CN107881138A - 中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法，属于生物医药技术领域，基于失活安丝菌素N位糖基转移酶表达基因来提高安丝菌素发酵水平，通过在珍贵束丝放线菌ATCC31280中失活N位糖基转移酶基因ansa30（与珍贵束丝放线菌ATCC31565中的asm25基因具有97%同源性），减少该途径对安丝菌素生物合成的分流，实现安丝菌素产量的提高。本发明所得到的突变株NXJ‑22安丝菌素的发酵终产量对比野生型菌株则提高68%，实验室摇瓶水平达到74mg/L。

Description

中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体说是一种高产安丝菌素的菌株以及该菌株的制备方法，该方法主要是通过敲除珍贵束丝放线菌ATCC31280基因组中N位糖基转移酶的表达基因ansa30，以消除N位糖基化对N位甲基化途径的竞争作用，使氨甲酰化安丝菌素糖苷ACGP-3积累消失，而代谢流更多的流向目标产物，从而提高了安丝菌素的产量。

背景技术

安丝菌素(又名安丝霉素或安莎霉素)是由珍贵束丝放线菌（Actinosynnemapretiosum）产生的一种大环内酰胺类抗生素，属于微生物来源的美登素类分子，其组分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4 和P-4'，其中安丝菌素P-3（AP-3，1）为主要发酵产物，安丝菌素能够与微管蛋白的β亚基结合，通过阻碍微管形成，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著的抗肿瘤作用。例如，ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯链上连接二硫键形成的DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体结合分子。目前，安丝菌素多种DM1抗体结合分子已经进入不同的临床实验阶段。其中，由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的Trastuzumab Emtansine（即T-DM1）已经成药上市。

现有技术中，其中一种安丝菌素生物合成的方法主要包括起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）的合成（葡萄糖为前体），随后在I型聚酮合酶（PKS I）催化作用下，加载7个延伸单元-3个乙酸单元（丙二酰CoA提供），3个丙酸单元（甲基丙二酰CoA提供），1个糖基（Glycolate）延伸单元（2-羟甲基-ACP提供，来源于糖酵解途径），形成十九元大环内酰氨，最后经过一系列的后修饰过程，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、环氧化、N-甲基化（SAM依赖）形成安丝菌素。但是，其中由糖基转移酶ansa30催化的N-糖基化反应为N-甲基化反应的竞争途径，导致ATCC31280液体发酵液中，分支产物-氨甲酰化安丝菌素糖苷ACGP-3（4＂-O-carbamoyl-ansamitocinoside P-3）积累。副产物的形成影响了目标产物的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产安丝菌素的菌株、该突变株的制备方法以及通过该突变株高产安丝菌素的方法。该突变株基于中断N-甲基转移酶表达基因ansa30的表达，以消除代谢途径中N糖基化对N甲基化的竞争，将代谢流更多地导向目标产物的合成，从而提高安丝菌素的产量。

为此，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种中断缺失的高产安丝菌素的菌株，其技术要点是：所述菌株的N位糖基转移酶基因ansa30不表达。

进一步的，突变株（NXJ-22）由菌株ATCC31280制备得到。

另一方面，本发明还提供了该中断缺失的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

步骤1）构建用于ansa30中断缺失的同源重组质粒载体；

步骤2）将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌中进行同源重组；

步骤3）通过验证硫链丝菌素抗性或PCR产物片段大小的差异的方法筛选ansa30基因中断缺失的突变株。

进一步的，质粒载体由质粒pJTU1278制备。

进一步的，受体菌为ATCC31280。

进一步的，步骤1）中，由两组引物通过PCR扩增得到ansa30中断区域左侧及右侧的同源臂。

进一步的，步骤1）中，在质粒SpeI/HindIII位点插入中断区域左侧1440bp的PCR片段 (SpeI/EcoRI)，在中断区域右侧1465bp的PCR片段(EcoRI /HindIII)。

