JP2018514624A - 微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を分離するための方法 - Google Patents

微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を分離するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を除去するための方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質および他の不純物を除去した後に純粋な形態の微生物莢膜多糖類を単離することに関する。【選択図】図1

Description

本発明は、微生物莢膜多糖類からタンパク質および他の不純物を除去するための方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質および他の不純物を除去した後に純粋な形態の微生物莢膜多糖類を単離することに関する。
ワクチンは特定の疾患を模倣し、そうすることによってそれは身体に防御機構を誘発させ、あるいは免疫応答を発現させて、病原体と戦う身体をもたらす。ワクチン製造法は、それがヒトに使用するのに安全であると判定するためにあらゆる段階で特に厳密である。多糖類は多数の産業用途、たとえば多くの市販製品の増粘剤、ゲル化剤、および送達システムに用いられる炭水化物である。微生物細胞に存在する莢膜多糖類は免疫化の成分としても使用できる。配合組成物中の精製された莢膜多糖類により免疫化すると、それは髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、およびチフス菌(Salmonella typhi)などの生物が引き起こす疾患を、それぞれの免疫応答の誘発により予防する。
コンジュゲートワクチンは、小児および免疫無防備状態の個体におけるもの、ならびに高齢者集団におけるものをも含めて、改良された免疫原応答を誘発する。CRM197、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、他の表面タンパク質などのタンパク質とコンジュゲートした多糖類コンジュゲートは、十分に証明された高い免疫原性のものである。Pneumovax 23は種々の肺炎球菌血清型からの非コンジュゲート−多糖類の組合わせであり、それに対しPrevnar 13は13種類の肺炎球菌血清型の13価コンジュゲート多糖類である。タンパク質−多糖類コンジュゲートは、髄膜炎、菌血症、肺炎、喉頭蓋炎(epiglottitis)などの処置のための予防剤として効果的に用いられている。
ヒト用として承認されたそのような免疫原製剤またはワクチン製剤はすべて、高度に精製された形態の多糖類を必要とする。莢膜多糖類は細菌細胞の外面に存在する。多糖類を細胞から分離する際に、核酸、タンパク質、細胞壁などの細胞成分が放出される。多糖類の単離/精製のためのプロセスは、クロマトグラフィー、濾過から、界面活性剤、溶媒、酵素(核酸、タンパク質、多糖類などを加水分解するためのもの)による処理にまでわたる、多数の工程を伴う。
生物である肺炎球菌により引き起こされる侵襲性疾患の予防を目的とする多価コンジュゲート肺炎球菌ワクチンを調製する際には、選択した肺炎球菌血清型を最適化栄養素中で増殖させて、ワクチンを製造するのに必要な要求される多糖類を得る。細胞を大型発酵槽内で増殖させ、発酵終了時にデオキシコール酸ナトリウム(DOC)または別の細胞溶解剤の添加により細胞溶解を誘発する。細菌細胞を囲む莢膜多糖類を下流で精製および回収するために、溶解物ブロスを次いで収穫する。このプロセスで調製された細胞溶解物は目標とする多糖類を含有するが、それはタンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む大量の細胞屑をも含有する。
以下の参考文献はタンパク質および他の不純物を莢膜多糖類から除去するための多様な方法を開示する:
IPCOM000237738D (2014)には、肺炎球菌多糖類抗原の精製が開示され、その際、従来の有害なフェノール抽出工程に代わるCaptoTM adhere、すなわちマルチモーダルアニオン交換体を用いるクロマトグラフィー工程が開発された。
1572/MUM/2010には、汚染タンパク質を抗原性多糖類から除去するための下記を含む精製プロセスが開示されている:a)細胞溶解ブロスから粗製細菌性多糖類を得る;b)その粗製多糖類に濃縮および透析濾過を施す;c)多糖類を含有する溶液をヌクレアーゼで処理する;d)ヌクレアーゼ処理した多糖類溶液を界面活性剤と生理食塩水の混合物で処理する;e)pHを6.1〜6.3に調整し、混合物を2〜8℃で10〜14時間インキュベートする;f)多糖類溶液に、遠心分離、続いて透析濾過を施す;g)溶液をクロマトグラフィーにより処理すると、そのプロセスによりタンパク質が減少する。
