucine)的两种氨基酸组成的二肽，简称为Gly-Leu或GL。
本发明并不限定于上述甘氨酰-L-亮氨酸的获得方法，可以使用来自天然的物质、通过本发明所属领域中公知的方法化学合成的物质、或市售的物质。可优选使用从猪、牛、羊、马等哺乳类的胎盘提取的物质，更优选使用从猪胎盘提取的物质。
化学式2：
由上述化学式2表示的化合物的分子式是C8H16N2O3，分子量是188.22，命名为L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)。其是由L-亮氨酸(L-Leucine)和甘氨酸(Glycine)的两种氨基酸组成的二肽，简称为Leu-Gly或LG。
本发明并非限定于上述L-亮氨酰甘氨酸的获得方法，可以使用来自天然的物质、通过本发明所属领域中公知的方法化学合成的物质、或市售的物质。可优选使用从猪、牛、羊、马等哺乳类的胎盘提取的物质，更优选使用从猪胎盘提取的物质。
本发明的化妆材料组合物、药学组合物、类药品组合物或者食品组合物中，由上述化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐的含量相对于化妆材料组合物、药学组合物、类药品组合物或食品组合物总重量是0.00000001～100重量％，即，可以摄取、使用由上述化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物本身。
本发明中，当上述有效成分为由上述化学式1表示的化合物和由化学式2表示的化合物的混合物时，可将由上述化学式1表示的化合物和由化学式2表示的化合物以1:0.05～20的重量比，优选以1:0.1～10的重量比进行混合。本发明人通过实验不仅分别确认了每个成分的效果，还确认了以包含在上述范围内的1:1重量比混合有效成分而得以提高的效果。
本发明中，用作有效成分的由上述化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物，能够以盐的形态使用。此时，若本发明的组合物是食品，则能够以健康上不会产生问题且发挥本发明的目的效果的盐的形态使用；若本发明的组合物是化妆材料组合物，则能够以化妆学上可接受的盐的形态使用；若本发明的组合物是药学组合物、类药品组合物，则能够以药学上可接受的盐的形态使用。上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物的盐，是指由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物，与酸(例如，没有毒性或者毒性少的有机酸或无机酸)或者碱等进行加成反应而制备的盐。
例如,上述盐可以包括：钠盐、水杨酸盐、安息香酸盐、钙盐、柠檬酸盐、亚硫酸盐和亚硫酸氢盐、铝盐、盐酸盐、高锰酸盐、钾盐、乙酸盐、溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫氰酸盐、亚铁盐、硫代硫酸盐、铁(III)盐、铜(II)盐、乳酸盐、镁盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化物、锌盐、碘盐、琥珀酸盐等，但并不限定于此。
本发明的由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐，不仅能够以包含水合物、乙醇化物等形态的溶剂化形态存在，还能够以非溶剂化(unsolvated)的形态存在。本发明的由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐，能够以结晶形或非晶形的形态存在，所有这种物理形态均包含在本发明的范围。
本发明提供皮肤弹性改善用、皮肤保湿用或者抗皮肤老化用的食品组合物，其中，作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
发明提供疲劳改善、炎症改善或者抗氧化用的食品组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
本发明提供更年期症状改善、预防或治疗用的食品组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。优选地，上述食品组合物可以是功能性食品。
本说明书中使用的术语“功能性食品”，是指将上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物添加于饮料、茶类、香辛料、口香糖、饼干类等食品原料而成的食品，或者制成胶囊化、粉末化、悬浮液等的食品，摄取该功能性食品时，健康上会带来特定的效果，由于以食品为原料，因此具有与一般的药品不同的优点，即不会导致长期服用药品时可能产生的副作用等。如上所述地得到的本发明的功能性食品可日常摄取，有望在皮肤弹性改善、皮肤保湿或抗皮肤老化、疲劳改善、炎症改善、抗氧化和/或更年期症状的缓和、预防或治疗中发挥优异的效果，因此非常有用。
当将上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐用作食品添加剂时，可以将由上述化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐直接添加，也可以与其它食品或食品成分一起使用，可根据通常的方法适当地使用。可根据使用目的(预防、保健或治疗处置)，适宜地决定有效成分的混合量。一般情况下，当制造食品或饮料时，相对于原料，本发明组合物的添加量是15重量份以下,优选为10重量份以下。但是，当以保健和卫生为目的或者以健康调节为目的而长期摄取的情况下，上述添加量可以是上述范围以下，由于在安全性方面没有任何问题，因此，有效成分也能够以上述范围以上的量使用。上述食品的种类没有特殊的限制。能够添加上述物质的食品，例如有：肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、点心类、饼干类、比萨(Pizza)、拉面、其它面类、口香糖类、包括冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、清凉剂、酒精饮料及维生素复合剂等，包括所有通常意义上的食品。
