JP2018514624A - 微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を分離するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を除去するための方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質および他の不純物を除去した後に純粋な形態の微生物莢膜多糖類を単離することに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を除去するための方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質および他の不純物を除去した後に純粋な形態の微生物莢膜多糖類を単離することに関する。

ワクチンは特定の疾患を模倣し、そうすることによってそれは身体に防御機構を誘発させ、あるいは免疫応答を発現させて、病原体と戦う身体をもたらす。ワクチン製造法は、それがヒトに使用するのに安全であると判定するためにあらゆる段階で特に厳密である。多糖類は多数の産業用途、たとえば多くの市販製品の増粘剤、ゲル化剤、および送達システムに用いられる炭水化物である。微生物細胞に存在する莢膜多糖類は免疫化の成分としても使用できる。配合組成物中の精製された莢膜多糖類により免疫化すると、それは髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、ｂ型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、およびチフス菌(Salmonella typhi)などの生物が引き起こす疾患を、それぞれの免疫応答の誘発により予防する。

コンジュゲートワクチンは、小児および免疫無防備状態の個体におけるもの、ならびに高齢者集団におけるものをも含めて、改良された免疫原応答を誘発する。ＣＲＭ_１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、他の表面タンパク質などのタンパク質とコンジュゲートした多糖類コンジュゲートは、十分に証明された高い免疫原性のものである。Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ ２３は種々の肺炎球菌血清型からの非コンジュゲート−多糖類の組合わせであり、それに対しＰｒｅｖｎａｒ １３は１３種類の肺炎球菌血清型の１３価コンジュゲート多糖類である。タンパク質−多糖類コンジュゲートは、髄膜炎、菌血症、肺炎、喉頭蓋炎(epiglottitis)などの処置のための予防剤として効果的に用いられている。

ヒト用として承認されたそのような免疫原製剤またはワクチン製剤はすべて、高度に精製された形態の多糖類を必要とする。莢膜多糖類は細菌細胞の外面に存在する。多糖類を細胞から分離する際に、核酸、タンパク質、細胞壁などの細胞成分が放出される。多糖類の単離／精製のためのプロセスは、クロマトグラフィー、濾過から、界面活性剤、溶媒、酵素（核酸、タンパク質、多糖類などを加水分解するためのもの）による処理にまでわたる、多数の工程を伴う。

生物である肺炎球菌により引き起こされる侵襲性疾患の予防を目的とする多価コンジュゲート肺炎球菌ワクチンを調製する際には、選択した肺炎球菌血清型を最適化栄養素中で増殖させて、ワクチンを製造するのに必要な要求される多糖類を得る。細胞を大型発酵槽内で増殖させ、発酵終了時にデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）または別の細胞溶解剤の添加により細胞溶解を誘発する。細菌細胞を囲む莢膜多糖類を下流で精製および回収するために、溶解物ブロスを次いで収穫する。このプロセスで調製された細胞溶解物は目標とする多糖類を含有するが、それはタンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む大量の細胞屑をも含有する。

以下の参考文献はタンパク質および他の不純物を莢膜多糖類から除去するための多様な方法を開示する：
IPCOM000237738D (2014)には、肺炎球菌多糖類抗原の精製が開示され、その際、従来の有害なフェノール抽出工程に代わるＣａｐｔｏＴＭ ａｄｈｅｒｅ、すなわちマルチモーダルアニオン交換体を用いるクロマトグラフィー工程が開発された。

1572/MUM/2010には、汚染タンパク質を抗原性多糖類から除去するための下記を含む精製プロセスが開示されている：ａ）細胞溶解ブロスから粗製細菌性多糖類を得る；ｂ）その粗製多糖類に濃縮および透析濾過を施す；ｃ）多糖類を含有する溶液をヌクレアーゼで処理する；ｄ）ヌクレアーゼ処理した多糖類溶液を界面活性剤と生理食塩水の混合物で処理する；ｅ）ｐＨを６．１〜６．３に調整し、混合物を２〜８℃で１０〜１４時間インキュベートする；ｆ）多糖類溶液に、遠心分離、続いて透析濾過を施す；ｇ）溶液をクロマトグラフィーにより処理すると、そのプロセスによりタンパク質が減少する。