左同源臂的序列为：

CCGACGACTGACCCGCCACCGGGGACGGGGGCCGACCGGAATCCCGGTCGGCCCCCGTCCGCGTTCCAGGGGGGGGCGAGTCACGCGGGTTCAGGACCGGGCCGCGCGCACCCCGTCCCGCACCGCCCCCGTCACCCGGTGCGCCCCGCTCACCAGCGAGGTCACCAGCTCCCCCGGCCTGGGCGCCCGAGCCAGCAGCGCCGTCACCGGGCTGGACTCCAGCACCCGCCCCGGATACGCCCCGTGCACCCGCCCGTCCTCGTCCACCGGCGAGTCCACGTTGTCCACGCCGTTGTCCGGCAGCTCCGACCGCATCCCCGACCGGCCGACCGCGCGCACCGACATCAGCGCGTCCGTGAGCGCCGGGAACAGCCGCTGCCCCAGGTAGAACGCGAGCGCCGCGTCACCCACCGGCACCTCGCGGCGGGGGCGTTCGGCGGCGCGCAGCACGGCCTCAGCGACCAGCTCCGGCGCGTACACCGGAGGCGGCGGCTCGGGCAGCGAGCCGACGCGGCTGCGGCAGTGCTCGAAGAACGGGCTGTTGATCGCGGCGGGCAGCACGGCGGTGACCGCGATCGGCTCGCCGTCGTGGGCCAGCTCCACCCGCAGCGCGTCGTAGAACGCCCGCACCGCCGCCTTGCTGGCCGCGTACGGGGCCTGGAGCGGCGCCGAGCGCAGCCCGAGCACGGACGCGACCCCGATCAGCACTCCTCCGCCCGCCCGGCGCAGCGCGGGCAGCGCGGCCTTGGCCCCGTGCACGTGCCCGAGGTAGTTGACCCGCATCACCCGGTCGAACTCCTCGGCGGGGGTGTCCTCCACCCGCCCGTACACGCCGATCCCGGCCGCGTTCACCCAGGTGTCCACCCGCCCGAACCGCTCCACCGCCACCTCGGCGACCGCGCGCACCGCGGCCTCGTCGGCGATGTCCGCCGTCACCGCGACCGCAGGCCCACCCGCGTCCCGGACCTCCTCGACCAGCCCGTCGAGCGCGCGGGTGTTGCGCGCCGCGCACACCACGCGCGCCCCCGCCGCCGCGAACCGCAGCGCGGTGACCCGCCCGATCCCCGACGACGCGCCCACCACGACGACGACCTGCTCCGCCAACCTCCTGGGCATGTGACCTCTCCGTCCCGGATCGTGAAATGCGGCGGGTACCCGGCGGGAGGCCGTCCACGCGTCCCGGAGGGATGGTCCGCGCGGACGGCGGGTGGTCCGGATCGGAGGCGGGCCCTCGACCCCGGCAGTCCGATCAGCGCACGACCGACCAGGGCGCGGCCGTCCAGCGCACGACCATCCAGCACGCGACCGACCAGGGCGCGACCGACCAGCACGCGGCCGTCCGCCCCGGACCCGGACACCCGGCACCCCGCACGGCCCGCGCGGTCACACCGCCGCGACGCTCCGCGCGGCCTCCGCGATCTGCTCCAGGCGGGTCACCAC；