当食品为饮料时，以100ml为基准，能够以1～30g，优选以3～20g的比率包含。另外，上述功能性食品组合物可还包含通常用于食品组合物而能够提高气味、味道、视觉等的附加成分。例如，可包含：维生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸(niacin)、生物素(biotin)、叶酸(folate)、泛酸(panthotenic acid)等。另外,可包含：锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、铬(Cr)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)等的矿物质。另外，可包含：赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等的氨基酸。另外，可添加：防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢醋酸钠等)、杀菌剂(漂白粉和漂白精、次氯酸钠等)、抗氧化剂(丁羟安尼唑(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等)、着色剂(焦油色素等)、成色剂(亚硝酸钠、亚硝酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、调味料(MSG(谷氨酸钠)等)、甜味剂(甘素、甜蜜素(Cyclamate)、糖精、钠等)、香料(香兰素、内酯类等)、膨胀剂(明矾、D-酒石酸氢钾等)、增强剂、乳化剂、增稠剂(糊料)、成膜剂、胶基(gum base)、消泡剂、溶剂、改性剂等的食品添加剂(food additives)。可根据食品的种类筛选上述添加剂并使用适当的量。该添加剂的比率不是很重要，但在一般情况下，相对于本发明的组合物100重量份，该添加剂的比率是0.01～0.8重量份。
可根据本领域中通常使用的方法来制造本发明的食品，制造上述食品时，可添加本领域中通常添加的原料和成分进行制造。另外，由于与一般的医药品不同地以食品为原料，因此，具有不会导致长期服用医药品时可能发生的副作用等的优点，便携性非常优异。
根据本发明的另一实施方式，提供皮肤弹性改善用、皮肤保湿用或抗皮肤老化用的化妆材料组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其化妆学上可接受的盐。
根据本发明的另一实施方式，提供疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的化妆材料组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
根据本发明的另一实施方式，提供更年期症状改善、预防或治疗用的化妆材料组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
当上述组合物为化妆材料组合物，并将其作为有效成分包含而制造的化妆品，可制备成一般的乳化剂型和可溶化剂型的形态。例如，所述剂型可以是：柔软化妆水或营养化妆水等化妆水；面部润肤乳、身体乳等乳液；营养霜、保湿霜、眼霜等霜剂；精华液、化妆软膏、喷雾剂、凝胶、面膜、防晒霜、隔离霜(make-up base)、液体型或固体型或喷雾型等的粉底霜、粉剂、洁面霜、洁面乳、卸妆油等卸妆剂、泡沫洗面奶、肥皂、沐浴露等清洗剂等，但本发明并非限定于此。
当上述组合物以化妆品形式被产品化时，若为有效成分短暂停留在皮肤的卸妆剂、清洗剂等水洗(wash-off)型化妆品，可包含比较高浓度的本发明组合物。相反，若为有效成分长期停留在皮肤的化妆水、乳液、霜、精华液等的免洗(leave-on)型化妆品时，可包含与水洗型化妆品相比低浓度的本发明组合物。
另外，上述化妆品除了包含本发明的组合物以外，还可以包含化妆品学领域中通常使用的助剂，作为该助剂，可举出：脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂和凝胶剂、软化剂、抗氧剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子封锁剂和螯合剂、防腐剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊或者通常利用于化妆品中的任意的其它成分。
另外，本发明的化妆材料组合物还可以包含一种以上的通常配合于皮肤化妆材料中的化妆学上可接受的载体。
根据剂型的不同，本发明的化妆材料组合物中包含的化妆学上可接受的载体有多种。当本发明的剂型为软膏、糊剂、霜剂或凝胶时，作为载体成分，可以利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌或它们的混合物。
当本发明的剂型为粉剂或喷雾剂时，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末、或它们的混合物，尤其是，当剂型为喷雾剂时，还可以包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。
当本发明的剂型为溶液或乳液时，作为载体成分，可利用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，有：水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲酸苄酯、聚丙二醇、1,3-丁基乙二醇油，尤其是，可使用：棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或失水山梨糖醇的脂肪酸酯。
当本发明的剂型为悬浮液时，作为载体成分，可利用水、乙醇或聚丙二醇等液相的稀释剂；乙氧基异十八烷醇、聚氧化乙烯山梨醇酯和聚氧化乙烯失水山梨糖醇酯等悬浮剂；微细晶体纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。
当本发明的剂型为肥皂时，作为载体成分，可利用脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白质水解产物、羟乙磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪醇、植物油、甘油、糖等。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供皮肤弹性改善用、皮肤保湿用或抗皮肤老化用的药学组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的药学组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供更年期症状改善、预防或治疗用的药学组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其盐。
上述组合物可具有选自于包含溶液、凝胶(gel)、乳液(emulsion)、悬浮液、微乳(micro-emulsion)、微胶囊(capsule)、脂质体(liposome)、霜剂(cream)、乳液(lotion)、软膏、气溶胶(aerosol)、喷雾剂(spray)、糊剂(paste)和贴片(patch)的组中的任意一种以上的剂型。