US 4,242,501には、１回以上のアルコール沈殿を伴う、精製された莢膜多糖類の調製方法が開示されている。
US 5,714,354には、肺炎球菌多糖類の精製のための、カチオン性界面活性剤を用いる無アルコール法が開示されている。

US 5,847,112には、血清型６Ｂの肺炎球菌のサイズ低下した低い多分散度の莢膜多糖類を製造するための方法が開示され、それは、莢膜多糖類に下記のものからなる群から選択されるサイズ低下処理を施すことにより血清型６Ｂの粗製莢膜多糖類のサイズを低下させることを含む：熱処理、音波処理、化学的加水分解、エンド分解型(endolytic)酵素処理、および物理的剪断。

WO 2006/082527 A2には、ストレプトコッカス・アガラクティエ(S. agalactiae)の莢膜多糖類の精製法が開示され、その際、まず糖類をアルコールとカルシウム塩の水性混合物で処理し、続いてカチオン性界面活性剤により沈殿させる。

WO 2008/045852 A2には、肺炎球菌多糖類血清型３を精製するための方法が記載され、その際、加熱および低ｐＨでの沈殿法が採用された。
WO 2012/127485 A1には、肺炎球菌多糖類を精製するための、アルコールおよびＣＴＡＢを含まない方法が開示され、それは正味表面電荷の差に基づく、多糖類（ＰｎＰｓ）からのＣ−Ｐｓのクロマトグラフィー分離を採用している。

しかし、前記の先行技術参考文献には、不純物を除去するためのクロマトグラフィー、低ｐＨ沈殿、アルコール沈殿、無アルコール法などが開示され、それらは冗長であり、多数の処理工程を必要とする。あるものはわずかな不純物低減を示したが、精製多糖類明細に適合するためのその後の可溶性タンパク質の除去が困難であり、したがって特にある血清型について混在する可溶性タンパク質の除去という高い負荷がある。フェノールは有毒であり、クロマトグラフィー法はさらに技術投入および高価な樹脂を必要とし、そのためその方法は商業的に不経済である。よって、複雑な細胞溶解物からタンパク質不純物を除去するための改良法に対するニーズがある。

本発明者らは、容易にスケールアップできる簡単で効率的な方法を開発する継続的努力に際して、多糖類および他の不純物を含有する溶液をＳｉＯ_２に曝露すると、得られる溶液はタンパク質および他の不純物が低減して多糖類が著しく富化されることを見出した。

IPCOM000237738D (2014) 1572/MUM/2010 US 4,242,501 US 5,714,354 US 5,847,112 WO 2006/082527 A2 WO 2008/045852 A2 WO 2012/127485 A1

本発明の目的は、タンパク質および他の不純物の含量が低く、容易にスケールアップできる、多糖類を精製するための改良法を提供することである。
本発明の他の目的は、簡単かつ効率的に多糖類を精製するための改良法を提供することである。

したがって、本発明は、多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む溶液をＳｉＯ_２（二酸化ケイ素）に曝露または接触させ、タンパク質、核酸、細胞壁多糖類および他の細胞由来物質の混合物から多糖類を単離することを含む、実質的に純粋な形態の多糖類を単離するための方法を提供する。

図１：種々の肺炎球菌血清型からのＳｉＯ_２処理の前と後のタンパク質不純物レベルの比較。 図２：肺炎球菌多糖類血清型１８ＣについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果；ＳｉＯ_２処理の前と後のタンパク質低減。 図３：肺炎球菌多糖類血清型２３ＦについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果；ＳｉＯ_２処理の前と後のタンパク質低減。

本発明は、多糖類を含む溶液をＳｉＯ_２および場合により他の作用剤に曝露することを含む、多糖類を単離するための方法を提供し、その際、多糖類の供給源は細菌、酵母、糸状菌、藻類または植物細胞などからのものである。ＳｉＯ_２に曝露し、分離した後に得られる溶液は、多糖類に富み、１以上の不純物、たとえばタンパク質、核酸、細胞壁多糖類、および他の細胞由来物質が減少している。