或者/和右同源臂的序列为：

GACGGTCAGGCAGGGCAGCCCGCGCTCCTCCGCGACGAGCAGCCCGGCCAGCTCCATGCCGTCGCGCAGGACCAGGTCGGGCCGGAAGCGGTCGACGACGGGGCGCAGCCCGGCCAGCGCCTCCCGCAGCAGCGGCCTGCCCGCGATGACGTCGACGATCGCGTCGACGCCGGGGTAGTCGGTGCCCGGCCTGGCCGGTGGCACGACGCCCCCGAGCCGCTCCACCCAGAACCTCGCCTGGTCGGGCAGCGCCTCGACCGAGGGCAGGCCGCTGCCCCGCAGGCCCGGTGCGGCGCTGGGGGCCGTGGCCACGAGCACCTCGTGCCCGGCGTCCAGGACCGCGCGCCCGAGCACGAGCATCTCGTGCGCGTGCGACGGGGCCCCGGTGACGGTGAACAGAACGCGCAACTGTCTTCCTCCGTGCTGGGGCCCGCCGCGCGGCGGGCCCCGGTGGTGAAGGGCCGCGGGTGCGGCCCCGAACCGGTCAGGTCCGCTCGGCGCGGCCCAGCCGGGTGTCGATGAACTCGAACAGCTCCGCCACGCCCGCGTCCCGGAGCGCGGCCCCGCCGTCGGGCTCGCCCTGGTCCTCGTCGGACAGGGCGGCGAGCAGGGCGCGCAGCCTGGCGGCGGCGCTCGCGCGCAGCGCGGGGTCGGCGGGCGGGTCGGCGAGCGCGGCCTCCAGGCGGTCCAGGCCCGAGGTCACCGGGTCGCCGCCGTCGAGCAGCCCCGCCAACACGGCGGCGACCTCGGCCGCCGTCGGGTGGTCGAACAGCAGGGTCGCGGGCAGGGTCAGGCCGGTGGCGGCGGCCAGGCGGTCGCGCAGCTCCACCGCCGTCATCGAGTCGAACCCCAGGTCCCGGAACGCGGCCCGCCCGTCCACCGAACCGTCGGCGCGGCCCAGCACGGCGGCGGCGTGGTCGCGCACCAGCGCCAGCAGCACCCGGTCCCGGTCCGGGCCGGTCAGGTCGACCGCGCTCGGCTCCGGGGCGCTCCGCTGCTCGGGCAGCGCCACCCCTGGCAGCGCCCCCTCGGACAGCACTCCCCCGGACAGCGCGGCTTCCGACGTCCGCGCGAACACGACCACGCCCAGCTCCGGGCTCAGCGGCGGCACACCCGGTCCCGCGCACAGCAGGGTCGCGGGCAGGCCGTCCTCGTGGCGGCGGCGCACGAGCGCGGCCAGCACCCCGGCGGCCACCGCGTCCTCGGGGCGCGCCGCGTCGCCGAGCGCGCCCGCCGGGCCGCACAGCGCGAACAGCGCGGGCGGCCGGTCGCGGGTCAGCTCGTCCAGCAGCGCGGCCCGCGCCAGGCCCGCGTCGTCCGGCTCGACGGCGAGCACCACCCAGTCCGGGCGGTGCCCCTCCAGCGCGGCCACCAGCTCCTCCCTGCCGGGGTCGGCGGGCAGCACGACCGGTTCGCGCACCCCGCAGGCCGCCACCACGCCGCGCGCCGCCTCCCCGACCACCAG。

此外，本发明还提供了一种采用上述突变株制备安丝菌素的方法，其技术要点是，包括以下步骤：将突变株的菌丝体移入一级种子培养基中，30℃ 220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃ 220r/min条件下培养24h；按10%接种量转接至发酵培养基发酵7d。

进一步的，上述安丝菌素的制备方法中：

一级种子培养基包括TSB3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；

或者二级种子培养基包括TSB3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；

或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，MgCl₂2mM。

本发明的有益效果：现有技术中，野生型菌株通常选用珍贵束丝放线菌ATCC31565，该菌种在固体培养基中培养时安丝菌素糖苷AGP-3积累。本发明的野生型菌株选用珍贵束丝放线菌ATCC31280，其在液体培养基中培养时氨甲酰化安丝菌素糖苷ACGP-3积累。二者出发菌株、培养条件和副产物积累均不同。ATCC31565的asm25中断缺失所用质粒为pHGF9053，而本发明中，ATCC31280的ansa30基因中断缺失所用质粒为pJTU1278。

ATCC31565的糖基转移酶基因为asm25，而本发明中，ATCC31280的ansa30基因编码糖基转移酶，虽然，二者序列有97%同源，但却产生了显著的区别。具体而言，虽然ATCC31565中asm25中断缺失后， AGP-3积累消失，但是并未涉及AP-3产量变化。而本发明中，ATCC31280的ansa30中断缺失后，ACGP-3积累消失，使AP-3产量显著提高了68%。

综上所述，本发明通过在染色体上置换的方法，使得ansa30基因中断缺失，消除N位糖基化反应对N位甲基化反应的竞争，使得代谢流更多地流向目标产物以此来提高安丝菌素产量，最终安丝菌素产量对比野生型菌株提高了68%，达到至少74mg/L。因此，通过本发明可显著提高安丝菌素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

附图说明

图1为野生型菌株ATCC31280中ansa30基因失活得到突变株NXJ-22示意图；

图2为ansa30中断缺失菌株的PCR验证结果示意图；

图3为突变株NXJ-22与野生菌株ATCC31280的安丝菌素的产量对比示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。虽然以下给出了本发明优化的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备基因ansa30中断缺失的突变株NXJ-22的具体过程。具体包括以下步骤：