US 4,242,501には、1回以上のアルコール沈殿を伴う、精製された莢膜多糖類の調製方法が開示されている。
US 5,714,354には、肺炎球菌多糖類の精製のための、カチオン性界面活性剤を用いる無アルコール法が開示されている。
US 5,847,112には、血清型6Bの肺炎球菌のサイズ低下した低い多分散度の莢膜多糖類を製造するための方法が開示され、それは、莢膜多糖類に下記のものからなる群から選択されるサイズ低下処理を施すことにより血清型6Bの粗製莢膜多糖類のサイズを低下させることを含む:熱処理、音波処理、化学的加水分解、エンド分解型(endolytic)酵素処理、および物理的剪断。
WO 2006/082527 A2には、ストレプトコッカス・アガラクティエ(S. agalactiae)の莢膜多糖類の精製法が開示され、その際、まず糖類をアルコールとカルシウム塩の水性混合物で処理し、続いてカチオン性界面活性剤により沈殿させる。
WO 2008/045852 A2には、肺炎球菌多糖類血清型3を精製するための方法が記載され、その際、加熱および低pHでの沈殿法が採用された。
WO 2012/127485 A1には、肺炎球菌多糖類を精製するための、アルコールおよびCTABを含まない方法が開示され、それは正味表面電荷の差に基づく、多糖類(PnPs)からのC−Psのクロマトグラフィー分離を採用している。
しかし、前記の先行技術参考文献には、不純物を除去するためのクロマトグラフィー、低pH沈殿、アルコール沈殿、無アルコール法などが開示され、それらは冗長であり、多数の処理工程を必要とする。あるものはわずかな不純物低減を示したが、精製多糖類明細に適合するためのその後の可溶性タンパク質の除去が困難であり、したがって特にある血清型について混在する可溶性タンパク質の除去という高い負荷がある。フェノールは有毒であり、クロマトグラフィー法はさらに技術投入および高価な樹脂を必要とし、そのためその方法は商業的に不経済である。よって、複雑な細胞溶解物からタンパク質不純物を除去するための改良法に対するニーズがある。
本発明者らは、容易にスケールアップできる簡単で効率的な方法を開発する継続的努力に際して、多糖類および他の不純物を含有する溶液をSiOに曝露すると、得られる溶液はタンパク質および他の不純物が低減して多糖類が著しく富化されることを見出した。
IPCOM000237738D (2014) 1572/MUM/2010 US 4,242,501 US 5,714,354 US 5,847,112 WO 2006/082527 A2 WO 2008/045852 A2 WO 2012/127485 A1
本発明の目的は、タンパク質および他の不純物の含量が低く、容易にスケールアップできる、多糖類を精製するための改良法を提供することである。
本発明の他の目的は、簡単かつ効率的に多糖類を精製するための改良法を提供することである。
したがって、本発明は、多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む溶液をSiO(二酸化ケイ素)に曝露または接触させ、タンパク質、核酸、細胞壁多糖類および他の細胞由来物質の混合物から多糖類を単離することを含む、実質的に純粋な形態の多糖類を単離するための方法を提供する。
図1:種々の肺炎球菌血清型からのSiO処理の前と後のタンパク質不純物レベルの比較。 図2:肺炎球菌多糖類血清型18CについてのSDS−PAGE結果;SiO処理の前と後のタンパク質低減。 図3:肺炎球菌多糖類血清型23FについてのSDS−PAGE結果;SiO処理の前と後のタンパク質低減。
本発明は、多糖類を含む溶液をSiOおよび場合により他の作用剤に曝露することを含む、多糖類を単離するための方法を提供し、その際、多糖類の供給源は細菌、酵母、糸状菌、藻類または植物細胞などからのものである。SiOに曝露し、分離した後に得られる溶液は、多糖類に富み、1以上の不純物、たとえばタンパク質、核酸、細胞壁多糖類、および他の細胞由来物質が減少している。
本発明に従って得られる多糖類は実質的に純粋な形態である。
好ましい態様において、本発明は、1以上の血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、および33F多糖類を含む複雑な肺炎球菌細胞溶解物または濃縮物からタンパク質不純物を低減または除去するための方法に関する。