本发明的药学组合物可用作单一制剂，也可以还包含公认具有抗炎或抗氧化效果的药物并制成复合制剂而使用，还可以是，通过利用药学上可接受的载体或赋形剂进行制剂化，将其制成单位容量形态或者注入多容量容器内而进行制造。
本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”，是指不刺激生物体，且不阻碍所注入化合物的生物学活性和特性的载体或稀释剂。本发明中可使用的上述载体的种类没有特殊的限制，只要是该领域中通常使用且药学上可接受的载体都可以使用。作为上述载体的例子，可举出：生理盐水、无菌水、林格液(Ringer's solution)、缓冲生理盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等，但并不限定于此。这些可单独使用或者混合两种以上使用。上述载体可包含非天然载体(non-naturally occuring carrier)。
另外，根据需要，可添加抗氧化剂、缓冲液和/或抑菌剂等其它通常的添加剂而使用，也可以是，还添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂、润滑剂等，并制剂化为水溶液、悬浮液、乳液等的注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂等而使用。
另外，本发明的药学组合物可包含药学上有效量的由化学式1表示的化合物和/或由以化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。本说明书中，上述术语“药学上有效量”是指：以能够适用于医学治疗的合理的利益/危险比率，足以诱导皮肤弹性改善、皮肤保湿或抗皮肤老化效果的量；或者，足以诱导疲劳改善、炎症改善或抗氧化效果的量；或者足以缓和、改善或治疗更年期症状的量。一般情况下，可将0.001～1000mg/kg的量，优选将0.005～200mg/kg的量，更优选将0.01～100mg/kg的量，每天给药一次，或者每天分几次给药。但是，从本发明的目的考虑时，特定患者的具体的治疗有效量，可优选根据想要达到的反应种类和程度、根据需要是否还使用其它制剂等具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食、给药时间、给药途径以及组合物的分泌率、治疗期间、与具体组合物一起使用或者同时使用的药物等多种因素以及医药领域中公知的类似因素，使用不同的治疗有效量。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供皮肤弹性改善用、皮肤保湿用或抗皮肤老化用的类药品组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的类药品组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供更年期症状缓和、改善或治疗用的类药品组合物，该组合物作为有效成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。
本说明书中，术语“类药品”是指：以治疗、减轻、处置或预防人或动物的疾病为目的使用的纤维、橡胶或者与其类似的物品；对人体的作用微弱或者不直接作用于人体，且不是器具或机械的和与其类似的物品；为了预防感染型而作为杀菌、杀虫和与其类似的用途使用的制剂中的一种，且以诊断、治疗、减轻、处置或预防人或动物的疾病为目而使用的物品中不是器具、机械或装置的物品；以及，以对人或动物的结构和功能产生药理学影响为目使用的物品中，排除不是器具、机器或装置的物品。另外，上述类药品可包括皮肤外用剂和个人卫生用品。优选可以为消毒清洁剂、泡沫沐浴露、漱口水、湿巾、洗衣皂、洗手液或软膏剂，但并非限定于此。
当将本发明的上述组合物用作类药品添加剂时，可直接添加上述组合物，或者与其它类药品或类药品成分一起使用，可根据通常的方法适当地使用。可根据使用目的适宜地决定有效成分的混合量。
另外，本发明提供皮肤弹性改善、皮肤保湿、抗皮肤老化用的组合物，优选提供化妆材料组合物、药学组合物、类药品组合物或食品组合物，该组合物作为指标成分，含有甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的类药品组合物，该组合物作为指标成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。
作为本发明的另一实施方式，本发明提供更年期症状缓和、改善或治疗用的类药品组合物，该组合物作为指标成分，含有由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者其药学上可接受的盐。
本发明的作为有效成分包含甘氨酰-L-亮氨酸肽和/或L-亮氨酰甘氨酸肽、或者其盐的组合物，对皮肤弹性改善、皮肤保湿、抗皮肤老化显示出优异的效果。
本发明的包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐的组合物，对疲劳改善、炎症改善或抗氧化显示出优异的效果。
本发明的包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐的组合物，对更年期症状缓和显示出优异的效果。
本发明的包含甘氨酰-L-亮氨酸肽和/或L-亮氨酰甘氨酸肽、或者其盐的组合物，可用作对皮肤安全且皮肤状态的改善效果优异的化妆品原料、药学成分、类药品原料或食品原料。
本发明的包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐的组合物，可用作安全且疲劳改善、炎症改善或抗氧化效果优异的化妆品原料、药学成分、保健功能食品原料或饲料原料。
本发明的包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽、或者其盐的组合物，可用作安全且更年期症状的缓和效果优异的化妆品原料、药学成分、保健功能食品原料或饲料原料。
附图说明
图1是表示甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的透明质酸合成的促进效果的图表。
图2是表示甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的前胶原合成的促进效果的图表。
图3是表示甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的弹性蛋白酶阻碍活性的图表。
图4是表示本发明实施例和比较例的抑制前列腺素E2(PGE2)过度分泌带来的炎症改善和疲劳改善效果的图表。
图5是表示本发明实施例和比较例的DPPH自由基清除活性带来的抗氧化效果的图表。
图6是表示本发明实施例和比较例的防止肌肉内乳酸蓄积带来的疲劳改善效果的图表。
