CN111690546A - 一株球红冬孢酵母zdfy1801及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株球红冬孢酵母ZDFY1801及其应用。该菌株的保藏编号为GDMCC No:60679。该菌株经18S rDNA基因鉴定为球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)，菌株ZDFY1801具有高效去除模拟养殖水体中氨氮的能力，对养殖水体中有机悬浮颗粒也具有絮凝澄清的作用。菌株ZDFY1801还可以显著抑制养殖水体的弧菌，菌株ZDFY1801具有高度的生物安全性，此外还具有丰富的营养。这些特征表明球红冬孢酵母ZDFY1801可以用于水产养殖中废水的处理同时也可以用作水产养殖动物的饵料或者作为饲料添加剂使用。

Description

一株球红冬孢酵母ZDFY1801及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株球红冬孢酵母ZDFY1801及其应用。
背景技术
在水产养殖中通常通过大量换水排放养殖废物来解决氨氮超标和病原菌大量滋生问题。随着生态文明建设的发展和社会各界环保意识的日益提高，以大量换水将养殖废物排放到自然环境中的方式难以为继，利用水产益生菌改良养殖水体逐渐得到了广大养殖工作者的认可。然而，目前市面上广泛使用的降氨氮水质益生菌以硝化细菌、亚硝化细菌等自养硝化微生物为主，该氨氮代谢过程是先通过亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸盐，再由硝化细菌把亚硝酸进一步氧化为硝酸盐。由于自养硝化细菌利用氧化过程供能且能源利用率低，因而菌株生长代谢速度缓慢，难以在养殖水体中形成优势菌种，因此，在实际水产养殖中利用自养硝化细菌调控高氨氮和快速产生氨氮的养殖水体中效果极其有限。
海洋红酵母是一类营腐生的异养真菌，作为自然环境中的分解者，能利用自然界中的有机物转化为酵母生物量，具有较强的抗逆性，且代谢效率高，能在中等及富营养的环境中迅速形成优势菌种，极易培养和发酵。海洋红酵母主要应用于水产饵料以及生产类胡萝卜素，但是未见海洋红酵母其它用途的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有多种功效的球红冬孢酵母(Rhodosporidiumsphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)(即球红冬孢酵母YLY01，又名球红冬孢酵母ZDFY1801)。
球红冬孢酵母ZDFY1801分离自海水对虾养殖水体及底泥混合样，通过在富集培养基(YPD)中加入葡萄糖做碳源，酵母提取物和蛋白胨作为氮源和生长因子，同时加入卡那霉素(Kn)和四环素(Tc)作为细菌抑制剂富集和分离获得。分离获得的不同酵母株，以IMAR培养基进行降氨氮能力的初步筛选，从具有不同降氨氮能力的候选菌株中挑选出一株对氨氮降解能力最强的菌株，即为酵母ZDFY1801(又名酵母YLY01)。IMAR培养基配方：硫酸铵0.5-1.0g、葡萄糖4-8g、蔗糖4-8g、酵母提取物0.2-0.5g、NaH2PO4 0.2-0.6g、海水1L，调pH至7.0，高压蒸汽灭菌。若制固体培养基，加入1.5wt％琼脂粉。
酵母ZDFY1801经18S rDNA扩增、测序、种系发生分析，确定为球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)，将其命名为：球红冬孢酵母(Rhodosporidiumsphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)，记为球红冬孢酵母YLY01，又名球红冬孢酵母ZDFY1801。经试验证明，球红冬孢酵母ZDFY1801在48小时内，对模拟养殖水体中的氨氮去除率达到86.7％；所述的球红冬孢酵母ZDFY1801将氨氮以异养氮同化的方式去除，无亚硝酸盐积累。球红冬孢酵母ZDFY1801具有明显的絮凝澄清水质的作用，并且在添加少量碳源的情况下，球红冬孢酵母ZDFY1801可竞争性地显著抑制养殖水体的弧菌增殖。以凡纳滨对虾为受试对象，显示球红冬孢酵母ZDFY1801具有高度的生物安全性。生化组成分析显示，球红冬孢酵母ZDFY1801具有丰富的营养成分。这些特征充分表明，球红冬孢酵母ZDFY1801可应用于水体脱除氨氮，特别是可应用于水产养殖水体脱除氨氮。球红冬孢酵母ZDFY1801可应用于絮凝澄清水体，特别是可应用于絮凝澄清水产养殖水体。球红冬孢酵母ZDFY1801可应用于水产养殖细菌病害控制，特别是控制弧菌的生长。球红冬孢酵母ZDFY1801可应用于制备水产养殖饵料或饲料剂。
本发明还提供一种水产养殖饵料或饲料剂，其含有上述的球红冬孢酵母ZDFY1801。
