CN107860915A - 食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，该层析试纸条包括依次连接的吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫，还可以包括承载底板；硝酸纤维素膜上设有检测线、抗原线和质控线，金标垫上固定一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体‑胶体金标记物，硝酸纤维素膜的检测线上包被另一种捕获巴西坚果蛋白的单克隆抗体，抗原线包被巴西坚果蛋白，质控线包被羊抗鼠IgG；当试纸条出现一条质控线、一条抗原线是阴性，出现检测线（不管有没有抗原线）都是阳性，与现有巴西坚果蛋白过敏原检测技术相比，灵敏度高，特异性强，还可以对过敏原的浓度做出直观的评价，可直接用于食品检测。

Description

食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条及其制备 方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

巴西坚果营养丰富，是常见的、广泛食用的树生坚果。巴西坚果引起的过敏症状包括咽痒、唇肿、发声困难、呼吸困难、哮喘、黄斑疹等，因此巴西坚果属于食品过敏原标识管理的重要种类。目前为止国内外都没有发布巴西坚果过敏原成分的标准检测方法，国外对巴西坚果的检测通常采用一种商业化过敏原蛋白质免疫层析快速检测技术，国内对巴西坚果尚未建立任何达到行业应用水平的通用方法。这种现状已经严重影响了过敏原标识管理相关法规标准的科学有效实施。因此，在预包装食品过敏原检验技术领域，目前急需制定更加普适、简便、准确、成本低廉的巴西坚果过敏原检测方法，使之适用于食品企业品质安全检验和进出口食品实验室检验。

发明内容

本发明的目的在于研制一种能快速且无害的检测食品中的巴西坚果过敏原试纸条，不仅能检验出食品中微量的过敏原蛋白，也可运用于食品加工过程的质量管控，如进料、生产过程及成品检测，提前预防不必要的过敏困扰。

本发明是基于一对能够检测巴西坚果蛋白的相互配对的单克隆配对抗体，这对单克隆配对抗体由美国BioFront公司提供，通过制备40nm胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条件等完成了该试纸条发明。

本发明是通过以下技术方案实现的：

食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，包括依次组装的吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述的金标垫上固定一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上依次包被有与胶体金标记的抗巴西坚果蛋白单克隆抗体配位的另一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体检测线、抗原线和羊抗鼠IgG质控线。

所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条还包括承载吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的底板。

所述的吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫之间相互交叠连接。

所述的一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物中单克隆抗体的浓度为2-20μg/mL。

所述的检测线中另一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-3.0mg /mL。

所述的抗原线是由pH为5.0-7.4，浓度为0.01-0.2 mol/L的含有巴西坚果蛋白的PB溶液作为包被液划膜得到，其中巴西坚果蛋白的浓度为10000-80000ppm。

所述的质控线中羊抗鼠IgG的浓度为0.5-3.0mg/mL。

所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

（1）将抗巴西坚果蛋白单克隆抗体中的一种作为标记抗体，与胶体金按照（0.02-0.20）：1的体积配比混匀，经纯化、浓缩后得一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物；

（2）将步骤（1）制备的胶体金标记物喷涂固定到金标垫上，在硝酸纤维素膜上包被检测线、抗原线、质控线，处理完毕后用37-65℃干燥2-24h，放入防潮柜中储存备用；

（3）试纸条的组装：

将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次连接组装或承载在底板上，即得所述的用于检测食品中巴西坚果过敏原胶体金免疫层析纸条。

本发明的检测原理为：将一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体标记到胶体金纳米颗粒上成为本发明的金标抗体，使其能够捕获巴西坚果过敏原蛋白。在硝酸纤维素膜上固定另外一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体作为检测线，同时固定合适的质控抗体作为质控线。当样品滴加至样品垫时，样品会利用膜上微孔的毛细管作用在层析条上做横向泳动。当样品中含有巴西坚果待检测物质时，巴西坚果待测物会与金标抗体结合形成复合物，并与检测线上的捕获蛋白结合而被截获，复合物中的胶体金聚集形成肉眼可见的红色线条（T线），故会出现TC两条线；如果金标抗体没有完全被捕获，会在抗原线结合，形成H线，故会出现THC三条线；如果待测物浓度太高，金标抗体都已经跟待测物结合，故没有多余的金标抗体被T线捕获，故会出现C线一条线。当样品中不含待检测物质时，未与待测物结合的金标抗体会被抗原线捕获，胶体金聚集形成明显的红色线条（H线），故会出现HC两条线。因此，可以根据试纸条上检测线和质控线的显色情况判断样品中是否含有待测物以及试纸条是否失效。

