CN107835821B - 用于从微生物荚膜多糖分离蛋白质和其他杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从微生物荚膜多糖除去蛋白质和其他杂质的方法。更具体地，本发明涉及在除去蛋白质和其他杂质之后以纯的形式分离微生物荚膜多糖。
Description
技术领域
本发明涉及从微生物荚膜多糖除去蛋白质和其他杂质的方法。更具体地，本发明涉及在除去蛋白质和其他杂质之后以纯的形式分离微生物荚膜多糖。
背景技术
疫苗模拟特定的疾病，且在这种情况下使身体启动防御机制或提高免疫应答，使身体对抗病原体。制造疫苗的过程的每个阶段特别重要，以确保其对于人类应用是安全的。多糖是用于许多工业应用诸如许多商业产品中的增稠剂、胶凝剂、乳化剂和递送系统的糖。也可以将存在于微生物细胞上的荚膜多糖用作免疫的组分。在以配制组合物用纯化的荚膜多糖免疫时，其通过诱导各种免疫应答预防引起疾病的有机体，如脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌和伤寒沙门氏菌。
结合疫苗(conjugated vaccine)触发包含在儿童和免疫受损的个体以及中老人人群中的改善的免疫原性应答。与蛋白质如CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素、其他表面蛋白质结合的多糖得到了良好的证明且是高度免疫原性的。纽莫法23(Pneumovax 23)是来自不同的肺炎球菌血清型的非结合多糖的组合，Prevnar 13进而是13种肺炎球菌血清型的13价结合多糖。蛋白质多糖结合物已经被有效地用作治疗脑膜炎、菌血症、肺炎、会厌炎等的预防性试剂。
批准用于人类应用的所有这些免疫原性或疫苗制剂需要高度纯化形式的多糖。荚膜多糖存在于细菌细胞的外表面上。在从细胞分离多糖的期间，细胞组分如核酸、蛋白质、细胞壁等释放。用于分离/纯化多糖的过程涉及色谱法，过滤，用洗涤剂、溶剂、酶处理来水解核酸、蛋白质、多糖等多个步骤。
在涉及预防由有机体肺炎链球菌引起的攻击性疾病的多价结合肺炎球菌疫苗的制备中，使选定的肺炎链球菌血清型在优化的营养物中生长以获得生产疫苗所需的必要多糖。使细胞在大的发酵罐中生长，在发酵最后通过添加脱氧胆酸钠(DOC)或可替换的裂解试剂诱导裂解。然后收获裂解物肉汤用于下游纯化和细菌细胞周围的荚膜多糖的回收。尽管在该过程中产生的细胞裂解物包含目标多糖，但是其还包含大量的细胞碎屑，包括蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质。
以下参考文献公开了用于从荚膜多糖除去蛋白质和其他杂质的各种方法。
IPCOM000237738D(2014)公开了肺炎球菌多糖抗原的纯化，其中开发了使用CaptoTM粘附、多模式阴离子交换剂的色谱步骤来替换传统的苯酚萃取的有害步骤。
1572/MUM/2010公开了从抗原多糖除去蛋白质污染物的纯化过程，其包括：a)从裂解肉汤中得到粗的细菌多糖；b)使粗的多糖经受浓缩和渗滤；c)用核酸酶处理包含多糖的溶液；d)用洗涤剂和盐水的混合物处理经核酸酶处理的多糖溶液；e)将pH调节到6.1和6.3之间，以及在2至8℃下温育混合物10至14小时；f)使多糖溶液经受离心，随后渗滤；g)通过色谱法处理溶液，其中所述方法导致蛋白质减少。
US 4,242,501公开了制备纯化的荚膜多糖的方法，其涉及一个或两个醇沉淀反应。
US 5,714,354描述了使用阳离子洗涤剂纯化肺炎球菌多糖的不含醇的过程。
US 5,847,112公开了用于制造具有降低的多分散性的血清型6B的肺炎链球菌的尺寸减小的荚膜多糖的过程，其包括通过使荚膜多糖经受选自由以下各项组成的组的尺寸减小处理来减小血清型6B的粗荚膜多糖的尺寸：热处理、声波处理、化学水解、内分解酶处理和物理剪切。
WO 2006/082527 A2公开了无乳链球菌的荚膜多糖的纯化过程，其中最初用醇和钙盐的水性混合物处理糖，随后用阳离子洗涤剂沉淀。
WO 2008/045852 A2描述了用于纯化肺炎球菌多糖血清型3的方法，其中采用加热和低pH沉淀过程。
WO 2012/127485 Al公开了用于纯化肺炎球菌多糖的不含醇和CTAB的方法，其中基于它们的净表面电荷差异利用色谱法分离多糖的C-Ps(PnPs)。