步骤1），构建质粒pLQ578：以珍贵束丝放线菌ATCC31280的基因组DNA为模板，分别使用两组引物DEL30-L-F/DEL30-L-R、DEL30-R-F/DEL30-R-R通过PCR扩增得到ansa30中断区域左侧1440bp的同源臂以及右侧1465bp的同源臂，通过基因测序确认同源臂的正确性。在质粒pJTU1278的SpeI/HindIII位点插入来自中断区域左侧1440bp的PCR片段(SpeI/EcoRI)和中断区域右侧1465bp的PCR片段(EcoRI/HindIII)。由此得到用于ansa30基因失活的质粒pLQ578，酶切验证表明质粒构建正确。

*步骤1）中左右同源臂基因片段制备所采用的PCR体系及条件：

PCR反应体系为：DNA模板30ng，引物30pmol，50%DMSO 3mL，25mM Mg²⁺ 2mL，缓冲液3mL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至30mL；

PCR条件为：95℃5min；95℃30s；60℃ 30s；68℃ 90s；循环30次；68℃10min。

*步骤1）所用到的引物碱基序列如下：

*本发明涉及的各内切酶识别位点（酶切位点）如下：

步骤2）将质粒pLQ578导入野生型菌株ATCC31280进行重组，并通过筛选得到ansa30中断缺失突变株。具体包括以下步骤：

将质粒pLQ578通过接合转移导入宿主ET12567 (含有质粒pUZ8002)中。取制得的ET12567于含有Amp、Kan和Chl三种抗生素的LB溶液中，37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10%的比例转接一次并培养2.5h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时制备野生型菌株ATCC31280的新鲜菌丝体（约16h培养物），用LB溶液洗2~3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567混合(菌丝体细胞和宿主菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mMMg²⁺的YMG平板，待YMG平板吹干后转移至37°C培养箱倒置培养12h后取出平板，分别取硫链丝霉素和萘啶酮酸两种抗生素的储存液30mL和40mL加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在YMG平板上，将平板晾干后转移至30°C培养箱中培养。一般3~5d后可见平板上有单菌落接合子长出，将其通过平板涂布于含有硫链丝霉素和萘啶酮酸两种抗生素的YMG平板扩大培养（此时生长的一般为单交换接合子），将平板扩大培养的接合子挑取少量至无抗的TSBY溶液进行两轮松弛，利用引物Del30-F/R，通过菌丝体PCR验证接合子，其中PCR若只有一条带（1194bp），为回复成野生型的菌株，若含有450bp的一条带，则为双交换突变株，若含有450bp和1194bp两条带，则为单交换突变株。其中双交换突变株即为ansa30基因中断缺失的突变株。

如图2所示，泳道1~3分别为三个接合子PCR条带，泳道1和泳道2含有450bp一条带，为双交换突变株；泳道3含有两条带，为单交换突变株；ET为正对照；WT为野生型（ATCC31280）对照（1194bp）。

*步骤2）中突变株筛选是所采用的PCR体系及条件：

PCR体系：DNA模板10~100ng，引物30pmol，50%DMSO 3mL，缓冲液3mL，Taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30mL；

PCR条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；72℃1min；循环30次；72℃10min。

*步骤2)中所用到的引物碱基序列如下：

通过上述过程，质粒pLQ578将野生型菌株ATCC31280中的ansa30基因内部区域失活，即可得到ansa30中断突变株NXJ-22。

实施例2

本实施例为通过ansa30中断缺失的突变株生物合成安丝菌素的发酵过程。具体包括以下步骤：将突变株（NXJ-22）涂布于固体YMG培养基活化，30℃培养2d后，挑取少量菌丝体接种至一级种子培养基，30℃ 220r/min培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃220r/min条件下培养24h；按10%接种量转接至发酵培养基发酵，7d后收集发酵液进行萃取，并使用安捷伦公司的Agilent1200系列对萃取后的化合物进行HPLC分析。其中，HPLC的流动相为甲醇和水溶液。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

图3为ansa30基因缺失菌株NXJ-22与野生型菌株ATCC31280安丝菌素发酵水平检测。结果表明ansa30基因中断缺失之后，安丝菌素的发酵产量和出发菌株相比提高68%，终产量可达74mg/L。

本发明所涉及的质粒pJTU1278已经在SCI数据库文献《He Y，Wang Z，Bai L，LiangJ，Zhou X，Deng Z: Two pHZ1358 derivative vectors for efficient gene knockoutin Streptomyces. Journal of Microbiology and Biotechnology 2010，20(4):678-682.》中记载。

