CN114450576A - 碳水化合物定量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于定量给定水性样品中的碳水化合物的基于比色法的方法。由本发明提供的方法使用2‑苯氧基乙醇作为用于定量给定样品中的碳水化合物的新试剂。本发明是一种快速、灵敏、简单和直接的碳水化合物定量方法。

Description

碳水化合物定量的方法
技术领域
本发明涉及用于估计碳水化合物的方法。更具体地，本发明涉及当碳水化合物以低浓度存在于药物、生物药和生物制品(biological)中时，使用芳族乙醇的碳水化合物定量方法。
背景技术
碳水化合物或多糖含量的定量是食品和饮料、营养品、农产品、医药产品和疫苗开发中的基本分析程序。多糖通常使用蒽酮试剂和葡萄糖为标准，通过生化分析进行定量。使用试剂如苔黑酚(orcinol)或苯酚-硫酸与比色反应的其他生化方法也主要用于多糖估计。为了提高比色法的灵敏度，这些方法(蒽酮试剂和H2SO4的浓度、加热时间和温度等)的多项修改已在前面报道。这些修改旨在增强蒽酮-糠醛复合物的显色，其改善光密度信号，从而提高测试的定量灵敏度。另一方面，这些分析含有糖醛酸(葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)和己糖胺(岩藻糖胺、葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、肺炎糖胺(Pneumosamine))混合物的多糖的方法显色较低。这些方法不能产生最佳的颜色复合物，并且灵敏度较低，因此不太适合评估此类碳水化合物/多糖。
在硫酸存在下的碳水化合物定量期间，己糖和戊糖分别水解并转化为5-羟甲基糠醛和糠醛。然后这些由酸水解产生的分子与蒽酮或苯酚反应以形成颜色复合物，然后在特定波长下测量其光密度(OD)。蒽酮-糠醛复合物的吸收最大值在625nm，苯酚-糠醛复合物的吸收最大值在490nm。这两种方法中的吸光度强度随多糖的组成而变化，因为不同的多糖含有不同的糖，如己糖、戊糖、糖醛酸、己糖胺、戊糖胺、乙交酯、糖蛋白和核酸等，且比例不同。
在结合疫苗(conjugate vaccine)中，多糖与载体蛋白结合，将每种多糖的量控制在规定剂量内对于维持疫苗的质量和效力是至关重要的。在微克水平上准确定量多糖对于开发疫苗是至关重要的。多糖是己糖、戊糖、糖醛酸和己糖胺的复杂混合物。
为了定量肺炎球菌血清型或其组分(甲基戊糖、糖醛酸、己糖胺、O-乙酰基、磷和氮)的总多糖含量，报告了各种生化方法。其中大多数使用酸水解来释放单糖，其使用带有脉冲安培检测器(PAD)的高效阴离子交换色谱(HPAEC)对单糖进行定量，或酸水解连同衍生化，然后使用连接到质量选择检测器(GC-MSD)的气相色谱对单糖进行定量。
报告的用于定量含己糖胺的肺炎球菌多糖的另一种方法是基于酸水解、re-N-乙酰化，然后通过还原胺化用2-氨基苯甲酰胺标记己糖胺，然后使用荧光检测器进行RP-HPLC。虽然这些方法灵敏、准确，但它们费时费力。
印度专利申请号5856/DELNP/2009公开了使用硫酸和蒽酮试剂或硫酸和四硼酸盐试剂使用自动比色测试对多糖进行定量。
EP 2290366 Al公开了在不干扰单糖和来自组合物中任何其他糖材料的情况下对糖疫苗的分析，包括通过使用三氟乙酸(TFA)对脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清群C、W135和Y进行酸水解来定量单糖(唾液酸、半乳糖和葡萄糖)的过程。
Roman Dreywood(碳水化合物材料的定性测试：1946年8月)，公开了使用蒽酮在浓硫酸中的溶液对碳水化合物材料进行定性分析，这使碳水化合物材料呈现永久绿色。
Philippe等人(Vaccine 20(2002)2474-2484)公开了使用HPAEC-PAD对肺炎球菌多糖和结合物进行定量测试，其中肺炎球菌多糖进行3种不同的水解方法：三氟乙酸(TEA)、甲醇解然后TFA水解和氢氟酸然后TFA水解。
Vincent等人(Anal.Chem.2010,82,1786-1792)，公开了用于测定碳水化合物浓度的蒽酮测定法的自动化，其中多糖试样和标准品在吸光度625nm下在硫酸中蒽酮的浓缩混合物中加热。