图7是表示本发明实施例和比较例的防止肌肉内肌酸激酶(CK)蓄积带来的疲劳改善效果的图表。
图8是表示本发明实施例和比较例的血液内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的减少带来的炎症改善效果的图表。
图9是表示本发明实施例和比较例的血液内白细胞介素-6(IL-6)的减少带来的炎症改善效果的图表。
图10是表示本发明实施例和比较例的血液内超氧化物歧化酶(SOD)的增加带来的抗氧化效果的图表。
图11是确认处理本发明的实施例和比较例时雌激素受体活性是否增加的实验结果。能够确认同时处理甘氨酰-L-亮氨酸肽和L-亮氨酰甘氨酸肽时，雌激素受体活性大幅度增加。通过该结果，可确认本发明的甘氨酰-L-亮氨酸肽和/或L-亮氨酰甘氨酸肽能够有效地利用于治疗、改善和/或预防更年期疾病。
图12是确认处理本发明的实施例和比较例时破骨细胞分化的抑制效果的结果。通过该结果，确认到：本发明的甘氨酰-L-亮氨酸肽和/或L-亮氨酰甘氨酸肽抑制破骨细胞分化，能够有效地利用于闭经期后骨质疏松症的治疗、改善和/或预防。
具体实施方式
以下，为了帮助理解本发明，举出实施例等进行详细的说明。但是，本发明的实施例可变形为其它多种形态，不应当解释为本发明的范围限定于下述实施例。本发明的实施例是为了向本领域普通技术人员更加完整地说明本发明而提供的。
参照例1：甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽的物质信息
化学式1：
物质名称：甘氨酸-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)
CAS No.：869-19-2
分子式：C8H16N2O3
分子量：188.22
购货处：Bachem AG公司(Bubendorf，Switzerland)
参照例2：L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的物质信息
物质名称：L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)
CAS No.：686-50-0
分子式：C8H16N2O3
分子量：188.22
购货处：Bachem AG公司(Bubendorf，Switzerland)
实验例1：透明质酸(Hyaluronicacid)合成促进效果
随着皮肤老化的进行，起到支撑皮肤结构的基本支柱作用的、由纤维组织组成的胶原蛋白和弹性蛋白(Elastin)发生固化，并成为不溶性。填充细胞间隙和胶原蛋白、弹性蛋白(Elastin)等纤维质间隙的物质称为基质，其保留水分的能力非常强，该基质中代表性的有透明质酸和粘多糖类(Mucopolysaccharides)等。透明质酸是广泛分布于关节液和皮肤等细胞内组织的多糖类。作为N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸结合的透明质烷(hyaluronan)的聚合物，具有保湿性和粘性。当随着老化的进行这种物质减少时，引发皮肤干燥症，皮肤的弹性会减弱(金润范，东医生理病理学会刊，2010；24(4)：533-542)。
为了确认甘氨酸-L-亮氨酸肽或L-亮氨酰甘氨酸的透明质酸合成效果，本发明人培养了人角质细胞(Normal human epidermal keratinocyte)后处理了试料。24小时后回收所培养的细胞培养基，然后使用透明质酸DuoSet ELISA试剂盒(Hyaluronan DuoSetELISA Kit)(DY3614)，测定从培养液生成的透明质酸并补正为蛋白质量。作为阳性对照组，使用了视黄酸(retinoic acid)。以未做任何处理的对照组作为100％，将实验结果示于图1中。
其结果，确认到甘氨酸-L-亮氨酸肽或L-亮氨酰甘氨酸肽即使在低浓度下也提高透明质酸的生成，其意味着有助于皮肤保湿而能够改善皮肤状态。另外,确认到当将甘氨酸-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)和L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)一起处理时，与单独处理的情况相比，进一步提高了透明质酸的生成。
实验例2：前胶原(Procollagen)合成的促进效果
前胶原作为胶原蛋白的构成成分，在成纤维细胞(fibroblast)、成骨细胞(osteoblast)等中被合成，并最终通过前胶原肽酶(peptase)转换成胶原蛋白。前胶原的增加与皮肤的结合力、弹性有关联性。
为了确认甘氨酸-L-亮氨酸肽或L-亮氨酰甘氨酸肽的前胶原合成促进效果，培养了人成纤维细胞(Normal human primary dermal fibroblast-Neonatal)后，处理了试料。24小时后回收培养的细胞培养基后，使用I型前胶原蛋白-C人前列腺抑制肽(PIP)试剂盒(Procollagen typeⅠ-C peptide(PIP)kit)测定了前胶原量。粘附于底面的细胞用DPBS洗涤后用1N的NaOH溶解(lysis)，并利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)测定了总蛋白质量，计算了每单位蛋白质的前胶原合成量。作为阳性对照组，使用了TGF-β。以未做任何处理的对照组作为100％，将实验结果示于图2中。
其结果，确认到甘氨酸-L-亮氨酸和L-亮氨酰甘氨酸肽提高了前胶原的合成，并基于此能够对皮肤弹性做出贡献。另外，确认到当将甘氨酸-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)和L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)一起处理时，与单独处理的情况相比，进一步提高了前胶原的合成。
实验例3：弹性蛋白酶(Elastase)阻碍活性
在皮肤的真皮组织内，胶原蛋白和弹性蛋白形成网状结构并使皮肤弹性保持，但是，由于年龄、紫外线等内外源压力，弹性、润泽减少，并通过过度表达的弹性蛋白酶，弹性蛋白的网状结构被破坏，导致皮肤松弛、形成皱纹，从而引发皮肤老化。因此，通过阻碍皮肤老化的主要原因之一的弹性蛋白分解酶的活性，即通过阻碍弹性蛋白酶的活性，能够抑制皮肤老化(李在元，韩国食品营养学会刊，2008，21(2)；143～147)。
96孔(well)中添加试料和溶解于50mM Tris-Hcl缓冲液(pH8.0)中的1U/ml猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase，Sigma，E1250)后，常温下使之反应30分钟。作为基质，添加了N-琥珀酰-(L-Ala)3-p-硝基苯胺后，在410nm下测定了从基质生成的p-硝基苯胺的生成量。以未做任何处理的对照组为基准，将实验结果示于图3中。