ある態様において、使用するSiOは種々の形態/粒子サイズのもの、たとえば0.01μmから200μmまでの範囲、好ましくは3〜40μmの範囲の微細な粒子であってもよい。使用するSiOの量は0.5から20%(w/v)までの範囲であってもよい。使用するSiOは、場合により60℃より高温に少なくとも1時間加熱し、使用前に冷却することにより調製できる。使用するSiOは、パイロジェンを含むもの(pyrogenated)または脱パイロジェンしたもの(depyrogenated)であってもよい。
さらに他の態様において、多糖類の精製法に用いる他の作用剤は、少なくとも0.1%(w/v)の濃度の塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムなど、または少なくとも2%(v/v)の濃度の有機溶媒、たとえばアルコールから選択できる。不純物をさらに低減し、溶液に多糖類を富化するために、他の作用剤を使用できる。
他の態様において、溶液のpHを酸性領域からアルカリ性領域まで、好ましくは3.0から9.0までの範囲に維持することができる。pHは、酸、たとえば酢酸、リン酸、ギ酸、塩酸など、およびアルカリ、たとえば水酸化ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムなどを用いて調整できる。
他の態様において、多糖類および他の不純物を含む溶液の、SiOへの接触または曝露は、15℃から60℃までの範囲の温度で10分〜16時間の期間行なわれる。
他の態様において、本発明は、色および他の不純物を除去するために多糖類溶液を活性炭で処理することを伴う。この処理は、SiOに曝露する前、またはSiOに曝露した後に実施される。
本発明において述べる方法を用いて精製した多糖類は、化粧品、食品、医薬および生物医薬産業など、種々の用途に使用できる。
本明細書中で用いる用語“実質的に純粋な形態”は、SiO曝露前の溶解物または濃縮物中のタンパク質の濃度と比較して少なくとも30%のタンパク質が除去された溶解物または濃縮物の多糖類を表わす。細胞溶解物または濃縮物中のタンパク質濃度を定量するための方法は当技術分野で周知であり、たとえばブラッドフォードアッセイ(Bradford assay)、BCAアッセイ、ローリーアッセイ(Lowry assay)などの生化学的方法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)分析、クロマトグラフィー、および電気泳動などの分析法が含まれる(参照:たとえば、Deutscher, M. P. (ed.), Guide to Protein Purification, San Diego: Academic Press, Inc. (1990))。
本発明はまた、細菌から莢膜多糖類を精製するための方法を提供し、その際、(a)本方法の収率は少なくとも10%であり、(b)糖類の相対純度は少なくとも30%である。
他の態様において、本発明は、純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法を提供する:
i)多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む溶液をSiOに曝露する、
ii)純粋な形態の多糖類溶液を単離する、そして
iii)シリカ粒子を濾過または遠心分離により多糖類から分離する。
本発明の方法で得られる多糖類濃度は、0.1から10mg/mlより高い可能性がある。
他の態様において、本発明は、純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法を提供する:
i)多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製する、
ii)多糖類溶液を界面活性剤で処理して核酸および他の不純物を除去する、
ii)水または緩衝液中におけるSiOの懸濁液を調製する、
iii)SiOの懸濁液を工程(i)の多糖類溶液に添加する、そして
iv)純粋な形態の多糖類溶液を単離する。
多糖類の分離のために本発明において用いる緩衝液には、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス緩衝液などが含まれる。
タンパク質は親水性表面および疎水性ポケットをもつ。多糖類調製物を二酸化ケイ素と共にインキュベートすると、タンパク質不純物は二酸化ケイ素と結合し、多糖類から分離される;親水性もしくは疎水性または単純な吸着のメカニズム。
本発明に用いる界面活性剤には、CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド)、セトリモニウムクロリド(Cetrimonium chloride)、塩化ベンゼトニウムなどが含まれる。
曝露または接触という用語は、不純物の除去のために試料を処理して純粋な多糖類にするために多糖類調製物を他の成分と共にインキュベートすることを意味する。