本发明所用的制备巴西坚果过敏原检测试纸条的检测方法属于夹心法，结果判定当试纸条出现一条质控线、一条抗原线是阴性，出现检测线（不管有没有抗原线）都是阳性，与现有巴西坚果蛋白过敏原检测技术相比，灵敏度高，特异性强，还可以对过敏原的浓度做出直观的评价，可直接用于食品检测。

下面结合具体实施例进行进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明实施例2所述的巴西坚果试纸条灵敏度测定结果图；

图2为本发明实施例3所述的巴西坚果试纸条特异性测定结果图；

图3为本发明实施例4所述的巴西坚果试纸条重复性测定结果图。

具体实施方式

实施例1 食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的制备

食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的制备，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

柠檬酸三钠的配制：准确称取 0.1g 柠檬酸三钠，用超纯水溶解，并定容至 10mL，0.22μm滤膜过滤，现配现用；

氯金酸溶液配制：准确称取 1.0g 柠檬酸三钠，用超纯水溶解，并定容至 100mL，0.22μm滤膜过滤，棕色试剂瓶储存于4℃备用；

碳酸钾溶液的配制：准确称取1.38g碳酸钾，用超纯水溶解，并定容至 50mL，0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用；

5％牛血清白蛋白 (BSA) 溶液的配制：准确称取0.5g碳酸钾，用超纯水溶解，并定容至10mL，0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用；

（2）胶体金的制备：

取250mL锥形瓶，加入99mL超纯水，再加入1mL1%氯金酸溶液，将其放在磁力搅拌器上，加热搅拌至沸腾，迅速加入1mL现配制的1%柠檬酸三钠溶液，继续加热至酒红色出现，颜色稳定后继续加热搅拌10min，冷却后用超纯水定容到100mL，4℃棕色瓶保存备用；

（3）一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物的制备及纯化：

取2ml胶体金溶液，加入4μL 0.2mol/L 的碳酸钾溶液，水平摇床上低速混匀；

将一对检测巴西坚果蛋白的单克隆抗体中的一种作为标记抗体，取 12μg至胶体金溶液中，混匀30min，然后加入5％牛血清白蛋白 (BSA)至浓度为1%，混匀30min，得一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物；

将制得的抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物分装到2ml离心管中，在4℃、10000rpm条件下离心30min，接着加入等体积的Tris-HCl，在4℃，9000rpm条件下离心30min，除去上清，加入复溶液，浓缩至原体积的1/10倍，4℃保存备用；

（4）将抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物固定到金标垫上，处理完毕后用65℃干燥1h，放入防潮柜中储存备用；

（5）硝酸纤维素膜的制备：

硝酸纤维素膜选自密理博公司，层压仪组装好后，分别划THC线；其中T线划浓度为1.5mg/mL的另一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体，H线划浓度为40000ppm的抗原液，该抗原液的溶剂为pH=6.0、0.05 mol/L PB溶液， C线划1.5mg/mL的羊抗鼠IgG。包被后的硝酸纤维素膜送入干燥箱，65℃干燥2h，防潮柜中储存备用。

（6）试纸条的组装：

将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次按照头尾部分交叠的方式粘贴在 PVC底板上，得到用于检测食品中巴西坚果过敏原胶体金免疫层析纸条。