其结果，确认到甘氨酸-L-亮氨酸肽、L-亮氨酰甘氨酸肽、以及甘氨酸-L-亮氨酸肽与L-亮氨酰甘氨酸肽混合物(1:1)阻碍弹性蛋白酶的活性，确认通过阻碍皮肤老化的主要原因的弹性蛋白酶活性，能够抑制皮肤老化。
实验例4：试管实验
本发明人在评价包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)的组合物的疲劳改善、炎症改善或抗氧化效果、女性更年期症状改善效果之前，进行了试管实验。Bachem AG公司(Bubendorf，Switzerland)提供了甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)。如下述表1所示，制备了复合组合物并用于实验。
表1
实验例5：抑制前列腺素E2(PGE2)过度分泌带来的炎症改善及疲劳改善效果
细胞因子是在炎症反应时，主要在单核细胞(monocyte)、淋巴细胞(lymphocyte)、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell)、成纤维细胞(fibroblast)等中分泌的蛋白质，其如同神经递质作用于细胞膜的受体，或者如同激素作用于细胞内受体，起到传递细胞间信息的作用。以白细胞介素-1β、-2、-6(IL-1β、-2、-6)、IFN-γ、TNF-α为代表的炎症促进细胞因子，活化环加氧酶(cyclo-oxygenase-2，COX-2)，增加前列腺素E2(prostaglandine E2，以下称PGE2)并活化炎症细胞，从而诱导炎症过程(宋厚林等，韩国精神药物学会刊2013；24：5-10)。本发明人评价了抑制前列腺素E2(PGE2)分泌带来的抗炎效果。
首先，为了测定前列腺素E2(PGE2)，购买小鼠巨噬细胞RAW264.7(Mousemacrophage cell line，KCLB no 40071，Korean Cell Line Bank，Seoul，Korea)，并以2.5×106cells/ml的细胞浓度在96-微孔板(well microplate)上，每孔分注100μl。培养基使用了添加10％FBS(GibcoBRL，Grand Island，NY，USA)和1％青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin，Thermo Scientific Hyclone，Waltham，MA，USA)的DMEM(GibcoBRL，GrandIsland，NY，USA)培养基，在5％CO2、37℃环境下进行了培养。在分注了上述RAW 264.7细胞的细胞培养液中，处理脂多糖(LPS，Lipopolysaccharide)(Sigma，St.Louis，MO，US)1μg/ml，以诱导炎症，并根据上述实验例1进行了处理。然后，24小时培养细胞，在900rpm、4℃下离心分离5分钟后，回收细胞培养液，确认了培养液中生成的前列腺素E2(PGE2)的分泌量。利用商业可购买的前列腺素E2检测试剂盒(PGE2ELISA kit，MyBioSource Co.，Ltd.，SanDiego，CA，USA)，并根据制造商的指南，测定了前列腺素E2(PGE2)。
其结果，如图4所示，通过脂多糖诱发了炎症的巨噬细胞中，与未诱发炎症的细胞相比，增加了大量前列腺素E2(PGE2)，而在试料处理的细胞中重新减少。另外，与处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1μg/ml或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1μg/ml(实施例1、实施例3)时相比，分别处理10μg/ml(实施例2、实施例4)时的前列腺素E2(PGE2)的浓度进一步减少。尤其是，确认到：与单独处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽(实施例1至4)的细胞相比，处理复合组合物(实施例5、实施例6)的细胞中前列腺素E2(PGE2)的分泌量进一步减少。
该实验例2的结果表明，包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)的组合物，在炎症被诱发的巨噬细胞中，抑制了促进炎症的前列腺素E2(PGE2)分泌，显示出有效的抗炎效果，进而表明能够显示出疲劳改善功能。
实验例6：基于DPPH自由基清除活性的抗氧化效果
DPPH(2,2-二苯基-1-三硝基苯肼、2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)是紫色稳定的自由基，当与抗氧化剂反应时，接收氢而被还原褪色的物质。利用该原理，比较试料的DPPH自由基清除活性，由此能够评价它们的抗氧化能力。自由基清除活性(％)越高，则表明试料的抗氧化能力越强。
在DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除活性中，首先，将4mgDPPH溶解于100ml甲醇中制备DPPH溶液，并将实验例1的组合物以不同浓度在乙醇中稀释。将包含复合组合物的1ml乙醇和1ml DPPH溶液均匀混合后，在37℃下静置30分钟后，然后在516nm下测定了吸光度。作为对照组，使用了乙醇。
通过下式计算了基于DPPH自由基清除活性法的抗氧化能力。
数学式1：
DPPH自由基清除活性＝100-(试料的吸光度/对照组的吸光度)×100
其结果，如图5所示，当处理试料时，DPPH自由基清除活性增加。另外，与处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1μg/ml或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1μg/ml(实施例1、实施例3)时相比，分别处理10μg/ml(实施例2、实施例4)时的DPPH自由基清除活性得到了进一步提高。尤其是，确认到：与甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的单独试料(实施例1至4)相比，复合组合物(实施例5、实施例6)试料中DPPH自由基清除活性得到了进一步提高。
该实验例3的结果表明，包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)的组合物抑制氧化压力，因此，可有效地用作抗氧化功能性材料。
实验例7：动物实验