Verdnica等人(Analytical Biochemistry 421(2012)250-255)公开了使用苯酚-硫酸，HPSEC(10mM Na2HP04,0.15M NaCl,pH 7.5)，竞争性ELISA(加入在磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的邻苯二胺二盐酸盐，pH 5.0,和0.05％过氧化氢，并用4.5M H2SO4停止反应，吸光度为492nm)和夹心ELISA方法，对培养肉汤样本中肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型14的荚膜多糖进行定量，其中夹心ELISA被发现是重现性和灵敏度最好、最不易受干扰的方法。
Earl Zablackis等人(Vaccine Analysis:Strategies,Principles,and Controlpp 271-299,2015)公开了细菌多糖疫苗及其分析前景，其中细菌多糖通过比色法进行定量，其中多糖用硫酸/硼酸溶液加热以释放单糖(糖醛酸)，然后冷却，添加咔唑/乙醇溶液，并在530nm处读取吸光度。多糖(己糖胺)用HC1消化，冷却，然后与乙酰丙酮/碳酸钠反应，然后与埃尔利希试剂反应，并在530nm处读取吸光度。
上述现有技术公开了定量多糖的各种方法。然而，这些方法存在各种缺陷，因此，需要开发新的方法来增强显色，从而提高灵敏度。当碳水化合物以低浓度存在于任何样品(包括但不限于药品、生物药、生物制品、化妆品、环境基质、食品、法医样品、工业化学品和营养品)中时，增强的灵敏度可提供适当的碳水化合物估计。
发明内容
发明目的
本发明的主要目的是开发一种简单、直接、灵敏度更高的多糖定量方法。
本发明的另一个目的是开发一种当多糖以低浓度存在于诸如药品、生物药、生物制品、化妆品、环境基质、食品、法医样品、工业化学品和营养品的样品中时简单而直接的定量多糖方法。
发明概述
在一个方面，本发明涉及一种使用芳族乙醇(例如2-苯氧基乙醇(2-PE))定量碳水化合物(carbohydrate，糖类)的方法。
本发明提供了一种基于比色法的水性样品本中碳水化合物的定量方法，该方法包括以下步骤：
a.将硫酸和2-苯氧基乙醇与含有碳水化合物的水性样品混合以获得反应混合物；
b.温育反应混合物以形成有色复合物；和
c.测量有色复合物的吸光度，以定量水性样品中存在的碳水化合物量。
在一个方面中，本发明涉及用于估计碳水化合物(例如单糖、二糖、多糖、糖醛酸、己糖胺及其衍生物及其组合)的方法。
在又一方面，本发明还提供了一种用于定量样品中碳水化合物的试剂盒。
附图说明
图1示出了单糖与2-PE(500nm)、蒽酮(625nm)和苯酚(490nm)试剂反应时的吸光度；
图2示出了多糖(肺炎球菌多糖、普鲁兰多糖800和淀粉)与2-PE(500nm)、蒽酮(625nm)和苯酚(490nm)试剂反应时的吸光度；和
图3示出了肺炎球菌多糖的吸光度，表示为在纯化多糖中存在已知杂质(2和5％w/v)时的％回收率。
具体实施方式
本发明涉及使用芳族乙醇(例如2-苯氧基乙醇)估计碳水化合物的方法。更具体地，本发明涉及当碳水化合物以低浓度存在于药物、生物药如疫苗、蛋白质制剂、肽制剂和其他生物制品中时，使用2-苯氧基乙醇的碳水化合物定量方法。
在一个实施方案中，本发明涉及估计水性样品中的碳水化合物，例如单糖、二糖、多糖、糖醛酸、己糖胺及其衍生物及其组合。
在本发明的一个实施方案中，单糖包括但不限于葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、核糖及其衍生物及其组合。
在本发明的一个实施方案中，二糖包括但不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其衍生物及其组合。
在本发明的一个实施方案中，糖醛酸包括但不限于葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸及其衍生物及其组合。