本発明に従って得られる多糖類は実質的に純粋な形態である。
好ましい態様において、本発明は、１以上の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ多糖類を含む複雑な肺炎球菌細胞溶解物または濃縮物からタンパク質不純物を低減または除去するための方法に関する。

ある態様において、使用するＳｉＯ_２は種々の形態／粒子サイズのもの、たとえば０．０１μｍから２００μｍまでの範囲、好ましくは３〜４０μｍの範囲の微細な粒子であってもよい。使用するＳｉＯ_２の量は０．５から２０％（ｗ／ｖ）までの範囲であってもよい。使用するＳｉＯ_２は、場合により６０℃より高温に少なくとも１時間加熱し、使用前に冷却することにより調製できる。使用するＳｉＯ_２は、パイロジェンを含むもの(pyrogenated)または脱パイロジェンしたもの(depyrogenated)であってもよい。

さらに他の態様において、多糖類の精製法に用いる他の作用剤は、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムなど、または少なくとも２％（ｖ／ｖ）の濃度の有機溶媒、たとえばアルコールから選択できる。不純物をさらに低減し、溶液に多糖類を富化するために、他の作用剤を使用できる。

他の態様において、溶液のｐＨを酸性領域からアルカリ性領域まで、好ましくは３．０から９．０までの範囲に維持することができる。ｐＨは、酸、たとえば酢酸、リン酸、ギ酸、塩酸など、およびアルカリ、たとえば水酸化ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムなどを用いて調整できる。

他の態様において、多糖類および他の不純物を含む溶液の、ＳｉＯ_２への接触または曝露は、１５℃から６０℃までの範囲の温度で１０分〜１６時間の期間行なわれる。
他の態様において、本発明は、色および他の不純物を除去するために多糖類溶液を活性炭で処理することを伴う。この処理は、ＳｉＯ_２に曝露する前、またはＳｉＯ_２に曝露した後に実施される。

本発明において述べる方法を用いて精製した多糖類は、化粧品、食品、医薬および生物医薬産業など、種々の用途に使用できる。
本明細書中で用いる用語“実質的に純粋な形態”は、ＳｉＯ_２曝露前の溶解物または濃縮物中のタンパク質の濃度と比較して少なくとも３０％のタンパク質が除去された溶解物または濃縮物の多糖類を表わす。細胞溶解物または濃縮物中のタンパク質濃度を定量するための方法は当技術分野で周知であり、たとえばブラッドフォードアッセイ(Bradford assay)、ＢＣＡアッセイ、ローリーアッセイ(Lowry assay)などの生化学的方法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析、クロマトグラフィー、および電気泳動などの分析法が含まれる(参照：たとえば、Deutscher, M. P. (ed.), Guide to Protein Purification, San Diego: Academic Press, Inc. (1990))。

本発明はまた、細菌から莢膜多糖類を精製するための方法を提供し、その際、（ａ）本方法の収率は少なくとも１０％であり、（ｂ）糖類の相対純度は少なくとも３０％である。

他の態様において、本発明は、純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法を提供する：
ｉ）多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む溶液をＳｉＯ_２に曝露する、
ｉｉ）純粋な形態の多糖類溶液を単離する、そして
ｉｉｉ）シリカ粒子を濾過または遠心分離により多糖類から分離する。

本発明の方法で得られる多糖類濃度は、０．１から１０ｍｇ／ｍｌより高い可能性がある。
他の態様において、本発明は、純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法を提供する：
ｉ）多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製する、
ｉｉ）多糖類溶液を界面活性剤で処理して核酸および他の不純物を除去する、
ｉｉ）水または緩衝液中におけるＳｉＯ_２の懸濁液を調製する、
ｉｉｉ）ＳｉＯ_２の懸濁液を工程（ｉ）の多糖類溶液に添加する、そして
ｉｖ）純粋な形態の多糖類溶液を単離する。

多糖類の分離のために本発明において用いる緩衝液には、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス緩衝液などが含まれる。
タンパク質は親水性表面および疎水性ポケットをもつ。多糖類調製物を二酸化ケイ素と共にインキュベートすると、タンパク質不純物は二酸化ケイ素と結合し、多糖類から分離される；親水性もしくは疎水性または単純な吸着のメカニズム。