本发明所涉及的菌株ATCC31280已在文献《PAN WenQin, KANG QianJin, WANGLei, BAI LinQuan & DENG ZiXin:Asm8, a specific LAL-type activator of 3-amino-5-hydroxybenzoatebiosynthesis in ansamitocin production.Science China LifeSciences 2013(7)：601-608》中记载。

序列表

<110> 辽宁斯韦尔生物科技有限公司

上海交通大学

<120> 中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法

<130> 17-0836

<141> 2017-09-25

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1209

<212> DNA

<213> 珍贵束丝放线菌ansa30(Actinosynnema pretiosum)

<400> 1

ttgcgcgttc tgttcaccgt caccggggcc ccgtcgcacg cgcacgagat gctcgtgctc 60

gggcgcgcgg tcctggacgc cgggcacgag gtgctcgtgg ccacggcccc cagcgccgca 120

ccgggcctgc ggggcagcgg cctgccctcg gtcgaggcgc tgcccgacca ggcgaggttc 180

tgggtggagc ggctcggggg cgtcgtgcca ccggccaggc cgggcaccga ctaccccggc 240

gtcgacgcga tcgtcgacgt catcgcgggc aggccgctgc tgcgggaggc gctggccggg 300

ctgcgccccg tcgtcgaccg cttccggccc gacctggtcc tgcgcgacgg catggagctg 360

gccgggctgc tcgtcgcgga ggagcgcggg ctgccctgcc tgaccgtccc ctcgggcacg 420

acgaaccagc tcgacccggc cgccgtgctg ccccggctca acgagcgccg cgccgagcag 480

gacctgccca cctcggccga cccgctcagc gcgcaccggc acggccacgt cgactgcctg 540

ccgcgcgagt actccctgct cggcgtcccg ctcagcccct gcctggccta ccggccgccg 600

tcgcccgagg gccggtcgct gcccgcgtgg ctggcagacc tggacccgtc ccgcccgctg 660

gtgtacgggg cggtcggcat cgcgctggcc gccacctggc gccgcgacga cgtgaccgcg 720

ctggccgccg acccggtgga ggcgctgagc ggcctcgtgg ccgcgctgtc cgaggtggac 780

tgcgccgcgg tggtgtccac cggcggcatc ccggtcgacc gcgtcccgcc gggcgcgccg 840

cacgtgcgcg tggtcgagcg ggcgccccag ccgctgctgc tggagtgcgc gcagctgttc 900

gtcacccacg ccggggccaa cagcgtgcgc gaggcggtgc gggcgggggt gccgatggtc 960

gccgccccgc tgttcggcga ccagccgcac aacgccgcca gggtcgccgc gctggggctg 1020

ggcgtgcggg tggtggacgg ctcgcccgcc gacctggcgg acgcctgccg gaccgtgctg 1080

gccgatcccg gtttcaccgc cagggcgcgc cacgcgcgcc ggaccctgct cgcgctgcct 1140

ccggtgggcg aggtggtgac ccgcctggag cagatcgcgg aggccgcgcg gagcgtcgcg 1200

gcggtgtga 1209

<210> 2

<211> 1440

<212> DNA

<213> 左同源臂(PCR片段质粒SpeI/HindIII)