在本发明的一个实施方案中，己糖胺包括但不限于岩藻糖胺、葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、肺炎糖胺(Pneumosamine)、N-乙酰基L-岩藻糖胺和N-乙酰基L-肺炎糖胺(Pneumosamine)、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基甘露糖胺及其衍生物及其组合。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于定量多糖(例如肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖、VI多糖、O2多糖)和其他碳水化合物(例如纤维素、淀粉、甲壳素、葡聚糖和普鲁兰多糖等)的方法。
在本发明的一个实施方案中，如PCT公开号WO2016/174683A1中所述制备肺炎球菌多糖，并通过1H NMR分析推断其结构。发现纯化的荚膜多糖符合市售规定的单糖组成，如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖；糖醛酸如葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等；己糖胺，如N-乙酰基L-岩藻糖胺和N-乙酰基L-肺炎糖胺(pneumosamine)、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺；O-乙酰基、磷和氮含量。
本发明的发明人在持续努力开发用于多糖定量的高灵敏度方法的过程中，开发了使用芳族醇(例如2-PE(2-苯氧基乙醇))定量碳水化合物的方法。与其他方法相比，所开发的方法提供更高的特异性和灵敏度，例如用蒽酮或苯酚进行定量，并有助于在广泛的样品中对宽范围的碳水化合物、糖和/或多糖进行定量。
2-PE与多糖酸水解形成的糠醛或5-羟甲基糠醛反应，在500nm处具有吸光度最大值。此外，该方法中的显色不受含糖醛酸的多糖的影响。此外，可以使用本发明对多糖-蛋白质结合物进行定量，并且比蒽酮试剂具有增加的灵敏度。从细菌(肺炎链球菌，Streptococcus Pneumoniae)、糖及其各自的酸中分离的多糖与2-PE的反应性增强，从而提高了方法的灵敏度。该方法简单、直接，可作为任何类型多糖定量的常规技术。总的来说，本发明方法的更高灵敏度将有助于以比其他报告方法更高的灵敏度对宽范围的碳水化合物、糖和/或多糖进行定量。
在一个实施方案中，本发明提供了一种定量水性样品中碳水化合物的方法，包括以下步骤：
a.将硫酸和2-苯氧基乙醇与水性样品混合以获得反应混合物；
b.温育反应混合物以形成有色复合物；和
c.测量有色复合物的吸光度，以定量水性样品中存在的碳水化合物量。
在另一个实施方案中，样品中碳水化合物的量与测得的有色复合物吸光度成比例。
在本发明更优选的实施方案中，用浓硫酸处理碳水化合物样品以获得反应混合物。
在本发明的一个实施方案中，添加到含碳水化合物的水性样品中的硫酸的体积为含碳水化合物的水性样品体积的约1至3倍。
如本文所用，术语“约”考虑了给定数量的该数字的幅度±25％的数值范围。在某些实施方案中，术语“约”考虑了给定数量的该数字的幅度±20％、±15％、±10％或±5％的数值范围。
在本发明的另一个实施方案中，添加到含碳水化合物的水性样品中的硫酸体积是含碳水化合物的水性样品体积的两倍。
在本发明的一个实施方案中，相对于反应混合物，2-苯氧基乙醇的浓度范围为约0.1％v/v至2.5％v/v。
在本发明的一个实施方案中，反应混合物在约80℃至110℃的温度范围内温育。
在另一个实施方案中，反应混合物在约90℃的温度下温育。
在本发明的一个实施方案中，将反应混合物温育约1分钟至10分钟的时间段。
在另一个实施方案中，将反应混合物温育约5分钟的时间段。
在本发明的一个实施方案中，在约490nm至510nm的波长范围内测量有色复合物的吸光度。
在本发明的另一个实施方案中，在500nm的波长下测量有色复合物的吸光度。
在本发明的一个实施方案中，定量的水性样品是纯碳水化合物样品。
在本发明的另一个实施方案中，定量的水性样品是不纯碳水化合物样品。杂质包括但不限于核酸、蛋白质、脂质、残留试剂、赋形剂或其组合。
据发现，本发明的方法对存在不同杂质和制剂赋形剂的碳水化合物非常具有特异性，表明了测试法的特异性。