然而，以上现有技术参考文献公开了用于除去杂质的色谱法、低pH沉淀、醇沉淀、不含醇的过程等，其是繁重的且需要多个处理步骤。一些参考文献示出了因为随后除去可溶的蛋白质来满足纯化的多糖技术规格困难而示出了最小的杂质减少，因此特别是对于某些血清型，存在除去污染的可溶的蛋白质的沉重负担。苯酚是有毒的，以及色谱法需要更多的技术投入和高价的树脂，这使得过程在商业上是不经济的。因此，需要从复杂的细胞裂解物中除去蛋白质杂质的改善的方法。
本发明的发明人在开发可以容易地规模化的简单有效的方法的持续努力中发现，当将包含多糖和其他杂质的溶液暴露于SiO2时，产生的溶液高度富含具有减少的蛋白质和其他杂质的多糖。
发明目的
本发明的目的是提供用于纯化多糖的改善方法，其具有减少的蛋白含量和其他杂质并可以容易地规模化。
本发明的另一个目的是提供以简单且有效方式纯化多糖的改善过程。
发明内容
因此，本发明提供了用于以基本上纯的形式分离多糖的方法，包括将包含多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的溶液暴露于SiO2(二氧化硅)或使其与SiO2接触，以及从蛋白质、核酸、细胞壁多糖和其他源自细胞的物质的混合物中分离多糖。
附图说明
图1：比较SiO2处理前后不同的肺炎球菌血清型的蛋白质杂质水平。
图2：肺炎球菌多糖血清型18C的SDS-PAGE结果：SiO2处理前后的蛋白质减少。
图3：肺炎球菌多糖血清型23F的SDS-PAGE结果：SiO2处理前后的蛋白质减少。
具体实施方式
本发明提供了用于分离多糖的方法，其中多糖来源是细菌、酵母、丝状真菌、藻类或植物细胞等，该方法包括将包含多糖的溶液暴露于SiO2和可选的其他试剂。暴露于SiO2且分离之后产生的溶液富含多糖，一种或多种杂质诸如蛋白质、核酸、细胞壁多糖和其他源自细胞的物质减少。
根据本发明得到的多糖是基本上纯的形式。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及用于减少或除去复杂的细胞肺炎链球菌裂解物或离心分离液中的蛋白质杂质的方法，肺炎链球菌裂解物或离心分离液包含一种或多种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F多糖。
在一个实施方式中，使用的SiO2可以是以不同的形式/粒径，诸如0.01μm至200μm范围内、优选地3至40μm范围内的精细颗粒。使用的SiO2的量可以在0.5至20％(w/v)的范围。可以可选地通过在使用之前加热到高于60℃并持续至少1小时以及冷却来制备使用的SiO2。使用的SiO2可以是质子化的或脱质子化的。
在又一个实施方式中，用于多糖的纯化过程的其他试剂可以选自浓度为至少0.1％(w/v)的氯化钠、硫酸铵等或浓度为至少2％(v/v)的有机溶剂诸如醇。可以将其他试剂用于进一步减少杂质和使溶液富含多糖。
在另一个实施方式中，可以将溶液的pH保持在酸性区域至碱性区域的范围内，并且优选3.0至9.0。可以使用酸诸如乙酸、磷酸、甲酸、盐酸等和碱诸如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵等调节pH。
在另一个实施方式中，使包含多糖和其他杂质的溶液与SiO2接触或使其暴露于SiO2是在15℃至60℃范围的温度下进行的，持续10min至16小时的时间。
在另一个实施方式中，本发明涉及用活性炭处理多糖溶液以除去颜色和其他杂质。在暴露于SiO2之前或暴露于SiO2之后，进行这种处理。
使用本发明所描述的方法纯化的多糖可以用于不同的应用，如化妆品、食品、医药和生物医药行业。
如在本文中使用的，术语“基本上纯的形式”是指与在暴露于SiO2之前的裂解物或离心分离液中的蛋白质的浓度相比，除去了多糖裂解物或离心分离液中的至少30％的蛋白质。用于量化细胞裂解物或离心分离液中的蛋白质浓度的方法是本领域众所周知的，并包括例如生化法诸如Bradford试验、BCA试验、Lowry试验，分析法诸如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析、色谱法和电泳(参见例如Deutscher,M.P.(ed.),Guide toProtein Purification,San Diego:Academic Press,Inc.(1990))。
本发明还提供了用于纯化细菌中的荚膜糖的方法，其中(a)方法的产率是至少10％，以及(b)糖的相对纯度是至少30％。
在另一个实施方式中，本发明提供了以纯的形式分离多糖的方法，包括
