CN108795804B - 孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用 - Google Patents

孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，所述降解菌为肠杆菌属(Enterobacter sp.)的菌株D6，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2018年3月16日，保藏编号为CCTCC No.M 2018133，所述菌具有同时降解渔业养殖环境中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的能力。本发明的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌可安全、高效、快速的同时降解渔业养殖环境中残留孔雀石绿和隐性孔雀石药物，在渔业生态环境保护、养殖环境药物残留污染治理和保障食品安全方面具有很好的应用前景。

Description

孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用。
背景技术
孔雀石绿(Malachite green，MG)又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，为暗绿色结晶固体，孔雀石绿作为工业用染色剂和细胞化学染色剂等被广泛应用。1933年，研究发现孔雀石绿具有抗菌的药效，之后许多国家开始将孔雀石绿广泛用作杀菌剂，主要用于杀灭养殖水体环境中的寄生虫和鱼卵中的霉菌等。孔雀石绿在水生动物体内代谢成无色隐性孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)，孔雀石绿和无色隐性孔雀石绿易在水生动物体内长时间残留，产生高度致畸、致癌和致突变效应，隐性孔雀石绿具有很强的脂溶性，能与脂肪牢固结合，因此残留毒性比孔雀石绿更强。因此渔业养殖过程中投放到渔业养殖环境的孔雀石绿药物，一方面增加了动物对孔雀石绿的吸收以及孔雀石绿在动物体内的残留，另一方面未被动物吸收的残留孔雀石绿药物以及经水生动物代谢出的隐性孔雀石绿在渔业水体中积累，并随水中悬浮颗粒沉降，吸附到池塘底泥中，通过生物富集作用对养殖生态系统和水产品质量产生不利。因此，孔雀石绿药物和隐性孔雀石绿残留引起的渔业养殖环境污染问题受到人们的普遍关注，如何有效的去除孔雀石绿药物和隐性孔雀石绿的残留污染和进行监控对保护和修复渔业生态环境、发展绿色养殖和保障食品安全具有重要意义。
目前，对养殖环境及水产品中药物残留的质量控制，主要是对其药物残留情况进行监控，不能从根本上解决药物对环境及水产品的污染。现有技术中，针对水产养殖环境及水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的残留的去除方法较多采用物理法、化学及微生物方法从养殖源头降解消除孔雀石绿及其代谢产物的残留问题，微生物法是以微生物降解作为环境中药物降解的主要方式，现有技术主要集中在土壤、堆肥和城市污水等环境的残留药物降解，而对于渔业养殖环境中残留药物的微生物降解研究少，经检索在渔业养殖环境中孔雀石绿药物和隐性孔雀石绿残留的微生物降解研究也极少，还未见有在渔业养殖环境中孔雀石绿和隐性孔雀石绿药物残留的微生物降解菌的公开报道。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有在渔业养殖环境中孔雀石绿药物和隐性孔雀石绿残留对养殖生态系统和水产品质量产生不利，在渔业养殖环境中孔雀石绿和隐性孔雀石绿微生物降解菌未见公开报道。
为实现上述目的，本发明提供了一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，该菌为肠杆菌属(Enterobacter sp.)的菌株D6，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC；地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编：430072)，保藏日期为2018年3月16日，保藏编号为CCTCC M 2018133，该菌具有同时降解渔业养殖环境中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的能力。
进一步地，所述降解菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示；
进一步地，所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，属于革兰氏染色阴性、杆菌；精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、明胶液化试验、β-半乳糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶反应阴性；山梨醇、乳糖、鼠李糖、葡萄糖试验阳性；
进一步地，所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，在渔业养殖环境中生长，最适生长温度28-35℃，最适生长pH为7.0-7.5，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明；
进一步地，所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，可利用蔗糖；
在本发明较佳实施方式中，所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌在孔雀石绿和隐性孔雀石绿浓度分别为10mg/L的渔业水体中对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解能力均大于80％；
在本发明较佳实施方式中，所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌在孔雀石绿和隐性孔雀石绿浓度分别为0.2mg/kg的渔业底泥中对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解能力均大于85％；
本发明另一方面提供所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：配置培养基和培养液；
步骤2：制备营养琼脂平板；
步骤3：降解菌培养：采集养殖鱼塘底泥加入到含孔雀石绿和隐性孔雀石绿的富集培养液中驯化培养，然后取10％的接种量转接至下一批次新鲜富集培养液中培养，逐步加大孔雀石绿和隐性孔雀石绿的投加浓度，如此重复，投加浓度梯度为2、5、10、15mg/L得到包含降解菌的培养液；