<400> 2

ccgacgactg acccgccacc ggggacgggg gccgaccgga atcccggtcg gcccccgtcc 60

gcgttccagg ggggggcgag tcacgcgggt tcaggaccgg gccgcgcgca ccccgtcccg 120

caccgccccc gtcacccggt gcgccccgct caccagcgag gtcaccagct cccccggcct 180

gggcgcccga gccagcagcg ccgtcaccgg gctggactcc agcacccgcc ccggatacgc 240

cccgtgcacc cgcccgtcct cgtccaccgg cgagtccacg ttgtccacgc cgttgtccgg 300

cagctccgac cgcatccccg accggccgac cgcgcgcacc gacatcagcg cgtccgtgag 360

cgccgggaac agccgctgcc ccaggtagaa cgcgagcgcc gcgtcaccca ccggcacctc 420

gcggcggggg cgttcggcgg cgcgcagcac ggcctcagcg accagctccg gcgcgtacac 480

cggaggcggc ggctcgggca gcgagccgac gcggctgcgg cagtgctcga agaacgggct 540

gttgatcgcg gcgggcagca cggcggtgac cgcgatcggc tcgccgtcgt gggccagctc 600

cacccgcagc gcgtcgtaga acgcccgcac cgccgccttg ctggccgcgt acggggcctg 660

gagcggcgcc gagcgcagcc cgagcacgga cgcgaccccg atcagcactc ctccgcccgc 720

ccggcgcagc gcgggcagcg cggccttggc cccgtgcacg tgcccgaggt agttgacccg 780

catcacccgg tcgaactcct cggcgggggt gtcctccacc cgcccgtaca cgccgatccc 840

ggccgcgttc acccaggtgt ccacccgccc gaaccgctcc accgccacct cggcgaccgc 900

gcgcaccgcg gcctcgtcgg cgatgtccgc cgtcaccgcg accgcaggcc cacccgcgtc 960

ccggacctcc tcgaccagcc cgtcgagcgc gcgggtgttg cgcgccgcgc acaccacgcg 1020

cgcccccgcc gccgcgaacc gcagcgcggt gacccgcccg atccccgacg acgcgcccac 1080

cacgacgacg acctgctccg ccaacctcct gggcatgtga cctctccgtc ccggatcgtg 1140

aaatgcggcg ggtacccggc gggaggccgt ccacgcgtcc cggagggatg gtccgcgcgg 1200

acggcgggtg gtccggatcg gaggcgggcc ctcgaccccg gcagtccgat cagcgcacga 1260

ccgaccaggg cgcggccgtc cagcgcacga ccatccagca cgcgaccgac cagggcgcga 1320

ccgaccagca cgcggccgtc cgccccggac ccggacaccc ggcaccccgc acggcccgcg 1380

cggtcacacc gccgcgacgc tccgcgcggc ctccgcgatc tgctccaggc gggtcaccac 1440

<210> 3

<211> 1465

<212> DNA

<213> 右同源臂(PCR片段质粒EcoRI /HindIII)

<400> 3

gacggtcagg cagggcagcc cgcgctcctc cgcgacgagc agcccggcca gctccatgcc 60

gtcgcgcagg accaggtcgg gccggaagcg gtcgacgacg gggcgcagcc cggccagcgc 120

ctcccgcagc agcggcctgc ccgcgatgac gtcgacgatc gcgtcgacgc cggggtagtc 180

ggtgcccggc ctggccggtg gcacgacgcc cccgagccgc tccacccaga acctcgcctg 240

gtcgggcagc gcctcgaccg agggcaggcc gctgccccgc aggcccggtg cggcgctggg 300

ggccgtggcc acgagcacct cgtgcccggc gtccaggacc gcgcgcccga gcacgagcat 360

ctcgtgcgcg tgcgacgggg ccccggtgac ggtgaacaga acgcgcaact gtcttcctcc 420

gtgctggggc ccgccgcgcg gcgggccccg gtggtgaagg gccgcgggtg cggccccgaa 480

ccggtcaggt ccgctcggcg cggcccagcc gggtgtcgat gaactcgaac agctccgcca 540

cgcccgcgtc ccggagcgcg gccccgccgt cgggctcgcc ctggtcctcg tcggacaggg 600

cggcgagcag ggcgcgcagc ctggcggcgg cgctcgcgcg cagcgcgggg tcggcgggcg 660

ggtcggcgag cgcggcctcc aggcggtcca ggcccgaggt caccgggtcg ccgccgtcga 720

gcagccccgc caacacggcg gcgacctcgg ccgccgtcgg gtggtcgaac agcagggtcg 780

cgggcagggt caggccggtg gcggcggcca ggcggtcgcg cagctccacc gccgtcatcg 840

agtcgaaccc caggtcccgg aacgcggccc gcccgtccac cgaaccgtcg gcgcggccca 900

gcacggcggc ggcgtggtcg cgcaccagcg ccagcagcac ccggtcccgg tccgggccgg 960

tcaggtcgac cgcgctcggc tccggggcgc tccgctgctc gggcagcgcc acccctggca 1020

gcgccccctc ggacagcact cccccggaca gcgcggcttc cgacgtccgc gcgaacacga 1080

ccacgcccag ctccgggctc agcggcggca cacccggtcc cgcgcacagc agggtcgcgg 1140

gcaggccgtc ctcgtggcgg cggcgcacga gcgcggccag caccccggcg gccaccgcgt 1200

cctcggggcg cgccgcgtcg ccgagcgcgc ccgccgggcc gcacagcgcg aacagcgcgg 1260

gcggccggtc gcgggtcagc tcgtccagca gcgcggcccg cgccaggccc gcgtcgtccg 1320

gctcgacggc gagcaccacc cagtccgggc ggtgcccctc cagcgcggcc accagctcct 1380

ccctgccggg gtcggcgggc agcacgaccg gttcgcgcac cccgcaggcc gccaccacgc 1440

cgcgcgccgc ctccccgacc accag 1465

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Del30-F)