i)将包含多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的溶液暴露于SiO2，
ii)以纯的形式分离多糖溶液，以及
iii)通过过滤或通过离心从多糖分离二氧化硅颗粒。
在本发明的方法中得到的多糖浓度可以是0.1至大于l0mg/ml。
在另一个实施方式中，本发明提供了以纯的形式分离多糖的方法，包括
i)制备包含多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的多糖溶液，
ii)用洗涤剂处理多糖溶液以除去核酸和其他杂质
ii)在水或缓冲液中制备SiO2的悬浮液，
iii)将SiO2的悬浮液添加到步骤(i)的多糖溶液中，以及
iv)以纯的形式分离多糖溶液。
本发明中用于分离多糖使用的缓冲液包括磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液等。
蛋白质具有亲水表面和疏水凹处。当用二氧化硅温育多糖制剂时，蛋白质杂质与二氧化硅结合并与多糖分离，一种亲水或疏水或简单的吸附机制。
用于本发明的洗涤剂包括CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、西曲氯铵、氯化苄乙氧铵等。
术语暴露或接触是指用其他组分温育多糖制剂来处理样品以除去杂质，来制造纯的多糖。
在一个优选的实施方式中，本发明提供了以纯的形式分离多糖的方法，包括
i)制备包含肺炎球菌荚膜多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的多糖溶液，其中，将溶液的pH保持在3.0至9.0的范围，
ii)可选地添加其他试剂，
iii)可选地用活性炭处理溶液，
iv)在水或缓冲液中制备具有0.01μm至200μm范围内的颗粒的SiO2的悬浮液，
v)在15℃至60℃范围的温度下，对于10min至20h的时间段，将SiO2的悬浮液添加到步骤(i)的多糖溶液中，
vi)可选地用活性炭处理溶液，
vii)可选地添加其他试剂，以及
viii)以纯的形式分离多糖溶液。
其他试剂可以选自氯化钠、硫酸铵、醇等或它们的混合物。
可以在进一步修饰或不修饰以用于免疫的情况下，将本发明的纯化的荚膜多糖用作免疫原。为了免疫目的，优选的是将糖结合到载体分子，诸如蛋白质。
优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，诸如白喉类毒素或破伤风类毒素或白喉毒素的CRM197变体等。
在又一个实施方式中，本发明提供了结合至载体蛋白的包含根据本发明制备的荚膜多糖的免疫原性组合物，载体蛋白选自白喉类毒素或破伤风类毒素或CRM197。
在又一个优选的实施方式中，本发明提供了结合至CRM197载体蛋白的包含来自一种或多种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F的荚膜多糖的免疫原性组合物。
在市场上可获得的一些常用的品牌SiO2(二氧化硅)是
可以用于本发明。
可以通过本领域已知的任何方法制备包含多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的多糖溶液。
暴露于SiO2或接触SiO2之后，通过常规方法进行以纯的形式分离荚膜多糖。
参考以下给出的实施例更具体地说明本发明。然而，应理解本发明不以任何方式限于这些实施例。
实施例1
肺炎链球菌发酵肉汤，通过添加脱氧胆酸盐(0.005％至2％)进行细胞裂解。脱氧胆酸盐温育之后，肉汤在10000至15000g下离心并收集上清液。用酸如正磷酸、盐酸等调节上清液pH至pH 4-6，并温育3小时至过夜。再次调节几种血清型的pH至中性，并加热到至多达60℃，持续10至150min。在10000至15000g下离心多糖，丢弃粒料。经由通过深度过滤器或0.22或0.45μm的过滤器使上清液更澄清。在30至300kDa的超滤膜上浓缩滤液4至15倍。对于磷酸盐缓冲液，缓冲液交换浓缩液至多达4至12个渗滤体积(dia volume，透析体积)。向浓缩和缓冲液交换的多糖中添加CTAB，即0.2％至5％，在4℃至40℃温育2h至过夜。在添加0.05M至2M范围的CTAB之前，将氯化钠添加到几种多糖中。