步骤4：将步骤3得到的包含降解菌的培养液进行分离纯化，得到孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌D6。
进一步地，所述步骤1中，培养基包括基础培养基、营养培养基、孔雀石绿降解液体培养基、隐性孔雀石绿降解液体培养基；
进一步地，所述基础培养基具体配置操作包括：将磷酸二氢钾30份，七水硫酸镁1份，硝酸铵20份，无水CaCl2 0.1份，磷酸氢二钾15份，乙二胺四乙酸二钠0.1份混合，加入过滤养殖水体15～16mL/份，调pH 7.0-7.5，高压蒸汽121℃灭菌15min后制得基础培养基；
进一步地，所述营养培养基具体配置操作包括：将蛋白胨10份，牛肉粉3份，氯化钠5份，葡萄糖1份混合，加入过滤养殖水体50～55mL/份，调pH 7.0-7.5，高压蒸汽121℃灭菌15min后制得营养培养基；
进一步地，所述孔雀石绿降解液体培养基具体配置操作包括：99％基础培养基，1％营养培养基，添加孔雀石绿浓度为10mg/L；
进一步地，所述隐性孔雀石绿降解液体培养基具体配置操作包括：99％基础培养基，1％营养培养基，添加隐性孔雀石绿浓度为10mg/L；
进一步地，所述步骤1中，所述培养液为富集培养液，具体配置操作为在营养培养基中加入孔雀石绿和隐性孔雀石绿，使孔雀石绿和隐性孔雀石绿的浓度均为2mg/L；
进一步地，所述步骤2中，所述营养琼脂平板具体制备操作包括：将蛋白胨10份，牛肉粉3份，氯化钠5份，琼脂15份，蒸馏水30mL/份，高压121℃灭菌15min，冷却至46℃制成平板；
进一步地，所述步骤3中，所述驯化培养温度为25～30℃；驯化培养转速为160rpm；驯化培养时间为3～5天；
进一步地，所述步骤4中，所述降解菌分离纯化具体操作包括：取包含降解菌的培养液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯化后的各菌落分别接至孔雀石绿降解液体培养基和隐性孔雀石绿降解液体培养基中振荡培养24d(30℃，160rpm)，检测降解液体培养液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量，筛选得到对孔雀石绿和隐性孔雀石绿均具有高效降解能力的菌株D6。
在本发明较佳实施方式中，所述步骤3中，所述驯化培养温度为25℃；
在本发明另一较佳实施方式中，所述步骤3中，所述驯化培养温度为30℃；
在本发明较佳实施方式中，所述步骤3中，所述驯化培养时间为3天；
在本发明另一较佳实施方式中，所述步骤3中，所述驯化培养时间为5天；
本发明还提供本发明上述所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌、以及上述制备方法制备得到的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌在制备用于渔业养殖环境中降解孔雀石绿和隐性孔雀石绿、修复渔业养殖环境中降解剂的用途；
本发明还提供一种上述所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌、以及上述制备方法制备得到的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌在含孔雀石绿和隐性孔雀石绿的渔业养殖环境降解去除孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留、修复渔业养殖环境中的应用；
所述渔业养殖环境包括渔业水体、渔业底泥。
采用以上方案，本发明公开的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，具有以下优点：
本发明的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，利用微生物对药物的降解通常只是一个自然过程的强化，不会导致二次污染和污染物的转移，可同时降解渔业养殖环境中的孔雀石绿和隐性孔雀石绿，安全、高效、快速；
通过使用本发明的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，减少了渔业养殖环境的孔雀石绿和隐性孔雀石绿药物残留，降低了孔雀石绿和隐性孔雀石绿药物残留对养殖生态系统和水产品质量的不利影响，对保护渔业生态环境、发展绿色养殖和保障食品安全具有重要意义；
综上所述，本发明的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌可安全、高效、快速的同时降解渔业养殖环境中残留孔雀石绿和隐性孔雀石药物，在渔业生态环境保护、养殖环境药物残留污染治理和保障食品安全方面具有很好的应用前景。降解菌制备方法简便，易操作，安全环保，重复性好，成本低廉，有利于广泛应用。
以下将结合附图和实施例对本发明的构思、具体技术方案及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌的菌落形态图；
图2是本发明孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌的扫描电镜图；
图3是本发明孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌的扫描电镜图；
图4是孔雀石绿和隐性孔雀石绿的TIC色谱图。
具体实施方式
以下介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，这些实施例为示例性描述，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
如若有未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如相关说明书或者手册进行实施。
实施例1、孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌株的筛选
培养基和试剂的配置制备
基础培养基：磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁0.1g，硝酸铵2.0g，无水CaCl2 0.01g，磷酸氢二钾1.5g，乙二胺四乙酸二钠0.01g混合，加入过滤养殖水体1000mL，调pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后制得；
营养培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖1.0g混合，加入过滤养殖水体1000mL，调pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后制得；