本文使用的术语“检测限”包括最低浓度，在该浓度下，可以认为样品中含有感兴趣物质的分子。
在本发明的一个实施方案中，检测限(LOD)小于约4μg/mL。
如本文所用，“定量限”指的是测量具有定量意义的点。
在本发明的一个实施方案中，定量限(LOQ)为至少6μg/mL。
在本发明的另一个实施方案中，定量限(LOQ)为至少8μg/mL。
在一个实施方案中，本发明的方法用于定量疫苗或生物药样品中的碳水化合物。
在本发明的一个实施方案中，对单结合物和多价肺炎球菌结合疫苗(PCV)药物产品中的碳水化合物含量进行定量。
在本发明的另一个实施方案中，对单结合物和多价PCV药物产品的总碳水化合物含量进行定量，其中肺炎球菌血清型如1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N。9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、23F、24B、24F、31、33F、34、35B、35F、38、39和45。在进行分析之前，预稀释至4-100μg/mL。
多价肺炎球菌结合疫苗可以是10价、12价、13价、14价、15价、17价、18价、19价、20价、22价、23价、24价、25价、27价、28价、29价、30价肺炎球菌疫苗组合物。
在又一个实施方案中，本发明的方法用于定量单价和多价疫苗产品中的多糖，以进行干扰和尖峰(spike)恢复评估。
在另一个实施方案中，使用本发明的方法对吸附有磷酸铝(相当于约70μg/mL多糖)的多价肺炎球菌结合疫苗进行总糖含量分析。
在本发明的一个实施方案中，定量含有来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)血清群A、C、W135、X和Y的多糖的多价脑膜炎球菌结合药物产品中的碳水化合物含量。
在本发明的一个实施方案中，定量含有Vi多糖和来自伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)和副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)的O2多糖的单价和二价伤寒结合药物产品中的碳水化合物含量。
在一个实施方案中，本发明还包括用于定量水性样品本中碳水化合物的试剂盒。
在一个实施方案中，用于定量碳水化合物的试剂盒包含硫酸、2-苯氧基乙醇或其组合。
在另一实施方案中，本发明提供了2-苯氧基乙醇用于样品中碳水化合物的定量的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了2-苯氧基乙醇用于定量样品中的碳水化合物的用途，其中所述碳水化合物选自包含单糖、二糖、多糖、糖醛酸、己糖胺、其衍生物及其组合的组。
提供以下实施例以例示本发明，这些实施例仅用于说明目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过以下三种不同方法估计单糖和多糖。
a.2-PE-硫酸测定法。
将糖类如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、核糖醇、甘油、乳糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰基L-岩藻糖胺和N-乙酰基L-肺炎糖胺(pneumosamine)、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基半乳糖胺和N-乙酰基甘露糖胺、普鲁兰多糖800，以及来自血清型1、3、5、6B、9V、14、19F、22F、23F的肺炎球菌多糖在250μL MilliQ水中稀释至20μg(基于干重)，在浓H2SO4存在下水解形成单糖或其衍生物，其在热酸性介质中脱水形成羟甲基糠醛。这些羟甲基糠醛结构随后与酚试剂反应，形成橙黄色复合物，其在500nm处产生吸光度最大值。
2-苯氧基乙醇与糖在H2SO4存在下的反应(基于Molisch测试反应)如下方案所示：
Figure BDA0003568257660000111