好ましい態様において、本発明は、純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法を提供する:
i)肺炎球菌の莢膜多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製し、その際、溶液のpHを3.0から9.0までの範囲に維持する、
ii)場合により他の試薬を添加する、
iii)場合により溶液を活性炭で処理する、
iv)水または緩衝液中における、0.01μmから200μmまでの範囲の粒子を有するSiOの懸濁液を調製する、
v)SiOの懸濁液を工程(i)の多糖類溶液に、15℃〜60℃の範囲の温度で10分〜20時間の期間、添加する、
vi)場合により溶液を活性炭で処理する、
vii)場合により他の試薬を添加する、そして
vii)純粋な形態の多糖類溶液を単離する。
他の試薬は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、アルコールなど、またはその混合物から選択できる。
本発明の精製された莢膜多糖類は、さらに修飾して、または修飾せずに、免疫化に使用するための免疫原として使用できる。免疫化の目的のためには、糖類をキャリヤー分子、たとえばタンパク質にコンジュゲートさせることが好ましい。
好ましいキャリヤータンパク質は、細菌性のトキシンまたはトキソイド、たとえばジフテリアトキソイドもしくは破傷風トキソイド、またはジフテリアトキシンのCRM197変異体などである。
さらに他の態様において、本発明は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドまたはCRM197から選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、本発明により調製した莢膜多糖類を含む免疫原性組成物を提供する。
さらに他の好ましい態様において、本発明は、CRM197キャリヤータンパク質にコンジュゲートした、1以上の血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、および33Fからの莢膜多糖類を含む免疫原性組成物を提供する。
本発明に使用できる市販SiO(二酸化ケイ素)の幾つかの一般的な商品名は、Aerosil(登録商標)、Aeroperl(登録商標)である。
多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液は、当技術分野で知られているいずれかの方法により調製できる。
SiOに曝露または接触させた後の純粋な形態の莢膜多糖類の単離は、常法により実施される。
以下に示す実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明が決して実施例によって限定されないことを理解すべきである。
実施例1
肺炎球菌発酵ブロスの細胞溶解をデオキシコレート(0.005%〜2%)の添加により実施した。デオキシコレートインキュベーションの後、ブロスを10000〜15000gで遠心分離し、上清を採集した。上清のpHをオルトリン酸、塩酸などの酸でpH4〜6に調整し、3時間ないし一夜、インキュベートした。数種類の血清型のpHを中性に再調整し、最高60℃に10〜150分間加熱した。多糖類を10000〜15000gで遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清をデプスフィルター(depth filter)または0.22もしくは0.45μmフィルターに通すことによってさらに澄明化した。濾液を限外濾過膜30〜300kDa上で4〜15倍に濃縮した。濃縮物を最大4〜12透析濾過体積(dia volume)のリン酸緩衝液に緩衝液交換した。濃縮および緩衝液交換した多糖類に、CTAB(すなわち、0.2%〜5%)を添加し、2時間ないし一夜、4℃〜40℃でインキュベートした。数種類の多糖類に、CTABを添加する前に塩化ナトリウムを0.05M〜2Mの範囲で添加した。
CTAB処理の後、10000〜15000gでの遠心分離によりペレットを分離した。上清をチャコールカラム/フィルターに通した。チャコール濾過した多糖類に、活性二酸化ケイ素を3〜10%(W/V)の範囲で添加し、0.5Mから3MまでのNaClを添加した。多糖類調製物を二酸化ケイ素に5℃〜40℃の温度で2時間〜26時間曝露した。二酸化ケイ素を遠心分離/濾布濾過/バッグ濾過により多糖類溶液から分離した。濾液をデプスフィルター(depth filter)、カーボンフィルターおよび0.22〜5μmフィルターに通した。濾過した多糖類を濃縮し、10kDa〜500kDa膜で透析濾過した。多糖類をリン酸緩衝液またはWFIに緩衝液交換した。精製された多糖類調製物を0.22μmフィルターに通し、LAFU下でLDPEバッグに採集した。精製された多糖類を>−20℃で保存した。