为了动物实验，本发明人从Dhbiolink公司(大田，大韩民国)购买了雄性ICR小鼠(4周龄)。实验动物在保持温度22±1℃、湿度55±10％的饲养室中，每个笼子饲养了5-10只。Bachem AG公司(Bubendorf，Switzerland)提供了甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽，在蒸馏水中溶解后使用。作为对照组，仅口服给药蒸馏水。甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽摄取组利用口服用探针(sonde)，一天口服给药一次，共21天。每组给药的组合物的种类和浓度如下述表2所示。使每组的小鼠一周一次、一次运动30分钟，共运动3周，诱发了疲劳。运动速度为：初期10分钟是以10m/min、接着10分钟是以16m/min、最后10分钟是以21m/min的速度运动。第21天，初期5分钟以10m/min运动，之后每3分钟提高3m/min速度，如此运动30分钟后，牺牲小鼠并用于分析。
表2
实验例8：防止肌肉内乳酸的蓄积带来的疲劳改善效果
当氧气充分供给于细胞的情况下，TCA循环能够顺利进行，使血液中乳酸浓度保持0.56-2mmol/L的范围，不会蓄积该范围以上。但是，当相应的作用和TCA循环的代谢联系不能以当量比进行，且相应的作用相对活泼的情况下，或者氧气供给量小于细胞所需要的氧气量的情况下，肌肉内生成乳酸。另外，高强度运动时，当氧气供给量小于肌肉的氧气消耗量时，肌肉组织的乳酸浓度增加，此时生成的乳酸向血液扩散并在心脏和肝中被处理，因此，因运动而蓄积乳酸时，会导致体内酸性化从而诱发疲劳。运动中，参与糖代谢的磷酸化酶活性减小，其结果，在无氧状态下成为运动能量源的葡萄糖新生被抑制。在多种疲劳改善效果评价中，本发明人确认了表示疲劳状态的肌肉内乳酸和肌酸激酶(CK)蓄积的抑制。
其结果，如图6所示，在诱发疲劳的小鼠模型中，当口服给药甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽(实施例7至10)时，与对照组(比较例2)相比，肌肉内蓄积的乳酸浓度显著地减少。尤其是，确认了与摄取甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1mg/kg/天或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1mg/kg/天(实施例7、实施例9)的情况相比，分别摄取10mg/kg/天(实施例8、实施例10)时的乳酸的浓度进一步减少。
即，确认了在诱发疲劳的个体中，摄取甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽能够使肌肉内乳酸的蓄积减少，从而能够显示疲劳改善效果。
实验例9：防止肌肉内肌酸激酶(CK)的蓄积带来的疲劳改善效果
肌肉细胞受损时，肌肉中大量存在的酶向血液释放而生成能源。肌酸激酶(CK)起到合成磷酸肌酸(creatine phosphate)的作用，该磷酸肌酸是运动中的肌肉细胞中无氧时ATP再合成(从ADP和磷酸肌酸(phosphocreatine)合成ATP的过程)所需要的物质。
为了测定肌肉内肌酸激酶(CK)，如实验例4，诱发小鼠的疲劳，采取组合物给药后的每组小鼠的肌肉组织并利用于分析。肌酸激酶(CK)利用分析试剂盒(Abcam，Cambridge，UK)，并根据制造商的指南进行测定。
其结果，如图7所示，在诱发疲劳的小鼠模型中，当口服给药甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽时(实施例7至10)，与对照组(比较例2)相比，肌肉内蓄积的肌酸激酶(CK)浓度显著地减少。尤其是，确认了与摄取甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1mg/kg/天或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1mg/kg/天(实施例7、实施例9)相比，分别摄取10mg/kg(实施例8、实施例10)时，肌酸激酶(CK)的浓度进一步减少。
即，确认了在诱发疲劳的个体中，甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的摄取减少肌肉内肌酸激酶(CK)的蓄积，从而能够显示出疲劳改善效果。
实验例10：减少血液内细胞因子带来的炎症改善效果
典型的细胞因子有白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、趋化因子(chemokine)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等，其中，作为炎症促进(pro-inflammatory)细胞因子，有白细胞介素-1β、-2、-6(IL-1β、-2、-6)、IFN-γ、TNF-α等；作为抗炎(anti-inflammatory)细胞因子，有IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-β等。本发明人在炎症改善效果评价中，确认了作为促进炎症的蛋白质的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)分泌抑制。
首先，为了测定血液内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)，如实验例4，诱发疲劳并采取了组合物给药后的每组小鼠的血液。将所采取的血液在常温下放置30分钟后，在6000rpm下离心分离20分钟而分离了血清。将所分离的血清，用0.45μm的注射器过滤器(syringe filter)进行过滤并用于分析。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)利用商业可购买的TNF-α和IL-6ELISA试剂盒(Thermo Scientific Co.，Waltham，MA，USA)，并根据制造商的指南进行了测定。
其结果，如图8所示，在诱发了疲劳的小鼠模型中，口服给药甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽时(实施例7至10)，与对照组(比较例2)相比，血液内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度显著地减少。尤其是，确认了与摄取甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1mg/kg/天或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1mg/kg/天(实施例7、实施例9)相比，分别摄取10mg/kg/天(实施例8、实施例10)时，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度进一步减少。