本発明に用いる界面活性剤には、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、セトリモニウムクロリド(Cetrimonium chloride)、塩化ベンゼトニウムなどが含まれる。

曝露または接触という用語は、不純物の除去のために試料を処理して純粋な多糖類にするために多糖類調製物を他の成分と共にインキュベートすることを意味する。
好ましい態様において、本発明は、純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法を提供する：
ｉ）肺炎球菌の莢膜多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製し、その際、溶液のｐＨを３．０から９．０までの範囲に維持する、
ｉｉ）場合により他の試薬を添加する、
ｉｉｉ）場合により溶液を活性炭で処理する、
ｉｖ）水または緩衝液中における、０．０１μｍから２００μｍまでの範囲の粒子を有するＳｉＯ_２の懸濁液を調製する、
ｖ）ＳｉＯ_２の懸濁液を工程（ｉ）の多糖類溶液に、１５℃〜６０℃の範囲の温度で１０分〜２０時間の期間、添加する、
ｖｉ）場合により溶液を活性炭で処理する、
ｖｉｉ）場合により他の試薬を添加する、そして
ｖｉｉ）純粋な形態の多糖類溶液を単離する。

他の試薬は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、アルコールなど、またはその混合物から選択できる。
本発明の精製された莢膜多糖類は、さらに修飾して、または修飾せずに、免疫化に使用するための免疫原として使用できる。免疫化の目的のためには、糖類をキャリヤー分子、たとえばタンパク質にコンジュゲートさせることが好ましい。

好ましいキャリヤータンパク質は、細菌性のトキシンまたはトキソイド、たとえばジフテリアトキソイドもしくは破傷風トキソイド、またはジフテリアトキシンのＣＲＭ１９７変異体などである。

さらに他の態様において、本発明は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７から選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、本発明により調製した莢膜多糖類を含む免疫原性組成物を提供する。

さらに他の好ましい態様において、本発明は、ＣＲＭ１９７キャリヤータンパク質にコンジュゲートした、１以上の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからの莢膜多糖類を含む免疫原性組成物を提供する。

本発明に使用できる市販ＳｉＯ_２（二酸化ケイ素）の幾つかの一般的な商品名は、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）、Ａｅｒｏｐｅｒｌ（登録商標）である。
多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液は、当技術分野で知られているいずれかの方法により調製できる。

ＳｉＯ_２に曝露または接触させた後の純粋な形態の莢膜多糖類の単離は、常法により実施される。

以下に示す実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明が決して実施例によって限定されないことを理解すべきである。
実施例１
肺炎球菌発酵ブロスの細胞溶解をデオキシコレート（０．００５％〜２％）の添加により実施した。デオキシコレートインキュベーションの後、ブロスを１００００〜１５０００ｇで遠心分離し、上清を採集した。上清のｐＨをオルトリン酸、塩酸などの酸でｐＨ４〜６に調整し、３時間ないし一夜、インキュベートした。数種類の血清型のｐＨを中性に再調整し、最高６０℃に１０〜１５０分間加熱した。多糖類を１００００〜１５０００ｇで遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清をデプスフィルター(depth filter)または０．２２もしくは０．４５μｍフィルターに通すことによってさらに澄明化した。濾液を限外濾過膜３０〜３００ｋＤａ上で４〜１５倍に濃縮した。濃縮物を最大４〜１２透析濾過体積(dia volume)のリン酸緩衝液に緩衝液交換した。濃縮および緩衝液交換した多糖類に、ＣＴＡＢ（すなわち、０．２％〜５％）を添加し、２時間ないし一夜、４℃〜４０℃でインキュベートした。数種類の多糖類に、ＣＴＡＢを添加する前に塩化ナトリウムを０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲で添加した。

