CN107858303B

CN107858303B - 一株在高盐环境下降解孔雀石绿的产气肠杆菌

Info

Publication number: CN107858303B
Application number: CN201711180830.7A
Authority: CN
Inventors: 赵国琰; 尚念杰
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN107858303A

Abstract

本发明公开了一株降解孔雀石绿的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)S27，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017452，保藏日期为2017年8月28日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，该菌能够耐盐、可以适应恶劣环境，使用成本低，生态恢复好等优点，适用于废水中孔雀石石绿的降解，为因孔雀石绿造成的环境污染提供了有益的菌种资源。

Description

一株在高盐环境下降解孔雀石绿的产气肠杆菌

技术领域：

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株分离自灰绿碱蓬的产气肠杆菌，及其在高盐浓度条件下降解孔雀石绿的方法和应用。

背景技术：

孔雀石绿(Malachite Green,MG)又名碱性绿，呈蓝绿色有金属闪光的结晶，易溶于水，是一种合成的三苯甲烷类工业染料，曾被广泛用于真丝、羊毛、棉布等染色剂等。因孔雀石绿在杀灭鱼类体内寄生虫、防治水霉病、烂鳃病等有非常明显的效果，因此在水产养殖中曾得到广泛应用。但研究发现孔雀石绿的重要官能团为三苯甲烷，它是一种强致癌物质，通过食物链对人类社会和自然环境造成了重大影响，因此，美国、日本、英国等许多国家和地区，立法严禁使用孔雀石绿，目前我国也已将孔雀石绿列为禁用药物，但由于本身出色的药理效果和低廉的价位，目前仍有偷偷使用的违规现象。

现阶段对于染料废水的处理主要是采用传统的理化处理方法，有物理方法和化学方法等。物理方法主要是通过设计媒介对孔雀石绿吸附、渗透膜过滤和沉降作用去除，化学方法主要有异相光催化、光电催化和电化学方法等。但是由于处理成本较高、效率低下，往往在处理过程的同时容易产生二次污染和难以处置的底泥，因此，极大地限制了其广泛推广使用，设计一种对环境影响较小同时又能够高效率降解染料方法被科学研究者们迫切的提上了日程。

微生物由于繁殖速度快，对恶劣环境适应能力强，且易产生大量降解相关酶等优点使微生物处理技术受到研究者们的青睐，而筛选出具有高效降解能力的菌株具有重要的实践意义。许多研究表明，假单胞菌、芽孢杆菌、酵母菌等对三苯甲烷类的染料具有脱色功能，针对肠杆菌属(Enterobacter)菌株降解孔雀石绿的报道较少，CN104830729A中公开了一株可以降解孔雀石绿的肠杆菌属(Enterobacter sp.)菌株CV-v；目前，仍未有针对产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)可以降解孔雀石绿的相关报道。

本发明的发明人从灰绿碱蓬分离筛选出一株产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，该菌株对孔雀石绿具有高效的脱色能力，并且还适于在高盐环境下降解孔雀石绿，丰富了能够降解孔雀石绿染料的微生物资源库，对解决孔雀石绿的脱色问题提供了确实可行的方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一株降解孔雀石绿的产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，及其在高效降解孔雀石绿中的应用。该菌能够适应恶劣环境，高盐条件下耐受性好，使用成本低，生态恢复好，等优点，十分适用于孔雀石石绿的降解，为因孔雀石绿造成的环境污染提供了有益的菌种资源。

一方面，本发明提供了一株降解染料废水中的孔雀石绿的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)S27，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2017452，保藏日期为2017年8月28日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，该菌分离自灰绿碱蓬，菌落粘稠呈乳白色，表面平滑，最适生长温度为30℃，PH＝7。

另一方面，本发明还提供了产气肠杆菌S27的培养方法，所述方法包括将菌株接种于LB液体培养基中，在合适温度和pH条件下培养一段时间，得到菌株培养物。所述温度为25～35℃，优选30℃；所述pH为4-8，优选7；所述培养时间为12-48小时，优选24-36小时。所述培养优选为摇床培养，转速优选为150～200rpm。