另外，如图9所示，在诱发了疲劳的小鼠模型中，口服给药甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽时，与对照组(比较例2)相比，血液内白细胞介素-6(IL-6)浓度显著地减少。尤其是，确认了与摄取甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1mg/kg或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1mg/kg(实施例7、实施例9)相比，分别摄取10mg/kg(实施例8、实施例10)时，白细胞介素-6(IL-6)的浓度进一步减少。
即，确认了在诱发疲劳的个体中，甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的摄取，减少血液内炎症性细胞因子的浓度，从而能够显示出疲劳改善效果。
实验例11：血液内超氧化物歧化酶(SOD)增加带来的抗氧化效果
超氧化物歧化酶(SOD)是催化超氧化物(Superoxide)转换为氧和过氧化氢(H2O2)的反应的抗氧化酶，在血液中起到去除自由基的作用。血液中SOD的增加，能够减少肌肉内疲劳感。为了评价抗氧化效果，本发明人确认了起到体内抗氧化功能的超氧化物歧化酶(SOD)的增加。
为了测定血液内超氧化物歧化酶(SOD)的水平，如实验例4，诱发疲劳，从组合物给药后的每组小鼠中获得血清，并用于分析。超氧化物歧化酶(SOD)是利用分析试剂盒(Abcam，Cambridge，UK)，并根据制造商的指南进行了测定。
其结果，如图10所示，在诱发了疲劳的小鼠模型中，口服给药甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽时(实施例7至10)，与对照组(比较例2)相比，血液内超氧化物歧化酶(SOD)浓度显著地增加。尤其是，确认了与摄取甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1mg/kg或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1mg/kg(实施例7、实施例8)相比，分别摄取10mg/kg(实施例8、实施例10)时，超氧化物歧化酶(SOD)的浓度进一步增加。
即，确认了在诱发疲劳的个体中，甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽的摄取提高血液内超氧化物歧化酶(SOD)浓度，从而能够显示出抗氧化效果。
实验例12：雌激素受体活性评价
“更年期症状”是指，由于卵巢的老化等，随着雌激素分泌的减少，闭经前后在女性身上诱发的多种症状。
为了确认两种化学式1和化学式2的二肽(dipeptide)对雌激素受体的活性，进行了ERE(雌激素反应元件，estrogen response element)报告实验。使用添加10％FBS的DMEM培养基，在24孔板中24小时培养293T细胞后，每孔用5％活性炭处理胎牛血清无酚红培养基(charcoal stripped FBS containing phenol red free medium)500μL交换培养基，并进行了转染(transfection)。每孔使用脂质体转染试剂(reagents)(赛默飞世尔科技公司，Thermo Fisher Scientific)转染了ERa0.1ug、ERE 0.1ug、pRL-Tk 10ng的DNA。转染4小时后，处理实验例1的组合物。作为阳性对照组处理了1ppb(DMSO 0.5μL)的17β-雌二醇(17β-estradiol)(E2)，作为阴性对照组(control,ctrl)处理了等量的DMSO(0.5μL)。试料处理24小时后，使用双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Reporter Assay System，Promega)，测定了发光程度(冷光)，并以阴性对照组的测定值作为基准(1.0)。对相应的测定值，将荧火虫荧光素酶(firefly luciferase)数值补正为海肾荧光素酶(renilla luciferase)数值。
其结果，如图11所示，当处理试料时提高了雌激素受体活性。另外，与处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1μg/ml或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1μg/ml时相比(实施例1、实施例3)，分别处理10μg/ml(实施例2、实施例4)时，雌激素受体活性进一步增加。尤其是，能够确认与甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽(实施例1至4)的单独试料相比，复合组合物(实施例5、实施例6)试料中，雌激素受体活性得到了进一步提高。
实验例13：抑制破骨细胞分化效果
到了更年期，由于对骨代谢起重要作用的女性激素不再从卵巢分泌，因此，骨转换中发生变化，虽然造骨细胞制造新骨而填充破骨细胞溶解的部位，但不能完全填充，导致骨质流失。30岁以后骨质慢慢开始流失，对于男性而言，骨密度逐渐下降，最多损失骨量的20-30％左右，另一方面，对于女性而言，50岁以后，即更年期以后的约10年骨密度急剧下降，之后则缓慢下降，因此女性比男性更快且更严重地出现骨质疏松症。
在试管内，通过作为特定细胞因子(cytokine)的NF-κB配体(ligand)的激活剂(activator)(RANKL，RANK ligand)，能够从巨噬前体细胞生成破骨细胞，若进行TRAP染色，则在未进行RANKL处理的对照组中，RAW264.7细胞在保持球状的状态下增殖，并在TRAP染色中也显示阴性反应而呈现浅褐色或黄土色。与此相比，处理RANKL的细胞中，能够观察到染色为深暗褐色至赤褐色的TRAP(+)多核细胞。
为了确认两种化学式1和化学式2的二肽对由NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导的破骨细胞分化的影响，将上述实验例5中培养的RAW264.7细胞使用于实验。将RAW264细胞以2.5×106cells/mL的细胞浓度分注于96-微孔板的每孔100μL后，培养5小时，使细胞粘附在孔后，去除培养基，在添加10％FBS的α-MEM培养基中，分注了将作为破骨细胞分化因素的RANKL50ng/mL和实验例1的组合物相混合的培养液，并培养了7天。为了评价对破骨细胞分化的影响，对所培养的细胞实施了抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色，将染成红色的细胞视为破骨细胞，并测定了其数量。
