CN107860838B - Hplc法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法。所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关物质为SM₁、粗品Z和中间体Z₁‑Z₄的一种或多种，所述流动相A为乙酸铵溶液，所述流动相B为有机溶剂。本发明的方法专属性强，灵敏度高，且方便易操作，能用于监测瑞他莫林各个步骤原料的消失情况及中间体的检测，便于每个中间体能够有效的进行杂质追溯，且贯穿整个项目使用同一个检测方法，既节约成本、又快捷、省时，能够准确、严格的控制成品瑞他莫林的质量。

Description

HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法。

背景技术

瑞他莫林是截短侧耳素类半合成素抗生素，可应用于治疗脓疱疮和小面积撕裂伤、擦伤或缝合伤口出现的感染。分子式为C₃₀H₄₇NO₄S，化学名为[[(3-外)-8-甲基-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷]-3-巯基]-，(3aS,4R,5S,6S,8R,9R,9aR,10R)-4,6,9,10-四甲基-5-羟基-6–乙烯基十氢化-1-氧代-3a,9-丙烷-3aH-环戊环辛烷-8-乙酸酯，其化学结构式如下：

瑞他莫林是以延胡索酸泰妙菌素为起始原料，经迁移、水解、脂化、取代、迁移等反应得到粗品，再精制得到成品。整个路线共有3个中间体(分别为Z₂、Z₃、Z₄)1个未分离中间体(Z₁)和1个粗品(Z)。

各国药典均未收录任何一个测定瑞他莫林的中控、中间体的检测方法，为能够准确、严格的控制成品瑞他莫林的质量、便于每个中间体能够有效的进行杂质追溯，因此开发一种既节约成本、又快捷、省时的用于监测瑞他莫林各个步骤原料的消失情况及中间体的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法。本发明的方法专属性强，灵敏度高，且方便易操作，能用于监测瑞他莫林及其相关物质的检测，能够有效的进行杂质追溯。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关物质为SM₁、粗品Z和中间体Z₁-Z₄的一种或多种，具体结构式如下所示：

所述流动相A为乙酸铵溶液，所述流动相B为有机溶剂。

在选定本发明流动相之前，还采用其他流动相，甲醇-水，乙腈-水，峰无保留，采用乙腈-磷酸二氢钾、乙腈-六氟磷酸钾，有保留，但拖尾严重，采用CAN-六氟磷酸钾(1％三乙胺，pH＝7.0)，有保留，但基线噪音大；水(氨水调节pH 10)-乙腈-甲醇，杂质分离度不好。经反复试验验证综合考虑选择乙酸铵溶液和有机溶剂的混合物作为流动相。

进一步，所述乙酸铵溶液的浓度为0.01mol/L-0.5mol/L；所述乙酸铵溶液的pH值为2.5-12。

作为一种优选，所述乙酸铵溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；优选乙酸铵溶液的浓度为0.1mol/L。

作为一种优选，所述乙酸铵溶液的pH值为10.0。

作为一种优选，所述乙酸铵溶液选用氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水中一种或多种进行pH调节。优选氨水进行pH调节。

进一步，所述有机溶剂为乙腈、乙醇和甲醇的一种或多种。

进一步，所述乙酸铵溶液与有机溶剂的体积比为200-500：300-800。

进一步，所述有机溶剂为乙腈和甲醇的混合物；所述乙腈和甲醇的体积比为1:1-2.5。

作为一种优选，所述乙酸铵溶液、乙腈和甲醇的体积比为300:210:490。

进一步，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为3-5μm；流动相的流速为0.5-1.5ml/min。

作为一种优选，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为5μm；流动相的流速为1.0ml/min。

进一步，所述色谱柱的柱长为150-250mm；柱温为25-45℃。

作为一种优选，所述色谱柱的柱长为250mm；柱温为30℃。

进一步，所述检测器的检测波长为210nm±2nm。

洗脱分离后，再采用检测器进行测定，所述检测器选用紫外检测器、DAD检测器中的任一种。

进一步，HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法，所述相关物质为SM₁、粗品Z和中间体Z₁-Z₄，具体包括以下步骤：

1)配制空白溶液：取稀释剂作为空白溶液；

2)配制供试样品溶液：取供试样品溶于乙腈的水溶液，得样品溶液；

3)配制对照品溶液：取瑞他莫林对照品、SM₁、Z、Z1-Z4对照品，用稀释剂溶解稀释制成对照品溶液；

4)分别取步骤1)所述空白溶液、步骤2)所述供试样品和步骤3)所述对照品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定瑞他莫林及相关物质的保留时间，按外标法以峰面积计算供试样品溶液中瑞他莫林及相关物质的含量；

所述稀释剂为浓度为0.01mol/L-0.5mol/L的乙酸铵溶液与乙腈的混合物；所述乙酸铵溶液与乙腈的体积比为50:50。

本发明的目的之二在于提供一种用于固液分离测定瑞他莫林及其相关物质的试剂组合物，由以下试剂组成：

试剂A：乙酸铵溶液；

试剂B：乙腈、乙醇和甲醇的一种或多种；

所述相关物质为粗品Z和中间体Z₁-Z₄的一种或多种；

所述乙酸铵溶液的浓度为0.01mol/L-0.5mol/L，pH值为2.5-12；

所述试剂A和试剂B的体积比为200-500：300-800。

本发明试剂组合物能同时有效分离瑞他莫林及其相关物质，所述相关物质中各中间体间分离度大于1.5。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供了一种的HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法，该方法能用于监测瑞他莫林各个步骤原料的消失情况及中间体的检测，便于每个中间体能够有效的进行杂质追溯，且贯穿整个项目使用同一个检测方法，既节约成本、又快捷、省时，能够准确、严格的控制成品瑞他莫林的质量。