与现有技术相比，本发明的创新性和有益效果在于：
(1)相比于自养硝化菌，球红冬孢酵母ZDFY1801具有更高和更快的氨氮去除效率。
(2)球红冬孢酵母ZDFY1801可将氨氮以异养氮同化的方式去除，氨氮不会被硝化为亚硝酸盐，造成有毒的亚硝酸盐积累。
(3)球红冬孢酵母ZDFY1801具有絮凝澄清水质的作用，这在水产益生菌中均没有报道具有这种功能的益生菌。
(4)球红冬孢酵母ZDFY1801在养殖水体中竞争性抑制弧菌生长，因此本菌同时具有抑制水产病原菌的功效，这是常见的硝化细菌不具备的功能。
(5)球红冬孢酵母ZDFY1801具有丰富的营养，这是常见硝化细菌不具备的性质，因此可以实现养殖废物的资源化利用。
本发明的球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)于2019年6月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No:60679。
附图说明
图1为5株酵母菌对IMAR培养基中氨氮去除效果(48h)。图注：对照组为IMAR培养基，未接种菌，48h后检测；1：对照组(未加菌)；2：ZDFY1800；3：ZDFY1801(球红冬孢酵母ZDFY1801)；4：ZDFY1802；5：ZDFY1803；6：ZDFY1804。
图2为球红冬孢酵母ZDFY1801的平板菌落形态特征(A)及扫描电镜图(B)。
图3为球红冬孢酵母ZDFY1801系统发育树。
图4为球红冬孢酵母ZDFY1801对模拟养殖水体氨氮去除效果。图注：CG：对照组，EG：实验组(加入球红冬孢酵母ZDFY1801)。
图5为加入球红冬孢酵母ZDFY1801(A)与未加入球红冬孢酵母ZDFY1801的对照(B)金鱼缸水质比较。
图6为球红冬孢酵母ZDFY1801对凡纳滨对虾生物安全性检验。图注：C-，空白对照组；C+，阳性对照组(加入哈氏弧菌E385)；E，实验组(加入球红冬孢酵母ZDFY1801)。
图7为球红冬孢酵母ZDFY1801对养殖水体弧菌数量抑制效果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。
实施例1：球红冬孢酵母ZDFY1801筛选与分离
富集培养基(YPD)组成：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，去离子水1L；配制：将各成分溶于去离子水，搅拌溶解，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却即得。
YPD固体培养基，为液体培养基中加入1.5wt％琼脂粉。
降氨氮菌分离培养基(IMAR)组成：硫酸铵0.5g、葡萄糖6g、蔗糖6g、酵母提取物0.5g、NaH2PO4 0.5g、砂滤干净的海水1L；配制：将各成分溶于海水，搅拌溶解，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却即得。
样品来源：广东省茂名市电白区对虾养殖水体及池底泥混合样。
具体的实施步骤如下：无菌条件下，过滤样品135mL至灭菌的锥形瓶中，加入10×YPD培养基15mL和适量抗生素(卡那霉素[Kn,终浓度50μg/mL]+四环素[Tc,终浓度20μg/mL])，150rpm的摇床中30℃培养48h，获得富集菌液。取富集菌液100μL涂布于含抗生素的YPD固体培养基上(抗生素浓度同上)，30℃的恒温箱中培养24h，挑取形态不同的单菌落接种至YPD液体培养基(加抗生素，且抗生素浓度同上)中培养24h，在平板上划线纯化2次，得到的纯菌株再接种至IMAR培养基中培养，其中能在IMAR培养基生长良好的有5株，命名为ZDFY1800、ZDFY1801、ZDFY1802、ZDFY1803、ZDFY1804。
将这5株菌培养至相同浓度，取菌液100μL，接入到新鲜的IMAR培养基中，测定起始培养基中氨氮的浓度，培养48h后测定最终氨氮浓度，并以未加菌的IMAR培养基作为空白对照，结果发现ZDFY1801对IMAR培养基中高浓度氨氮的去除能力最强(图1)。酵母ZDFY1801菌落平板图及扫描电镜图见图2。
实施例2：球红冬孢酵母ZDFY1801分子鉴定
取ZDFY1801菌株培养菌液离心，弃上清，以菌体沉淀提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用通用引物EF3/EF4(EF3：5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’；EF4:5’-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3’)进行18S rDNA扩增(Smit et al.,1999)，并测序，其序列见序列表中SEQ ID NO.1所示，序列经Genbank数据库比对和系统发育树分析，鉴定为球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)，将其命名为：球红冬孢酵母(Rhodosporidiumsphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)。该菌株于2019年6月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No:60679。