富集培养液：在营养培养基中加入孔雀石绿和隐性孔雀石绿，使孔雀石绿和隐性孔雀石绿浓度均为5mg/L；
孔雀石绿降解液体培养基：99％基础培养基和1％营养培养基中，添加孔雀石绿使浓度为10mg/L；
隐性孔雀石绿降解液体培养基：99％基础培养基和1％营养培养基中，添加隐性孔雀石绿浓度为10mg/L
营养琼脂平板：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g混合，加入蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右时制成平板；
菌株培养：
上海市近郊区某养殖鱼塘采集底泥样品，取适量底泥于无菌状态下，加入到含孔雀石绿和隐性孔雀石绿各2mg/L的富集培养液的250mL三角瓶中，在温度30℃、转速160rpm的条件下，驯化培养3天，待培养液浑浊且颜色变浅后，按10％的接种量转接至下一批次新鲜的含孔雀石绿和隐性孔雀石绿各5mg/L富集培养液中，并逐步加大孔雀石绿和隐性孔雀石绿投加浓度，如此重复，投加浓度梯度为2、5、10、15mg/L得到菌株培养液；
菌株分离纯化：
取上述得到的菌株培养液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将分离纯化后的各菌落分别接至孔雀石绿降解液体培养基和隐性孔雀石绿降解液体培养基中，振荡培养24d(30℃，160rpm)，通过高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS)检测降解液体培养液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量，筛选获得一株对孔雀石绿和隐性孔雀石绿均具有高效降解能力的菌株，命名为D6。
实施例2：孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌株的鉴定
将上述实施例1获得的菌株D6进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的菌落形态如图1所示，菌株的扫描电镜图如图2和图3所示。
经鉴定，该菌株的主要生物学特征为：
革兰氏染色阴性、杆菌；精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、β-半乳糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶反应阴性；山梨醇、乳糖、鼠李糖、葡萄糖试验阳性；可以利用蔗糖；该菌株渔业养殖环境中生长，最适生长温度28-35℃，最适生长pH为7.0-7.5，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。
该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为肠杆菌属(Enterobacter sp.)。
实施例3：孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌对渔业水体中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解试验
将实施例1分离、纯化后得到的菌株D6以菌量OD600nm＝0.2接种到100mL含孔雀石绿和隐性孔雀石绿药物浓度为10mg/L的渔业水体的250mL三角瓶中，以不接菌的渔业水体作对照，在30℃、160rpm的恒温摇床上震荡培养36h。培养结束后，培养液7000rpm离心5min，取100μL溶液，稀释到10mL水体中，加入300μL浓度为0.2μg/mL的氘代孔雀石绿和氘代隐性孔雀石绿，取1mL样品过PRS固相萃取柱，PRS柱子经过活化(2mL乙腈、2mL水)、上样、淋洗(2mL水、2mL乙腈)，最后采用3mL乙腈：乙酸铵(v：v＝1:1)洗脱，取1mL洗脱液过滤，采用高效液相色谱-串联质谱仪检测，每个实验重复三次检测得到样品孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量，通过计算考察降解率来判断该菌的降解能力。
降解率计算公式：降解率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量
孔雀石绿和隐性孔雀石绿的TIC色谱图如图4所示；
经计算本实施例菌株D6对浓度为10mg/L的孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解率分别为81.50％和81.13％。
实施例4：孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌对渔业底泥中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解效果
采集上海市水产研究所内某养殖池塘底泥，该池塘此前6年内未投放任何药物，称取20g底泥样品(湿重)灭菌处理后，投入20mL用上海市水产研究所鱼塘水配置的一定浓度的孔雀石绿和隐性孔雀石绿水溶液，使之含量分别为0.2mg/kg。将菌种接种于营养培养基活化16h，8000rpm离心3min，获得菌体，加入1×PBS缓冲液溶解，以1.0×108CFU/g接种量加入到含孔雀石绿和隐性孔雀石绿的渔业底泥中，搅拌均匀，于黑暗条件下静置培养，以不接菌的渔业底泥作空白对照。
连续测定培养物中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的残留量，每次取样测定前将样品摇匀，取适量样品，加入配置好的氘代孔雀石绿内标液，涡旋混匀，加入20mL二氯甲烷，涡旋混匀3min，超声15min，8000rpm离心3min，吸取1mL底层液体过PRS柱子，柱子使用2mL乙腈和2mL水分别活化，使用2mL水和2mL乙腈淋洗，用2mL乙腈：乙酸铵(v:v＝1:1)混合溶液洗脱，取1mL复溶液过0.45μm滤膜，采用高效液相色谱-串联质谱仪检测得到样品孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留量，通过计算考察降解率来判断该菌的降解能力。
经计算，本实施例菌株D6对渔业底泥中浓度为0.2mg/kg的孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解率分别为85.4％和86.3％。
进一步采用发光细菌的方法研究了上述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌对渔业养殖环境中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解前后，养殖水体和养殖底泥中孔雀石绿和隐性孔雀石绿污染的生物毒性，结果表明，本实施例菌株D6对水产养殖环境中的孔雀石绿和隐性孔雀石绿具有较好的降解效果，极大的消除了孔雀石绿、隐性孔雀石绿及其降解产物的生物毒性。