CTAB处理之后，通过在10000至15000g下离心来分离粒料。使上清液通过炭柱/过滤器。将3至10％(W/V)范围内的活性二氧化硅添加到炭过滤的多糖中，并添加0.5M至3M的NaCl。在5℃至40℃的温度下将多糖制剂暴露于二氧化硅2小时至26小时。通过离心/布过滤/袋子过滤从多糖溶液中分离二氧化硅。使滤液流过深度过滤器、炭过滤器和0.22至5μm的过滤器。浓缩过滤的多糖并在10kDa至500kDa的膜上渗滤。将多糖缓冲交换至磷酸盐缓冲液或WFI。使纯化的多糖制剂通过0.22μm的过滤器，并在LAFU下收集到LDPE袋中。将纯化的多糖存储在>-20℃下。
表1：除去不同的肺炎球菌多糖中的蛋白质
BDL：低于检测限
该实施方式描述了脱质子化对除去多糖制剂中的杂质的影响。如表2中所描绘的，通过脱质子化和质子化的SiO2除去蛋白质杂质。因此，可以将脱质子化以及质子化的SiO2用于除去杂质。
表2：
脱质子化对除去不同的肺炎球菌多糖中蛋白质的影响
BDL：低于检测限
条件：
5％(w/v)，NaCl 1M，在室温下温育lh。
可以使用0.1％至10％范围内或更高浓度的
通过用SiO2处理一小时至大于17小时完全除去蛋白质。可以通过添加NaCl至SiO2悬浮液改善杂质去除。
表3：
浓度对肺炎球菌多糖血清型6B的蛋白质去除的影响
BDL：低于检测限
条件：NaCl 1M；在室温下温育lh。
该实施方式还支持脱质子化的
可以在0.1M至2.5M或更高范围的NaCl的存在下有效除去蛋白质。可以使用0.1μm至100s微米范围或尺寸的SiO2颗粒。
表4：aeroperl浓度对肺炎球菌多糖血清型6B的蛋白质去除的影响
BDL：低于检测限
条件：NaCl 1M，在室温下温育lh
发酵肉汤包含大量的污染物。可以在一系列步骤如离心、沉淀、色谱法等中除去这些污染物。在小规模(50-100ml)和试验(15L)水平上进行本发明。在两种体积的多糖下，通过不同形式的SiO2有效除去污染物(表5和图1)。可以在多糖纯化的不同阶段引入SiO2处理。进一步地，可以通过简单的离心或过滤或通过任何其他方法诸如物理沉降、压力沉降等分离SiO2颗粒。
表5：使用aeroperl减少肺炎球菌多糖的蛋白质杂质
BDL：低于检测限
条件：Aeroperl：5％(w/v)，NaCl 1M，在室温下温育lh。
表6A：除去不同的肺炎球菌血清型的荚膜多糖中的蛋白质杂质
预：预aeroperl处理；后：aeroperl后处理
条件：Aeroperl 5％(w/v)，NaCl 1M，在室温下温育lh。
表6B：除去不同的肺炎球菌多糖血清型的荚膜多糖中的蛋白质杂质
BDL：低于检测限
预：预aeroperl处理；后：后aeroperl处理
ND：未检测到
条件：Aeroperl 5％(w/v)，NaCl 1M，在室温下温育lh。
对各种血清型的纯化的多糖设定了污染物限度以降低疫苗的不利事件的风险。污染物CWPS是一种。本发明注意到了CWPS。在室温下通过简单混合，随后从多糖样品中分离SiO2除去CWPS。多糖样品与SiO2的接触时间可以从10min至大于18h变化(表7)。
表7：除去不同的肺炎球菌多糖血清型中的细胞壁多糖(CWPS)
条件：Aerosil 5％(w/v)，NaCl 1M；在室温下温育lh
可以通过SDS-PAGE使蛋白质杂质去除形象化。将肺炎球菌多糖血清型18C和23F蛋白质杂质减少至技术规格的限度。如图2和3中所描绘的，在线2和3中可以看到明显去除了蛋白质。表8呈现了结果。
表8：
处理前后的蛋白质浓度(图2和3)
Claims (13)
1.一种以基本上纯的形式从选自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae typeb)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的细菌分离荚膜多糖的改善的方法，所述方法包括：
用洗涤剂处理包含多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的裂解细胞的溶液以除去核酸和其他杂质；
将已经用洗涤剂处理的溶液暴露于SiO2或使所述溶液与SiO2接触；
通过离心或过滤从多糖溶液分离SiO2；以及
以纯的形式分离所述荚膜多糖，其中，SiO2的粒径在0.01μm至200μm的范围内，并且SiO2的量在0.5至20％w/v的范围内。
2.根据权利要求1所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，SiO2的粒径在3μm至40μm的范围内。