另一方面，本发明还提供了产气肠杆菌S27在降解孔雀石绿中的应用，尤其是在高盐环境下可以降解孔雀石绿。本发明的菌株可用于净化受到孔雀石绿污染的环境，如，土壤、水域，尤其可用于污水、废水的净化。所述高盐环境的盐浓度为1％-9％，优选5％-9％，更优选7％-9％，更优选9％。

另一方面，本发明还提供了产气肠杆菌S27在降解孔雀石绿时的操作方法，具体而言，步骤如下：(1)将菌株接种于LB液体培养基中，在25～35℃条件下，转速为150～200rpm的摇床中过夜培养，以获得大量菌体；(2)将过夜培养物接种于孔雀石绿染料浓度500mg/L及以下的样品中，调节pH为4.0～8.0，温度为25～35℃，转速为150～200rpm的摇床中摇动培养，脱色12～32h，样品中的NaCl含量为1％～13％。

优选地，样品中孔雀石绿染料浓度为500mg/L以下，优选为100-500mg/L，更优选的，样品中孔雀石绿染料浓度为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L或500。

优选地，菌株的工作温度为30℃、工作pH为7.0、摇床转速为150rpm。

优选的，样品中NaCl含量为13％以下，优选为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％。

上述LB液体培养基由蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L配制而成，PH＝7。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了可以降解孔雀石绿的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)S27，在本发明之前，鲜有报道产气肠杆菌可以降解孔雀石绿的菌株，本发明的菌株为孔雀石绿的降解提供了一种新的应用途径。

本发明的菌株可以耐受最高13％的盐浓度，尤其是在盐浓度为9％的条件下对孔雀石绿也具有较高的降解效率，可以适用于高盐环境下对孔雀石绿的降解，具有广阔的应用前景。说明书附图：

图1产气肠杆菌S27对不同浓度孔雀石绿的降解情况

图2产气肠杆菌S27在不同盐浓度下对孔雀石绿的降解情况

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。

实施例1产气肠杆菌S27的筛选以及对孔雀石绿的降解

采集来自山东省东营市滨海盐碱地的碱蓬株，先用无菌水冲洗两遍，再用75％酒精浸泡3～5min，无菌水冲洗两遍，0.1％升汞浸泡5分钟，无菌水冲洗8遍。取最后一遍冲洗后无菌水100μL涂平板做对照。取两段大约5cm消毒好的碱蓬放入研钵中，加入2mL无菌水，研磨后取上清液，倍比稀释。分别取100μL涂布0.5％、3％和5％Na Cl(w/v)浓度的LB平板，30℃条件下培养48h。采用划线法及稀释涂布平板法纯化分离菌株，获得了纯化的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)S27，菌落粘稠呈乳白色，表面平滑，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017452，保藏日期为2017年8月28日，保藏地址为中国武汉，武汉大学

将S27菌接种于LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，PH＝7)中，在30℃条件下，转速为150rpm的摇床中过夜培养，得到过夜培养物；将1ml的菌液接种于分别含有含孔雀石绿100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L培养基中，每间隔4h后将所收集样品于1.5mL的EP管中在12000rpm条件下离心5min后，取上清，利用紫外可见光分光光度计在620nm处测定吸光值，脱色率(％)＝(A-B)/A×100，其中：A为脱色前脱色培养液的OD值，B为脱色后脱色培养液的OD值。如图1所示，该菌对100mg/L-500mg/L的孔雀石绿都表现出了良好的降解效果，降解效率可达90％以上。

实施例2产气肠杆菌S27盐耐受试验

将S27菌株接种于LB培养基中，在30℃条件下，转速为150rpm的摇床中过夜培养，得到过夜培养物；将1ml的菌液接种于初始NaCl浓度(w/v)为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％的LB液体培养基中，观察菌株的生长状况，如表1所示。菌株S27最高能够耐受13％的盐浓度，其中，在1-9％的盐浓度下生长良好，在10-11％的盐浓度下生长一般，在12-13％的盐浓度下生长缓慢，超过13％的盐浓度下几乎不生长，表明菌株S27有良好的盐耐受度。