2)该方法专属性强，灵敏度高，且方便易操作，同时保证瑞他莫林整个中控、中间体的杂质追溯和质量控制。

3)本发明提供的用于固液分离测定瑞他莫林及其相关物质的试剂组合物能有效分离瑞他莫林及其相关物质，对于实现瑞他莫林及其制剂的质量控制有重要意义。

附图说明

图1为空白检测HPLC图谱。

图2为混合溶液检测HPLC图谱。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1瑞他莫林中各个反应监控原料消失的测定

1、仪器与条件

仪器：高效液相色谱仪SHIMADZU 20A(SHIMADZU)；

色谱工作站：LabSolution；

检测器：UV；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充剂(SHIMADZU，VP-ODS，150mm×4.6mm，5μm)；

流动相：

缓冲盐：0.1M乙酸铵(用氨水调节pH值至10.0±0.1)

流动相：缓冲盐：乙腈：甲醇＝300：210：490

检测波长：210±2nm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样体积：20μl。

2、实验步骤

SM₁——Z₁反应监控

SM₁定位溶液：取SM₁对照品约80mg，置10ml量瓶中，加稀释剂(乙腈-缓冲盐50:50)稀释至刻度，摇匀，再移取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取反应液约0.4ml，挥干，用乙腈-水90-10 5ml，溶解稀释，过滤，即得。

Z₁——Z₂反应监控

Z₁定位溶液：取Z₁供试品溶液约0.1ml，加乙腈稀释至10ml，即得。

供试品溶液：取反应液约0.5ml，挥干，加乙腈-水50-50 5ml，溶解稀释，过滤，即得。

Z₂——Z₃反应监控

Z₂定位溶液：取Z₂对照品约40mg，置10ml量瓶中，加稀释剂(乙腈-缓冲盐50:50)稀释至刻度，摇匀，再移取上述溶液0.1ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取反应液约0.5ml，挥干，加甲醇5ml溶解稀释，过滤，即得。

Z₃——Z₄反应监控

Z₃定位溶液：取Z₃供试品溶液0.1ml，加稀释剂(乙腈-缓冲盐50:50)稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取反应液约0.5ml，挥干，加2.5ml乙腈溶解稀释，过滤，即得。

Z₄——Z反应监控

Z₄定位溶液：取Z₄供试品溶液约0.1ml，置10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

混合溶液：取SM₁、Z₁、Z₂、Z₃、Z₄定位溶液2ml，置10ml量瓶中，称取粗品Z 100mg，置上述量瓶中，溶解，即得。

分别取各项下的定位溶液、供试品溶液、混合溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1-2。

3、检测结果

1)Z₁中原料SM₁的控制水平不得过2.0％，则终止反应；

2)Z₂中原料Z₁的控制水平不得过0.5％，则终止反应；

3)Z₃中原料Z₂的控制水平不得过2.0％，则终止反应；

4)Z₄中原料Z₃的控制水平不得过2.0％，则终止反应；

5)Z中原料Z₄的控制水平不得过2.0％，则终止反应。

6)混合溶液中，各中间体间分离度应大于1.5，则判为符合规定。

实施例2数批反应监控测定结果

按照实施例1的方法对我司数批反应监控样品进行测定。计算结果见表1。

表1数批样品检测结果

批号	SM<sub>1</sub>-Z<sub>1</sub>	Z<sub>1</sub>-Z<sub>2</sub>	Z<sub>2</sub>-Z<sub>3</sub>	Z<sub>3</sub>-Z<sub>4</sub>	Z<sub>4</sub>-Z
						01	0.5	0.03	1.5	——	0.2
02	0.3	——	1.4	0.2	1.5
						03	0.4	0.1	1.5	1.4	0.5

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.HPLC法分离测定瑞他莫林及其相关物质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关物质为SM₁、粗品Z和中间体Z₁-Z₄的一种或多种，具体结构式如下所示：

所述流动相A为pH值为10.0±0.1、0.1mol/L的乙酸铵溶液，所述流动相B为乙腈和甲醇；所述乙酸铵溶液与所述乙腈和所述甲醇的体积比为300：210：490；所述检测器的检测波长为210nm±2nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒粒径为3-5μm；流动相的流速为0.5-1.5ml/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为150-250mm；柱温为25-45℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相关物质为SM₁、粗品Z和中间体Z₁-Z₄，具体包括以下步骤：

1)配制空白溶液：取稀释剂作为空白溶液；

2)配制供试样品溶液：取供试样品溶于乙腈的水溶液，得样品溶液；

3)配制对照品溶液：取瑞他莫林对照品、SM₁、Z、Z1-Z4对照品，用稀释剂溶解稀释制成对照品溶液；

4)分别取步骤1)所述空白溶液、步骤2)所述供试样品和步骤3)所述对照品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定瑞他莫林及相关物质的保留时间，按外标法以峰面积计算供试样品溶液中瑞他莫林及相关物质的含量；

所述稀释剂为浓度为0.01mol/L-0.5mol/L的乙酸铵溶液与乙腈的混合物；所述乙酸铵溶液与乙腈的体积比为50:50。

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