<400> 4

cccggcagtc cgatcagc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Del30-R)

<400> 5

cccgaccagg cgaggttc 18

Claims (10)

1.一种中断缺失的高产安丝菌素菌株，其特征在于：所述菌株的N位糖基转移酶基因ansa30不表达。

2.根据权利要求1所述的中断缺失的高产安丝菌素菌株，其特征在于：出发菌株为ATCC31280。

3.一种中断缺失的高产安丝菌素菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）构建用于ansa30中断缺失的同源重组质粒载体；

步骤2）将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌中进行同源重组；

步骤3）通过验证硫链丝菌素抗性或PCR产物片段大小的差异的方法筛选ansa30基因中断缺失的突变株。

4.根据权利要求3所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：质粒载体由质粒pJTU1278制备。

5.根据权利要求3或4所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：受体菌为ATCC31280。

6.根据权利要求5所述的高丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：步骤1）中，由两组引物通过PCR扩增得到ansa30中断区域左侧及右侧的同源臂。

7.根据权利要求6所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：步骤1）中，在质粒SpeI/HindIII位点插入中断区域左侧1440bp的PCR片段 (SpeI/EcoRI)，在中断区域右侧1465bp的PCR片段(EcoRI /HindIII)。

8.根据权利要求7所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于，左同源臂的序列为：

CCGACGACTGACCCGCCACCGGGGACGGGGGCCGACCGGAATCCCGGTCGGCCCCCGTCCGCGTTCCAGGGGGGGGCGAGTCACGCGGGTTCAGGACCGGGCCGCGCGCACCCCGTCCCGCACCGCCCCCGTCACCCGGTGCGCCCCGCTCACCAGCGAGGTCACCAGCTCCCCCGGCCTGGGCGCCCGAGCCAGCAGCGCCGTCACCGGGCTGGACTCCAGCACCCGCCCCGGATACGCCCCGTGCACCCGCCCGTCCTCGTCCACCGGCGAGTCCACGTTGTCCACGCCGTTGTCCGGCAGCTCCGACCGCATCCCCGACCGGCCGACCGCGCGCACCGACATCAGCGCGTCCGTGAGCGCCGGGAACAGCCGCTGCCCCAGGTAGAACGCGAGCGCCGCGTCACCCACCGGCACCTCGCGGCGGGGGCGTTCGGCGGCGCGCAGCACGGCCTCAGCGACCAGCTCCGGCGCGTACACCGGAGGCGGCGGCTCGGGCAGCGAGCCGACGCGGCTGCGGCAGTGCTCGAAGAACGGGCTGTTGATCGCGGCGGGCAGCACGGCGGTGACCGCGATCGGCTCGCCGTCGTGGGCCAGCTCCACCCGCAGCGCGTCGTAGAACGCCCGCACCGCCGCCTTGCTGGCCGCGTACGGGGCCTGGAGCGGCGCCGAGCGCAGCCCGAGCACGGACGCGACCCCGATCAGCACTCCTCCGCCCGCCCGGCGCAGCGCGGGCAGCGCGGCCTTGGCCCCGTGCACGTGCCCGAGGTAGTTGACCCGCATCACCCGGTCGAACTCCTCGGCGGGGGTGTCCTCCACCCGCCCGTACACGCCGATCCCGGCCGCGTTCACCCAGGTGTCCACCCGCCCGAACCGCTCCACCGCCACCTCGGCGACCGCGCGCACCGCGGCCTCGTCGGCGATGTCCGCCGTCACCGCGACCGCAGGCCCACCCGCGTCCCGGACCTCCTCGACCAGCCCGTCGAGCGCGCGGGTGTTGCGCGCCGCGCACACCACGCGCGCCCCCGCCGCCGCGAACCGCAGCGCGGTGACCCGCCCGATCCCCGACGACGCGCCCACCACGACGACGACCTGCTCCGCCAACCTCCTGGGCATGTGACCTCTCCGTCCCGGATCGTGAAATGCGGCGGGTACCCGGCGGGAGGCCGTCCACGCGTCCCGGAGGGATGGTCCGCGCGGACGGCGGGTGGTCCGGATCGGAGGCGGGCCCTCGACCCCGGCAGTCCGATCAGCGCACGACCGACCAGGGCGCGGCCGTCCAGCGCACGACCATCCAGCACGCGACCGACCAGGGCGCGACCGACCAGCACGCGGCCGTCCGCCCCGGACCCGGACACCCGGCACCCCGCACGGCCCGCGCGGTCACACCGCCGCGACGCTCCGCGCGGCCTCCGCGATCTGCTCCAGGCGGGTCACCAC；