表1产气肠杆菌S27在不同NaCl浓度下的生长状况

NaCl(w/v)	Growth	NaCl(w/v)	Growth
				1％	+++	8％	+++
2％	+++	9％	+++
				3％	+++	10％	++
4％	+++	11％	++
				5％	+++	12％	+
6％	+++	13％	+
				7％	+++	14％	-

注：+++：生长良好，++：生长一般；+：生长缓慢；-：几乎不生长。

实施例3产气肠杆菌S27在不同盐浓度下对孔雀石绿的降解

将S27菌株接种于LB培养基中，在30℃条件下，转速为150rpm的摇床中过夜培养，得到过夜培养物；将1ml的菌液接种于初始盐浓度为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％的孔雀石绿培养基中，各培养基中孔雀石绿初始浓度为70mg/L。培养32h后将所收集样品于12000rpm条件下离心5min后，取上清，利用紫外可见光分光光度计在620nm处测定吸光值，脱色率(％)＝(A-B)/A×100，其中：A为脱色前脱色培养液的OD值，B为脱色后脱色培养液的OD值。如图2所示，在盐浓度为9％的条件下对初始浓度为70mg/L的孔雀石绿降解率可高达91％以上，可见该菌对孔雀石绿特别是在较高盐浓度条件下降解效果很好，能够用于高盐环境下对孔雀石绿的降解。

实施例4产气肠杆菌S27在高盐环境下对不同浓度孔雀石绿的降解

将S27菌接种于LB培养基中，在30℃条件下，转速为150rpm的摇床中过夜培养，得到过夜培养物；将1ml的菌液接种于分别含有含孔雀石绿100mg/L、200mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L、500mg/L孔雀石绿培养基中(NaCl含量为9％)，培养32h后将所收集样品于12000rpm条件下离心5min后，取上清，利用紫外可见光分光光度计在620nm处测定吸光值，脱色率(％)＝(A-B)/A×100，其中：A为脱色前脱色培养液的OD值，B为脱色后脱色培养液的OD值，计算针对不同浓度孔雀石绿的降解效率，结果如表2所示。由表2可知，在高盐浓度下，菌株S27可以对高浓度的孔雀石绿表现出良好的降解效率，其可以用于高盐环境下对高浓度孔雀石绿的降解。

表2菌株S27在9％(w/v)NaCl浓度下对不同浓度孔雀石绿(MG)的降解率

MG(mg/L)	100	200	300	350	400	450	500
								降解率	90.1％	88.3％	86.2％	85.6％	84.7％	81.2％	80.3％

Claims

1.一株可在高盐环境下降解孔雀石绿的菌株，其特征在于，所述菌株为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）S27，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCCNO：M 2017452，保藏日期为2017年8月28日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.权利要求1所述的菌株在降解孔雀石绿中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株是在高盐环境下降解孔雀石绿，所述高盐环境的盐浓度为1%-9%。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高盐环境的盐浓度为5%-9%。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高盐环境的盐浓度为7%-9%。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高盐环境的盐浓度为9%。

7.根据权利要求2~6任一项所述的应用，其特征在于，所述菌株用于土壤、污水或废水中孔雀石绿的降解。

8.权利要求1所述菌株的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述菌株接种于LB液体培养基中，在温度25-35℃和pH4-8的条件下培养一段时间，得到菌株培养物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述温度为30℃；所述pH为7；所述培养时间为12-48小时。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述培养为摇床培养，转速为150~200rpm。

11.一种利用权利要求1所述菌株降解孔雀石绿的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）培养权利要求1所述的菌株；（2）将步骤（1）获得的菌株置于含孔雀石绿的样品中进行孔雀石绿的降解。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）培养菌株的方法为权利要求8-10任一所述的方法。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）样品中孔雀石绿的含量为500mg/L以下，所述样品中盐浓度为9%以下，所述样品为土壤、污水或废水。