3.根据权利要求1所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，肺炎链球菌的血清型是选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，将包含多糖和其他杂质的所述溶液暴露于SiO2或使所述溶液与SiO2接触在15℃至60℃范围内的温度下进行，持续10min至16小时的时间。
5.根据权利要求1所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，经纯化的荚膜多糖进一步结合至选自白喉类毒素或破伤风类毒素的载体蛋白。
6.根据权利要求5所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，所述白喉类毒素是CRM197。
7.一种以纯的形式从选自脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌和伤寒沙门氏菌的细菌分离荚膜多糖的改善的方法，包括以下步骤
i)裂解细胞以制备包含荚膜多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的多糖溶液，其中，将所述溶液的pH保持在3.0至9.0的范围内；
ii)用洗涤剂处理步骤i)的多糖溶液以除去核酸和其他杂质；
iii)添加其他试剂；
iv)用活性炭处理所述溶液；
v)在水或缓冲液中制备SiO2的悬浮液，
vi)在15℃至60℃范围内的温度下将所述SiO2的悬浮液添加到步骤iv)之后所获得的所述多糖溶液中，持续10min至20小时的时间，
vii)通过离心或过滤从多糖溶液分离SiO2；以及
viii)以纯的形式分离所述荚膜多糖溶液；
其中，SiO2的粒径在0.01μm至200μm的范围内，并且SiO2的量在0.5至20％w/v的范围内。
8.根据权利要求7所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，SiO2的尺寸在3μm至40μm的范围内。
9.根据权利要求7所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，所述细菌是肺炎链球菌，并且其中，肺炎链球菌的血清型是选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F中的一种或多种。
10.根据权利要求7所述的分离荚膜多糖的改善的方法，其中，使包含多糖和其他杂质的所述溶液与SiO2接触或将所述溶液暴露于SiO2在15℃至60℃范围内的温度下进行，持续10min至16小时的时间。
11.一种以纯的形式分离肺炎球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤
i)裂解细胞以制备包含肺炎球菌荚膜多糖、蛋白质、核酸、细胞壁组分和其他杂质的多糖溶液，其中，将所述溶液的pH保持在3.0至9.0的范围内，
ii)用洗涤剂处理步骤i)的多糖溶液以除去核酸和其他杂质；
iii)添加其他试剂；
iv)用活性炭处理所述溶液；
v)在水或缓冲液中制备具有0.01μm至200μm范围内的粒径的SiO2的悬浮液，
vi)在10min至20h的时间内在15℃至60℃范围的温度下，将所述SiO2的悬浮液添加到步骤iv)之后获得的所述多糖溶液中；
vii)通过离心或过滤从多糖溶液分离SiO2；
viiii)可选地用活性炭处理所述溶液，
ix)可选地添加其他试剂，以及
viii)以纯的形式分离所述多糖溶液；
其中，所述其他试剂选自氯化钠、硫酸铵、醇或它们的混合物。
12.根据权利要求11所述的分离肺炎球菌荚膜多糖的方法，其中，所述肺炎球菌荚膜多糖分离自肺炎链球菌，并且其中，肺炎链球菌的血清型是选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F中的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的分离肺炎球菌荚膜多糖的方法，其中，使包含多糖和其他杂质的所述溶液与SiO2接触或将所述溶液暴露于SiO2在15℃至60℃范围内的温度下进行，持续10min至16小时的时间。
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