综上所述，实验结果表明本发明降解菌对渔业水产养殖环境中孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留均具有较好的降解能力，因此，该菌对渔业养殖环境中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的降解，尤其是渔业水产养殖生态污染的修复具有广泛的应用前景。
本发明其他实施方式技术方案也具有与上述相似的有益效果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海市水产研究所
<120> 孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 肠杆菌属 (Enterobacter sp.的菌株D6)
<400> 1
ggcatgggcg cggctacaca tgcagtcgaa cggtagcaca gaggagcttg ctccttgggt 60
gacgagtggc ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc cgatggaggg ggataactac 120
tggaaacggt agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa agagggggac cttcgggcct 180
cttgccatcg gatgtgccca gatgggatta gctagtaggt ggggtaacgg ctcacctagg 240
cgacgatccc tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca 300
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc 360
atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcgag gaggaaggtg 420
ttgtggttaa taaccgcagc aattgacgtt actcgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt 480
gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540
gcacgcaggc ggtctgtcaa gtcggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat 600
ccgaaactgg caggctagag tcttgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagaga tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc 720
tcaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgtcgac ttggaggttg tgcccttgag gcgtggcttc cggagctaac gcgttaagtc 840
gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 900
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct actcttgaca 960
tccagagaac ttagcagaga tgctttggtg ccttcgggaa ctctgagaca ggtgctgcat 1020
ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
atcctttgtt gccagcggtt cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta 1200
caatggcata tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtatgtc 1260
gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg 1320
atcagaatgc cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380
gagtgggttg caaaagaagt aggtagctta accttcggga gggcgctacc acttgatgat 1440
gc 1442

Claims (3)

1.一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，其特征在于，所述降解菌为肠杆菌属(Enterobacter sp.)的菌株D6，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2018年3月16日，保藏编号为CCTCC No.M 2018133，所述菌具有同时降解渔业养殖环境中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的能力；所述降解菌的16Sr DNA基因序列为SEQ IDNo.1；所述降解菌属于革兰氏染色阴性、杆菌；精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、明胶液化试验、β-半乳糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶反应阴性；山梨醇、乳糖、鼠李糖、葡萄糖试验阳性；所述降解菌在渔业养殖环境中生长，最适生长温度28-35℃，最适生长pH为7.0-7.5，在固体培养基上，菌落呈圆形，较薄，白色，半透明；所述降解菌可利用蔗糖。
2.权利要求1所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌在含孔雀石绿和隐性孔雀石绿的渔业养殖环境降解去除孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留、修复渔业养殖环境中的应用。
3.权利要求1所述孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌在制备用于渔业养殖环境中降解孔雀石绿和隐性孔雀石绿，修复渔业养殖环境中孔雀石绿及代谢产物隐性孔雀石绿药物残留的降解剂的用途。
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