其结果，如图12所示，处理试料时破骨细胞分化得到了抑制。另外，与处理甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽1μg/ml或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽1μg/ml(实施例1,实施例3)时相比，分别处理10μg/ml(实施例2、实施例4)时破骨细胞进一步减少。尤其是，能够确认与甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)肽或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)肽(实施例1至4)的单独试料相比，复合组合物(实施例5、实施例6)试料中破骨细胞的分化进一步得到了抑制。
上述实验例12、实验例13的结果表明，包含甘氨酰-L-亮氨酸(Glycyl-L-Leucine)和/或L-亮氨酰甘氨酸(L-Leucylglycine)的组合物，增加雌激素受体的活性，并通过抑制闭经期后骨质疏松症的诱发因素的破骨细胞分化，能够有效地应用于女性更年期症状。
本发明所属技术领域的普通技术人员应当理解，在不改变本发明的技术思想、必要技术特征的状态下，能够以其它具体形态实施本发明。与此应当理解以上记述的实施例在所有方面是示例性的，而不是限定性的。本发明的范围应当由所附的权利要求书的含义和范围来解释，需要说明的是，由权利要求书的等价概念推导出的所有变更、变形均包含在本发明的范围内。

Claims (16)

1.一种皮肤弹性改善、皮肤保湿或抗皮肤老化用的食品组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的盐，
化学式1
化学式2：
2.一种皮肤弹性改善、皮肤保湿或抗皮肤老化用的化妆材料组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的化妆学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
3.一种皮肤弹性改善、皮肤保湿或抗皮肤老化用的药学组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的药学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
4.一种皮肤弹性改善、皮肤保湿或抗皮肤老化用的类药品组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的药学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，
上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物的盐是指标成分。
6.一种疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的食品组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的盐，
化学式1：
化学式2：
7.一种疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的化妆材料组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的化妆学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
8.一种疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的药学组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的药学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
9.一种疲劳改善、炎症改善或抗氧化用的类药品组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的药学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
10.根据权利要求6至9中任一项所述的组合物，其中，
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物、或者由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的盐是指标成分。
11.一种女性更年期症状的治疗、预防或改善用的功能性食品组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的盐，
化学式1：
化学式2：
12.一种女性更年期症状的治疗、预防或改善用的化妆材料组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的化妆学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
13.一种女性更年期症状的治疗、预防或改善用的药学组合物，包含：
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的药学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
14.一种女性更年期症状的治疗、预防或改善用的类药品组合物，包含：
由下述以化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物；或者
由下述以化学式1表示的化合物和/或由下述化学式2表示的化合物的药学上可接受的盐，
化学式1：
化学式2：
15.根据权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中，
上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物、或者上述由化学式1表示的化合物和/或由化学式2表示的化合物的盐是指标成分。
16.根据权利要求11至14中任一项所述的组合物，其中，
所述女性更年期症状是选自由颜面潮红、出汗、神经质、忧郁症、眩晕症、疲劳感、关节痛、肌肉痛、头痛、心悸、蚁走感、盗汗、睡眠障碍、皮肤干燥、阴道干燥症、阴道萎缩、下尿路萎缩、性交痛、阴道炎、膀胱炎、排尿痛、尿急、注意障碍、记忆障碍、焦虑、神经过敏、记忆力减退、皮肤干燥、关节痛、骨质疏松症、心脏病、高血压以及脑卒中构成的组中选择的任一种。
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