Figure 2018514624
BDL:検出限界未満
この態様は、多糖類調製物からの脱パイロジェン(depyrogenation)が不純物除去に及ぼす影響を記載する。表2に示すように、タンパク質不純物は脱パイロジェンおよびパイロジェン含有の両方のSiOによって除去された。したがって、脱パイロジェンSiOもパイロジェン含有SiOと同様に不純物の除去に使用できる。
Figure 2018514624
BDL:検出限界未満
条件:Aeroperl(登録商標)5%(w/v);NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
Aerosil(登録商標)は0.1%から10%までの範囲またはそれより高い濃度で使用できる。タンパク質はSiO処理によって1時間ないし17時間以上で完全に除去された。不純物除去はSiO懸濁液にNaClを添加することによって改良できる。
Figure 2018514624
BDL:検出限界未満
条件:NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
この態様も、脱パイロジェンaeroeprl(登録商標)が0.1M〜2.5Mの範囲またはそれ以上のNaClの存在下でタンパク質を効率的に除去できるということを支持する。SiO粒子は0.1μmから100ミクロンまでのサイズ範囲で使用できる。
Figure 2018514624
BDL:検出限界未満
条件:NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
発酵ブロスは多数の混在物を含有する。これらの混在物は、遠心分離、沈殿、クロマトグラフィーなど一連の工程で除去できる。本発明を小規模(50〜100ml)およびパイロット(15L)レベルで実施した。両方の体積の多糖類において、種々の形態のSiOにより混在物が効率的に除去された(表5および図1)。SiO処理は多糖類精製の種々の段階で導入できる。さらに、SiO粒子は簡単な遠心分離もしくは濾過により、または他のいずれかの方法、たとえば物理的沈降、加圧沈降などにより分離できる。
Figure 2018514624
BDL:検出限界未満
条件:Aeroperl(登録商標)5%(w/v);NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
Figure 2018514624
Pre:aeroperl処理前;Post:aeroperl処理後
条件:Aeroperl(登録商標)5%(w/v);NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
Figure 2018514624
BDL:検出限界未満
Pre:aeroperl処理前;Post:aeroperl処理後
ND:検出しなかった
条件:Aeroperl(登録商標)5%(w/v);NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
それぞれの血清型の精製された多糖類について、ワクチンからの有害事象のリスクを低減するように混在物の限界を設定した。CWPSは混在物の1つである。本発明はCWPSを配慮した。CWPSは、室温における簡単な混合、続いてSiO分離により、多糖類試料から除去された。多糖類試料とSiOの接触時間は10分ないし18時間より長い範囲であってよい(表7)。
Figure 2018514624
条件:Aerosil(登録商標)5%(w/v);NaCl 1M;室温で1時間インキュベートした
タンパク質不純物の除去をSDS−PAGEにより視覚化することができる。肺炎球菌の多糖類血清型18Cおよび23Fタンパク質不純物が指定限界(limit of specification)まで低減した。図2および3に示すように、タンパク質が明らかに除去されたことがレーン2および3にみられる。結果を表8に示す。
Figure 2018514624

Claims (17)

  1. 多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む溶液をSiOに曝露または接触させ、そして純粋な形態の多糖類を単離することを含む、実質的に純粋な形態の多糖類を単離するための改良法。
  2. 多糖類の供給源が細菌、酵母、糸状菌、藻類または植物細胞からのものである、請求項1に記載の多糖類を単離するための方法。