使用时，将样品加到样品垫上，当样品中含有巴西坚果待检测物质时，巴西坚果待测物会与金标抗体结合形成复合物，并与检测线上的捕获蛋白结合而被截获，复合物中的胶体金聚集形成肉眼可见的红色检测线条（T线），故会出现TC两条线；如果金标抗体没有完全被捕获，会在抗原线结合，形成H线，故会出现THC三条线；如果待测物浓度太高，金标抗体都已经跟待测物结合，故没有多余的金标抗体被T线捕获，故会出现C线一条线。当样品中不含待检测物质时，未与待测物结合的金标抗体会被抗原线捕获，胶体金聚集形成明显的红色线条（H线），故会出现HC两条线。因此，可以根据试纸条上检测线和质控线的显色情况判断样品中是否含有待测物以及试纸条是否失效。C线显色，判读为高浓度阳性（+++）；TC线显色，判读为较高浓度阳性（++）；THC均显色，判读为阳性（+）； HC显色，判读为阴性（-）；C线不显色，说明试纸条失效。

实施例2 食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的灵敏度测定

用样品稀释液将标准品稀释成不同浓度：100000ppm、10000ppm、1000ppm、100ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0ppm，用实施例1制备的试纸进行检测，用样品稀释液作为阴性对照（0ppm），5min后观察结果，检测结果如图1所示。结果显示，100000ppm为高浓度阳性，C线显色；10000ppm为较高浓度阳性，TC 线显色；2-1000ppm为阳性，THC显色；0ppm是阴性对照，HC线显色。该试纸条的灵敏度为1ppm。

实施例3 食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的特异性测定

分别取碧根果(Pecan)、麸质（Gluten）、杏仁(Almond)、榛子(Hazelunt)、鸡蛋(Egg)、花生(Peaunt)作为测试样品，研磨破碎后稀释成100ppm，用实施例1制备的试纸条进行检测，5min后观察结果，检测结果如图2所示。结果显示，碧根果(Pecan)、麸质（Gluten）、杏仁(Almond)、榛子(Hazelunt)、鸡蛋(Egg)、花生(Peanut)在100ppm处均显示C线，该试纸与碧根果(Pecan)、麸质（Gluten）、杏仁(Almond)、榛子(Hazelunt)、鸡蛋(Egg)、花生(Peanut)无交叉反应，显示出本试纸条具有良好的特异性。

实施例4 食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的重复性测定

分别在不同的时间里按照实施例1的方法完成2个批次的试纸条Lot1、Lot2，2个批次的试纸条间隔时间为2天，对比批间差异。用样品稀释液将标准品稀释成不同浓度：100000ppm、10000ppm、1000ppm、 100ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0ppm，分别用2个批次的试纸条进行检测，5min后观察结果，检测结果如图3所示。结果显示，2个批次的试纸条对比没有显著批间差异。

Claims (8)

1.食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，包括依次组装的吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述的金标垫上固定一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上依次包被有与胶体金标记的抗巴西坚果蛋白单克隆抗体配对的另一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体检测线、抗原线和羊抗鼠IgG质控线。

2.如权利要求1所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，还包括承载吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的底板。

3.如权利要求1或2所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫之间相互交叠连接。

4.如权利要求1或2所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物中单克隆抗体的浓度为2-20μg/mL。

5.如权利要求1或2 所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的检测线中另一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-3.0mg /mL。

6.如权利要求1或2所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗原线是由pH为5.0-7.4，浓度为0.01-0.2 mol/L的含有巴西坚果蛋白的 PB溶液作为包被液划膜得到，其中巴西坚果蛋白的浓度为10000-80000ppm。

7.如权利要求1或2所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的质控线中羊抗鼠IgG的浓度为0.5-3.0mg/mL。

8.如权利要求1-7任一所述的食品中巴西坚果过敏原的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将抗巴西坚果蛋白单克隆抗体中的一种作为标记抗体，与胶体金按照（0.02-0.20）：1的比例混匀，经纯化、浓缩后得一种抗巴西坚果蛋白单克隆抗体-胶体金标记物；

（2）将步骤（1）制备的胶体金标记物喷涂固定到金标垫上，在硝酸纤维素膜上包被检测线、抗原线、质控线，处理完毕后用37-65℃干燥2-24h，放入防潮柜中储存备用；

（3）试纸条的组装：

将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次组装或承载在底板上，即得所述的用于检测食品中巴西坚果过敏原胶体金免疫层析纸条。