ＣＴＡＢ処理の後、１００００〜１５０００ｇでの遠心分離によりペレットを分離した。上清をチャコールカラム／フィルターに通した。チャコール濾過した多糖類に、活性二酸化ケイ素を３〜１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で添加し、０．５Ｍから３ＭまでのＮａＣｌを添加した。多糖類調製物を二酸化ケイ素に５℃〜４０℃の温度で２時間〜２６時間曝露した。二酸化ケイ素を遠心分離／濾布濾過／バッグ濾過により多糖類溶液から分離した。濾液をデプスフィルター(depth filter)、カーボンフィルターおよび０．２２〜５μｍフィルターに通した。濾過した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ膜で透析濾過した。多糖類をリン酸緩衝液またはＷＦＩに緩衝液交換した。精製された多糖類調製物を０．２２μｍフィルターに通し、ＬＡＦＵ下でＬＤＰＥバッグに採集した。精製された多糖類を＞−２０℃で保存した。

ＢＤＬ：検出限界未満
この態様は、多糖類調製物からの脱パイロジェン(depyrogenation)が不純物除去に及ぼす影響を記載する。表２に示すように、タンパク質不純物は脱パイロジェンおよびパイロジェン含有の両方のＳｉＯ_２によって除去された。したがって、脱パイロジェンＳｉＯ_２もパイロジェン含有ＳｉＯ_２と同様に不純物の除去に使用できる。

ＢＤＬ：検出限界未満
条件：Ａｅｒｏｐｅｒｌ（登録商標）５％（ｗ／ｖ）；ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした
Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）は０．１％から１０％までの範囲またはそれより高い濃度で使用できる。タンパク質はＳｉＯ_２処理によって１時間ないし１７時間以上で完全に除去された。不純物除去はＳｉＯ_２懸濁液にＮａＣｌを添加することによって改良できる。

ＢＤＬ：検出限界未満
条件：ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした
この態様も、脱パイロジェンａｅｒｏｅｐｒｌ（登録商標）が０．１Ｍ〜２．５Ｍの範囲またはそれ以上のＮａＣｌの存在下でタンパク質を効率的に除去できるということを支持する。ＳｉＯ_２粒子は０．１μｍから１００ミクロンまでのサイズ範囲で使用できる。

ＢＤＬ：検出限界未満
条件：ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした
発酵ブロスは多数の混在物を含有する。これらの混在物は、遠心分離、沈殿、クロマトグラフィーなど一連の工程で除去できる。本発明を小規模（５０〜１００ｍｌ）およびパイロット（１５Ｌ）レベルで実施した。両方の体積の多糖類において、種々の形態のＳｉＯ_２により混在物が効率的に除去された（表５および図１）。ＳｉＯ_２処理は多糖類精製の種々の段階で導入できる。さらに、ＳｉＯ_２粒子は簡単な遠心分離もしくは濾過により、または他のいずれかの方法、たとえば物理的沈降、加圧沈降などにより分離できる。

ＢＤＬ：検出限界未満
条件：Ａｅｒｏｐｅｒｌ（登録商標）５％（ｗ／ｖ）；ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした

Ｐｒｅ：ａｅｒｏｐｅｒｌ処理前；Ｐｏｓｔ：ａｅｒｏｐｅｒｌ処理後
条件：Ａｅｒｏｐｅｒｌ（登録商標）５％（ｗ／ｖ）；ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした

ＢＤＬ：検出限界未満
Ｐｒｅ：ａｅｒｏｐｅｒｌ処理前；Ｐｏｓｔ：ａｅｒｏｐｅｒｌ処理後
ＮＤ：検出しなかった
条件：Ａｅｒｏｐｅｒｌ（登録商標）５％（ｗ／ｖ）；ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした
それぞれの血清型の精製された多糖類について、ワクチンからの有害事象のリスクを低減するように混在物の限界を設定した。ＣＷＰＳは混在物の１つである。本発明はＣＷＰＳを配慮した。ＣＷＰＳは、室温における簡単な混合、続いてＳｉＯ_２分離により、多糖類試料から除去された。多糖類試料とＳｉＯ_２の接触時間は１０分ないし１８時間より長い範囲であってよい（表７）。

条件：Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）５％（ｗ／ｖ）；ＮａＣｌ １Ｍ；室温で１時間インキュベートした
タンパク質不純物の除去をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化することができる。肺炎球菌の多糖類血清型１８Ｃおよび２３Ｆタンパク質不純物が指定限界(limit of specification)まで低減した。図２および３に示すように、タンパク質が明らかに除去されたことがレーン２および３にみられる。結果を表８に示す。