将250μL(80μg/mL)稀释的单糖和多糖一式三份地分配到干净干燥的玻璃管中，并一式三份地取250μL试剂/MilliQ水进行空白校正。向所有管中添加10μL的98％的2-PE和500μL的H2SO4，并轻轻涡旋。试管在90℃的水浴中温育5分钟。随后，将试管冷却至室温，将250μL转移至微孔板中，并使用酶标仪在500nm处测量吸光度。
b.苯酚-硫酸测定法。
基于干重，将所有单糖和多糖稀释至在165μL的MilliQ水中20μg，并在500μL的浓H2SO4存在下水解形成单糖或其衍生物，其在热酸性介质中脱水形成羟甲基糠醛。这些羟甲基糠醛结构随后与酚试剂反应，形成橙黄色复合物，其在490nm处产生吸光度最大值。
将0-20μg的每种标准品置于干净的玻璃管中，添加100μL的5％苯酚试剂，然后在90℃下在开口管中温育5分钟，将250μL转移至微孔板中，然后使用酶标仪在490nm下读取吸光度。
c.蒽酮-硫酸测定法。
基于干重，将所有单糖和多糖稀释至在250μL中20μg，并在H2SO4存在下水解形成单糖或其衍生物，其在热酸性介质中脱水形成羟甲基糠醛。这些羟甲基糠醛结构随后与蒽酮试剂反应形成绿色复合物，其在625nm处产生吸光度最大值。250μL(80μg/mL)一式三份分配到干净的玻璃管中，添加500μL的蒽酮试剂，然后在90℃下温育5分钟，并使用酶标仪在625nm处测量吸光度。
在所有上述三种方法中，最终反应体积为～760μL并且取250μL用于微孔板中的吸光度测量。
表1：碳水化合物估计方法
样品编号 方法 试剂 λ最大(吸光度)
1. 2-PE-硫酸测定法 芳族苯氧基乙醇 500nm
2. 苯酚-硫酸测定法 芳族苯酚组分 490nm
3. 蒽酮-硫酸测定法 三环芳族组分 625nm
结果：
单糖的吸光度
单糖与2-PE(500nm)、蒽酮(625nm)和苯酚(490nm)试剂反应时的吸光度如图1所示。
在H2SO4存在下，所有单糖都水解形成羟甲基糠醛。这些羟甲基糠醛结构在与蒽酮反应时形成绿色复合物，其在625nm处具有吸光度最大值。类似地，当羟甲基糠醛结构与2-PE反应时，产生橙黄色复合物，其在500nm处具有吸光度最大值。由葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸与蒽酮反应形成的有色复合物具有较低的吸光度(0.05和0.10OD)，而使用2-PE作为试剂的吸光度OD(光密度)单位分别为0.69和0.85。己糖，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖与2-PE的OD分别为1.55、1.07和2.07，与蒽酮的OD中分别为0.93、0.45和0.43。同样，对于鼠李糖，即甲基戊糖，与2-PE的OD为1.02，与蒽酮的OD为0.62。N-乙酰化胺(FucNAc；GlucNAc；GalNAc；ManNAc；PneuNAc)与蒽酮或2-PE试剂的OD结果略有不同(图1)。
多糖的吸光度
多糖(肺炎球菌多糖、普鲁兰多糖800和淀粉)与2-PE(500nm)、蒽酮(625nm)和苯酚(490nm)试剂反应时的吸光度如图2所示。
用于多糖水解的硫酸导致每种糖形成羟甲基糠醛。当这些羟甲基糠醛与蒽酮反应时，产生了绿色有色复合物，其吸光度最大值在625nm。类似地，当羟甲基糠醛与2-PE反应时，产生橙黄色有色复合物，其吸光度最大值在500nm。硫酸水解的肺炎球菌多糖与2-PE反应时，形成的有色复合物高于使用蒽酮试剂产生的有色复合物(图2)，从而提高了定量灵敏度，并改善了糖的LOD(检测限)下限。使用2-PE对诸如普鲁兰多糖800的其他多糖也观察到类似的灵敏度和反应性(图2)。
实施例2：单结合物和多价吸附疫苗中的多糖定量。
对不同已知浓度的肺炎球菌血清型6B和7F多蛋白结合物(每种4-100μg/mL)和多价结合疫苗样品进行2-PE分析。6B和7F多糖或结合物的百分比回收率在90-110％之间，高于其LOQ(定量限)水平(表2)。
类似地，在不同Al+3浓度(0.25、0.5和1.0mg/mL的AlPO4凝胶)下，肺炎球菌多价吸附结合疫苗中总多糖的百分比回收率分别为97、101和99(表2)，表明药物产品中没有磷酸铝的干扰。
杂质干扰与验证