或者/和右同源臂的序列为：

GACGGTCAGGCAGGGCAGCCCGCGCTCCTCCGCGACGAGCAGCCCGGCCAGCTCCATGCCGTCGCGCAGGACCAGGTCGGGCCGGAAGCGGTCGACGACGGGGCGCAGCCCGGCCAGCGCCTCCCGCAGCAGCGGCCTGCCCGCGATGACGTCGACGATCGCGTCGACGCCGGGGTAGTCGGTGCCCGGCCTGGCCGGTGGCACGACGCCCCCGAGCCGCTCCACCCAGAACCTCGCCTGGTCGGGCAGCGCCTCGACCGAGGGCAGGCCGCTGCCCCGCAGGCCCGGTGCGGCGCTGGGGGCCGTGGCCACGAGCACCTCGTGCCCGGCGTCCAGGACCGCGCGCCCGAGCACGAGCATCTCGTGCGCGTGCGACGGGGCCCCGGTGACGGTGAACAGAACGCGCAACTGTCTTCCTCCGTGCTGGGGCCCGCCGCGCGGCGGGCCCCGGTGGTGAAGGGCCGCGGGTGCGGCCCCGAACCGGTCAGGTCCGCTCGGCGCGGCCCAGCCGGGTGTCGATGAACTCGAACAGCTCCGCCACGCCCGCGTCCCGGAGCGCGGCCCCGCCGTCGGGCTCGCCCTGGTCCTCGTCGGACAGGGCGGCGAGCAGGGCGCGCAGCCTGGCGGCGGCGCTCGCGCGCAGCGCGGGGTCGGCGGGCGGGTCGGCGAGCGCGGCCTCCAGGCGGTCCAGGCCCGAGGTCACCGGGTCGCCGCCGTCGAGCAGCCCCGCCAACACGGCGGCGACCTCGGCCGCCGTCGGGTGGTCGAACAGCAGGGTCGCGGGCAGGGTCAGGCCGGTGGCGGCGGCCAGGCGGTCGCGCAGCTCCACCGCCGTCATCGAGTCGAACCCCAGGTCCCGGAACGCGGCCCGCCCGTCCACCGAACCGTCGGCGCGGCCCAGCACGGCGGCGGCGTGGTCGCGCACCAGCGCCAGCAGCACCCGGTCCCGGTCCGGGCCGGTCAGGTCGACCGCGCTCGGCTCCGGGGCGCTCCGCTGCTCGGGCAGCGCCACCCCTGGCAGCGCCCCCTCGGACAGCACTCCCCCGGACAGCGCGGCTTCCGACGTCCGCGCGAACACGACCACGCCCAGCTCCGGGCTCAGCGGCGGCACACCCGGTCCCGCGCACAGCAGGGTCGCGGGCAGGCCGTCCTCGTGGCGGCGGCGCACGAGCGCGGCCAGCACCCCGGCGGCCACCGCGTCCTCGGGGCGCGCCGCGTCGCCGAGCGCGCCCGCCGGGCCGCACAGCGCGAACAGCGCGGGCGGCCGGTCGCGGGTCAGCTCGTCCAGCAGCGCGGCCCGCGCCAGGCCCGCGTCGTCCGGCTCGACGGCGAGCACCACCCAGTCCGGGCGGTGCCCCTCCAGCGCGGCCACCAGCTCCTCCCTGCCGGGGTCGGCGGGCAGCACGACCGGTTCGCGCACCCCGCAGGCCGCCACCACGCCGCGCGCCGCCTCCCCGACCACCAG。

9.根据权利要求3~8所述的安丝菌素高产菌株制备安丝菌素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将突变株的菌丝体移入一级种子培养基中，30℃ 220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃ 220r/min条件下培养24h；按10%接种量转接至发酵培养基发酵7d。

10.根据权利要求9所述的安丝菌素高产菌株的制备方法，其特征在于：

一级种子培养基包括TSB3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；

或者二级种子培养基包括TSB3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；

或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，MgCl₂2mM。