球红冬孢酵母ZDFY1801系统发育树见图3。
实施例3：球红冬孢酵母ZDFY1801对模拟养殖水体氨氮的去除效果
取养殖水样加(NH4)2SO4调节水体氨氮浓度至10±0.2mg/L，加入葡萄糖至终浓度1g/L，0.2μm滤膜过滤除菌后分装150mL到灭菌的250mL锥形瓶中，实验组和对照组各三个重复。取用YPD培养基过夜培养的球红冬孢酵母ZDFY1801菌液2mL用灭菌海水清洗2次后悬浮成2mL，实验组分别加入悬浮ZDFY1801菌液500μL，对照组加入等量灭菌海水，于超净台取0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h水样。以便携式水质分析仪(奥克丹，无锡)进行氨氮及亚硝酸盐含量检测，测定不同时间点氨氮和亚硝酸盐含量，各时间点氨氮浓度见图4。
如图4所示，初始氨氮浓度为9.8mg/L的养殖水样，加入球红冬孢酵母ZDFY1801培养48h后，氨氮浓度降为1.3mg/L，氨氮去除效率达到86.7％。数据表明球红冬孢酵母ZDFY1801对养殖水中高氨氮具有非常强的去除能力。为了证明氨氮是被吸收同化，而非硝化过程去除，氨氮检测过程中同时对0h、12h、24h、48h各样品亚硝酸盐含量进行了检测，结果发现各组样品都未检测到亚硝酸盐存在，表明氨氮并没有转化为亚硝酸盐。由于本样品中以及上述实施例的培养基中，除了硫酸铵提供氮源，并无其它物质大量提供氮源生长。这些结果可以确定球红冬孢酵母ZDFY1801降氨氮过程为异养氨同化作用，氨氮被直接吸收去除。
实施例4：球红冬孢酵母ZDFY1801对养殖水体的净化
在二个塑料金鱼缸(A、B)中分别加入2L曝气24h的自来水，每个金鱼缸随机分配放入3尾金鱼(体长约4-6cm)，A缸加入用YPD培养基过夜培养的球红冬孢酵母ZDFY1801至终浓度约为1×104CFU/mL，每天正常投喂饲料，不换水，不吸污。B缸作为对照，不加任何菌液，其余做法与实验缸相同。72h后观察水质，记录金鱼生存状况，各取1mL养殖水，测量水体的光密度值(OD600nm)。通过观察二个金鱼养殖缸的水质，发现加入球红冬孢酵母ZDFY1801的金鱼养殖缸(A)在72h后的水质明显要比不加入球红冬孢酵母ZDFY1801的金鱼养殖缸(B)的水质清澈，而缸底有大量的颗粒明显的沉积物(图5)。对A、B缸中水体的光密度检测表明，A缸中养殖水的光密度值为0.18，B缸中养殖水的光密度值0.54，表明A缸中悬浮的微细颗粒物和细菌数量明显要少于B缸。观察及测量结果证明球红冬孢酵母ZDFY1801具有很强的絮凝净化水体的作用。此外，在72h的实验期内，未发现对照和实验缸内的金鱼活力有明显差别。
实施例5：球红冬孢酵母ZDFY1801生物安全性评价
选用健康且活力好的凡纳滨对虾(4±1cm)，随机分配到经二氧化氯消毒集装箱中，每个箱内装有40L海水。实验分为加入菌株ZDFY1801的实验组、加入灭菌海水的空白对照组和加入哈维氏弧菌E385的阳性对照组，每组10只虾，每组3个重复。取用YPD培养基过夜培养的菌株ZDFY1801和哈维氏弧菌E385，用PBS缓冲液3000rpm离心5min，洗涤2次去除培养基成分，用灭菌海水悬浮，调节至OD600nm＝1.0(约5×108CFU/mL)。实验组每个桶中加入10mL悬浮的ZDFY1801菌液，水体中菌量约为5×105CFU/mL；阳性对照组每个桶中加入10mL悬浮的哈维氏弧菌E385菌液，水体中菌量约为5×105CFU/mL；空白对照组每个桶中加入10mL的灭菌海水。实验期间，对虾正常喂养且每天对每个组的水体进行更换，换水后按上述方法重新加入菌液和灭菌海水到实验组和对照组的每个桶中，每天相同的时间点记录下每个组中存活的对虾数量，持续一周。各组对虾存活情况见图6。
图6数据显示，正常养殖一周后，实验组对虾存活率为96.7％，远高于空白对照组的86.7％和阳性对照组的40％，考虑到菌株的加入量约5×105CFU/mL，远大于哈维氏弧菌E385的致病剂量(1×104CFU/mL)，因此可以初步判断该菌株ZDFY1801对凡纳滨对虾具有较高的生物安全性。另外，实验过程中，还观察到养殖一周后，实验组对虾的水质情况明显好于两对照组。
实施例6：球红冬孢酵母ZDFY1801对养殖水体弧菌抑制