纯化多糖中最常见的杂质是核酸、蛋白质和残留试剂。使用2-PE试剂(图3)反应性评估2和5％w/v水平下这些杂质对总多糖浓度的干扰。在2％杂质水平下(根据监管指南，这是最大允许限值)，对反应性没有影响，但在存在5％杂质的情况下，反应性降低了约8％。使用多糖和结合物验证该检测方法的特异性、准确性、精度、加标回收率(spike recovery)、检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
进一步评估该方法在疫苗结合物中的多糖定量。在整个标准范围内估计6B和7F(肺-CRM结合物)中的多糖浓度，以检查测试LOD和LOQ(表2)。基于多糖或结合物的回收率百分比，测试的LOD为≤4.0μg/mL，且测试的LOQ为≥8μg/mL(表2)。
本发明中使用的生物材料的来源如下：
1.肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6B从美国疾病控制和预防中心(CDC)获得
2.肺炎链球菌血清型7F从美国疾病控制和预防中心(CDC)获得
此外，使用从ATCC获得的棒状杆菌(Corynebacterium)中分离的CRM 197蛋白制备肺-CRM结合物。
表2：通过2-PE法在6B、7F单结合物和多价肺炎球菌结合物疫苗中总多糖含量
Figure BDA0003568257660000151
Figure BDA0003568257660000161
本发明的优点
1.方法简单且直接。
2.与其他已知的碳水化合物定量方法相比，该方法具有更高的特异性和灵敏度。
3.该方法可作为一种常规技术，用于在广泛的样品中定量宽范围的碳水化合物、糖和/或多糖。
4.所开发方法中的显色不受含糖醛酸的多糖的影响。
5.本发明的方法可以准确地测定在存在不同杂质和制剂赋形剂时的碳水化合物的量，表明测试法的特异性。

Claims (14)

1.一种定量水性样品中碳水化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将硫酸和2-苯氧基乙醇与含有碳水化合物的水性样品混合以获得反应混合物；
b.温育所述反应混合物以形成有色复合物；和
c.测量所述有色复合物的吸光度，以定量所述水性样品中存在的碳水化合物量。
2.如权利要求1所述的方法，其中在约490nm至510nm范围的波长下测量所述有色复合物的吸光度。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品中碳水化合物的量与所述有色复合物测得的吸光度成比例。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述碳水化合物选自包含单糖、二糖、多糖、糖醛酸、己糖胺、其衍生物及其组合的组。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述多糖选自包含肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖、VI多糖、O2多糖等的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述硫酸的体积范围为所述水性样品体积的约1至约3倍。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物中的2-苯氧基乙醇的浓度范围为约0.1％v/v至2.5％v/v。
8.如权利要求1所述的方法，其中在约80℃至110℃范围内的温度下温育所述反应混合物，以显色有色复合物。
9.如权利要求1所述的方法，其中将所述反应混合物温育约1分钟至约10分钟范围内的时间段，以显色所述有色复合物。
10.一种用于定量水性样品中碳水化合物的试剂盒，基本上包含硫酸、2-苯氧基乙醇及其组合。
11.2-苯氧基乙醇用于定量样品中的碳水化合物的用途。
12.如权利要求11所述的2-苯氧基乙醇的用途，其中所述碳水化合物选自包含单糖、二糖、多糖、糖醛酸、己糖胺、其衍生物及其组合的组。
13.2-苯氧基乙醇，用于在定量样品中的碳水化合物中使用。
14.如权利要求12所述的用于在定量样品中的碳水化合物中使用的2-苯氧基乙醇，其中所述碳水化合物选自包含单糖、二糖、多糖、糖醛酸、己糖胺、其衍生物及其组合的组。
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