Claims (17)

1. 多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む溶液をＳｉＯ_２に曝露または接触させ、そして純粋な形態の多糖類を単離することを含む、実質的に純粋な形態の多糖類を単離するための改良法。
2. 多糖類の供給源が細菌、酵母、糸状菌、藻類または植物細胞からのものである、請求項１に記載の多糖類を単離するための方法。
3. 多糖類の供給源が、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、ｂ型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、およびチフス菌(Salmonella typhi)から選択される細菌からのものである、請求項２に記載の多糖類を単離するための方法。
4. ＳｉＯ_２の粒子サイズが０．０１μｍから２００μｍまでの範囲、好ましくは３μｍ〜４０μｍの範囲である、請求項１に記載の多糖類を単離するための方法。
5. ＳｉＯ_２の量が０．５から２０％（ｗ／ｖ）までの範囲である、請求項１に記載の多糖類を単離するための方法。
6. 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の溶解物または濃縮物が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択される１以上の血清型を含む、請求項３に記載の肺炎球菌から多糖類を単離するための方法。
7. 多糖類および他の不純物を含む溶液の、ＳｉＯ_２への曝露または接触が、１５℃から６０℃までの範囲の温度で１０分〜１６時間の期間行なわれる、請求項１に記載の多糖類を単離するための方法。
8. ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７から選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、請求項１の記載に従って調製した莢膜多糖類をを含む、免疫原組成物。
9. 純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む改良法：
   ｉ）多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製する、
   ｉｉ）水または緩衝液中におけるＳｉＯ_２の懸濁液を調製する、
   ｉｉｉ）ＳｉＯ_２の懸濁液を工程（ｉ）の多糖類溶液に添加する、そして
   ｉｖ）純粋な形態の多糖類溶液を単離する。
10. ＳｉＯ_２のサイズが０．０１μｍから２００μｍまでの範囲、好ましくは３μｍ〜４０μｍの範囲である、請求項９に記載の多糖類を単離するための方法。
11. ＳｉＯ_２の量が０．５から２０％（ｗ／ｖ）までの範囲である、請求項９に記載の多糖類を単離するための方法。
12. 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の溶解物または濃縮物が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択される１以上の血清型を含む、請求項９に記載の肺炎球菌から多糖類を単離するための方法。
13. 多糖類および他の不純物を含む溶液の、ＳｉＯ_２への接触または曝露が、１５℃から６０℃までの範囲の温度で１０分〜１６時間の期間行なわれる、請求項９に記載の多糖類を単離するための方法。
14. 純粋な形態の肺炎球菌莢膜多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法：
    ｉ）肺炎球菌莢膜の多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製し、その際、溶液のｐＨを３．０から９．０までの範囲に維持する、
    ｉｉ）場合により他の試薬を添加する、
    ｉｉｉ）場合により溶液を活性炭で処理する、
    ｉｖ）水または緩衝液中における、０．０１μｍから２００μｍまでの範囲の粒子を有するＳｉＯ_２の懸濁液を調製する、
    ｖ）ＳｉＯ_２の懸濁液を工程（ｉ）の多糖類溶液に、１５℃〜６０℃の範囲の温度で１０分〜２０時間の期間、添加する、
    ｖｉ）場合により溶液を活性炭で処理する、
    ｖｉｉ）場合により他の試薬を添加する、そして
    ｖｉｉ）純粋な形態の多糖類溶液を単離する。
15. 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の溶解物または濃縮物が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択される１以上の血清型を含む、請求項１４に記載の肺炎球菌から多糖類を単離するための方法。
16. 多糖類および他の不純物を含む溶液の、ＳｉＯ_２への接触または曝露が、１５℃から６０℃までの範囲の温度で１０分〜１６時間の期間行なわれる、請求項１４に記載の多糖類を単離するための方法。
17. ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７から選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、請求項１４の記載に従って調製した莢膜多糖類を含む、免疫原組成物。
    

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