取养殖水样100μL，稀释102倍，取100μL涂布TCBS平板，于恒温培养箱中30℃过夜培养，对平板上的菌落进行计数，初步确定水样中弧菌含量。取30℃过夜培养的酵母ZDFY1801菌液10mL，3000rpm离心5min，弃上清，再用灭菌海水1mL重悬并洗涤2次，以去除培养基成分，加入灭菌海水调节细胞密度至OD600nm＝1.0(约2×107CFU/mL)。取上述养殖水样950mL，加入20g/L的葡萄糖溶液50mL，分装150mL加入到250mL的灭菌锥形瓶中。实验组和对照组各三个重复。根据上述计算的水样中弧菌含量，在实验组中加入等量的酵母ZDFY1801细胞，对照组中加入与实验组酶母悬液等体积的灭菌海水，置于摇床(150rpm)中30℃的培养。取培养48h后的实验组和对照组水样各100μL，稀释102倍涂布TCBS平板，置于恒温培养箱中30℃过夜培养，计数平板上弧菌菌落数量，并换算为弧菌的含量。
结果表明：在48h内，实验组弧菌的数量由最初的4.6×104CFU/mL下降至6.8×103CFU/mL，仅为初始数量的15％。对照组中弧菌的数量由最初的4.6×104CFU/mL稍降至3.8×104CFU/mL。48h后实验组中弧菌的数量仅为对照组的弧菌数量的18％(图7)。这一结果表明：在加入1g/L葡萄糖作为碳源的情况下，菌株ZDFY1801对养殖水样中的弧菌的生长及存活具有明显的抑制作用。
实施例7：球红冬孢酵母ZDFY1801菌株主要营养成分的测定
类胡萝卜素提取及测定采取有机溶剂提取法和分光光度测定法。粗蛋白含量测定采用凯氏法，脂肪酸含量测定采用布莱染色法，酵母多糖测定采用原酶消化和酒精沉淀法。氨基酸组成测定采用氨基酸分析仪分析。球红冬孢酵母ZDFY1801主要营养成分见表1。
表1球红冬孢酵母ZDFY1801主要营养成分含量列表
Figure BDA0002537060110000091
分析表明其蛋白质含量占干重的30.3％。总脂肪酸含量为3.24％，表明酵母ZDFY1801的脂肪酸含量较高，值得注意的是酵母ZDFY1801不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例高达的85.2％。酵母ZDFY1801粗多糖占细胞干重的16.8％，类胡萝卜素含量为1.2mg/g干重，同时酵母ZDFY1801还检测出含有丰富的B族维生素。
酵母ZDFY1801的氨基酸组成见表2。
表2球红冬孢酵母ZDFY1801氨基酸组成分析
Figure BDA0002537060110000092
由表2可见，酵母ZDFY1801水解产生16种氨基酸，其中甲壳动物必须氨基酸有9种，占氨基酸总量的50.2％，6种呈味氨基酸占氨基酸总量的39％，超过其平均值37.5％。
这些具体实施例分析表明，球红冬孢酵母ZDFY1801菌株可高效去除养殖水体的氨氮，澄清养殖水体，显著抑制养殖水体中的弧菌，具有高度的生物安全性，且具有丰富的营养成分，因此具有在用于水产养殖中废水处理以及开发成水产养殖饵料或饲料添加剂的巨大潜力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一株球红冬孢酵母ZDFY1801及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1505
<212> DNA
<213> 球红冬孢酵母 YLY01 (ZDFY1801Rhodosporidium sphaercarpum YLY01ZDFY1801)
<400> 1
aacatgggcc ttcggggctc ctatggtgaa tcatgataac tgctcgaatc gcatggcctt 60
gcgccggcga tgcttcattc aaatatctgc cctatcaact ttcgatggta ggatagaggc 120
ctaccatggt gatgacgggt aacggggaat aagggttcga ttccggagag agggcctgag 180
aaacggccct caggtctaag gacacgcagc aggcgcgcaa attatcccct ggcaacactt 240
tgccgagata gtgacaataa ataacaatgc agggctctta cgggtcttgc aattggaatg 300
agtacaattt aaatccctta acgaggatca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg 360
cggtaattcc agctccaata gcgtatatta aaattgttgc cgttaaaaag ctcgtagtcg 420
aacttcgggc tctgtcagcc ggtccgcctt cttggtgtgt acttgtttga cggagcctta 480
cctcctggtg aacggcgatg tcctttactg ggtgtcgtcg caaaccagga cttttacttt 540
gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggcctt tgcccgaata cattagcatg gaataataaa 600
ataggacgcg cgttcccatt ttgttggttt ctgagatcgc cgtaatgatt aatagggata 660
gttgggggca tttgtattcc gacgtcagag gtgaaattct tggattgccg gaagacaaac 720
tactgcgaaa gcatttgcca aggatgtttt cattgatcaa gaacgaagga agggggatcg 780
aaaacgatta gataccgttg tagtctcttc tgtaaactat gccaattggg gatcggtaca 840
ggatttttaa tgactgtatc ggcacccgaa gagaaatctt taaatgaggt tcggggggga 900
gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggtgtggagc 960
ctgcggctta atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacaca ataaggattg 1020
acagattgat agctctttct tgatcttgtg gttggtggtg catggccgtt cttagttggt 1080
ggagtgattt gtctggttaa ttccgataac gaacgagacc ttaacctgct aaatagacca 1140
gccggctttg gctagctgct gtcttcttag agggactatc agcgtttagc tgatggaagt 1200
ttgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact 1260
gacagagcca gcgagtctac cacctttgcc ggaaggcatg ggtaatcttg tgaaactctg 1320
tcgtgatggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaatacc tagtaagcgt 1380
gattcatcag atcgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgctacta 1440
ccgattgaat ggcttagtga ggcctccgga ccggctattg ggagctcgcg agaggcattc 1500
cccct 1505

Claims (10)

1.一种球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)，保藏编号为：GDMCC No:60679。
2.权利要求1所述的球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)在水体脱除氨氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是在水产养殖水体脱除氨氮中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的球红冬孢酵母(Rhodosporidiumsphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)将氨氮以异养氮同化的方式去除，无亚硝酸盐积累。
5.权利要求1所述的球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)在絮凝澄清水体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在絮凝澄清水产养殖水体中的应用。
7.权利要求1所述的球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)在水产养殖细菌病害控制中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的细菌病害为弧菌。
9.权利要求1所述的球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)在制备水产养殖饵料或饲料剂中的应用。
10.一种水产养殖饵料或饲料剂，其特征在于，含有权利要求1所述的球红冬孢酵母(Rhodosporidium sphaercarpum)YLY01(ZDFY1801)。
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