  3. 多糖類の供給源が、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、およびチフス菌(Salmonella typhi)から選択される細菌からのものである、請求項2に記載の多糖類を単離するための方法。
  4. SiOの粒子サイズが0.01μmから200μmまでの範囲、好ましくは3μm〜40μmの範囲である、請求項1に記載の多糖類を単離するための方法。
  5. SiOの量が0.5から20%(w/v)までの範囲である、請求項1に記載の多糖類を単離するための方法。
  6. 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の溶解物または濃縮物が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、および33Fから選択される1以上の血清型を含む、請求項3に記載の肺炎球菌から多糖類を単離するための方法。
  7. 多糖類および他の不純物を含む溶液の、SiOへの曝露または接触が、15℃から60℃までの範囲の温度で10分〜16時間の期間行なわれる、請求項1に記載の多糖類を単離するための方法。
  8. ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドまたはCRM197から選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、請求項1の記載に従って調製した莢膜多糖類をを含む、免疫原組成物。
  9. 純粋な形態の多糖類を単離するための、下記の工程を含む改良法:
    i)多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製する、
    ii)水または緩衝液中におけるSiOの懸濁液を調製する、
    iii)SiOの懸濁液を工程(i)の多糖類溶液に添加する、そして
    iv)純粋な形態の多糖類溶液を単離する。
  10. SiOのサイズが0.01μmから200μmまでの範囲、好ましくは3μm〜40μmの範囲である、請求項9に記載の多糖類を単離するための方法。
  11. SiOの量が0.5から20%(w/v)までの範囲である、請求項9に記載の多糖類を単離するための方法。
  12. 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の溶解物または濃縮物が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、および33Fから選択される1以上の血清型を含む、請求項9に記載の肺炎球菌から多糖類を単離するための方法。
  13. 多糖類および他の不純物を含む溶液の、SiOへの接触または曝露が、15℃から60℃までの範囲の温度で10分〜16時間の期間行なわれる、請求項9に記載の多糖類を単離するための方法。
  14. 純粋な形態の肺炎球菌莢膜多糖類を単離するための、下記の工程を含む方法:
    i)肺炎球菌莢膜の多糖類、タンパク質、核酸、細胞壁成分および他の不純物を含む多糖類溶液を調製し、その際、溶液のpHを3.0から9.0までの範囲に維持する、
    ii)場合により他の試薬を添加する、
    iii)場合により溶液を活性炭で処理する、
    iv)水または緩衝液中における、0.01μmから200μmまでの範囲の粒子を有するSiOの懸濁液を調製する、
    v)SiOの懸濁液を工程(i)の多糖類溶液に、15℃〜60℃の範囲の温度で10分〜20時間の期間、添加する、
    vi)場合により溶液を活性炭で処理する、
    vii)場合により他の試薬を添加する、そして
    vii)純粋な形態の多糖類溶液を単離する。
  15. 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の溶解物または濃縮物が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、および33Fから選択される1以上の血清型を含む、請求項14に記載の肺炎球菌から多糖類を単離するための方法。
  16. 多糖類および他の不純物を含む溶液の、SiOへの接触または曝露が、15℃から60℃までの範囲の温度で10分〜16時間の期間行なわれる、請求項14に記載の多糖類を単離するための方法。
  17. ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドまたはCRM197から選択されるキャリヤータンパク質にコンジュゲートした、請求項14の記載に従って調製した莢膜多糖類を含む、免疫原組成物。
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