CN107827944B - 一种阿扎胞苷单晶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于原料药制备技术领域，尤其涉及一种阿扎胞苷单晶的制备方法。本发明的技术方案是：首先取一定量的阿扎胞苷固体于某一温度下加入适量有机溶剂(一种或者多种混合溶剂)溶解，然后通过微孔滤膜进行过滤，得到一定浓度的阿扎胞苷溶液，同时保证所得溶液澄清透明，无任何肉眼可见微粒；然后采用挥发溶剂扩散法培养阿扎胞苷单晶。本发明提供了一种阿扎胞苷单晶的培养方法，为阿扎胞苷原料药的质量控制，特别是手性中心的绝对构型确证提供了科学的方法。

Description

一种阿扎胞苷单晶的制备方法

技术领域

本发明属于原料药制备技术领域，尤其涉及一种阿扎胞苷单晶的制备方法。

背景技术

阿扎胞苷(azacitidine)，化学名为1-(β-D-呋喃核糖基)-4-氨基-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮，又名5-氮杂胞苷、氮杂胞苷，其结构如下所示：

阿扎胞苷为白色针状结晶，是由美国Pharmion公司研发的DNA甲基转移酶抑制剂，2004年7月首次在美国上市；是作用于S期的细胞周期特异性药，能迅速磷酸化并渗入RNA(核糖核酸)和DNA(脱氧核糖核酸)通过破坏核酸顺利翻译为蛋白质，而抑制蛋白质的合成，还可通过抑制乳清酸核苷酸脱羧酶而影响嘧啶的合成；临床上主要用于治疗骨髓增生异常综合征，包括难治性贫血、难治性贫血伴有环形铁粒幼细胞增多，如同时伴有中性粒细胞减少症、血小板减少症或需要输血、难治性贫血伴有原始细胞增多、难治性贫血伴有原始细胞增多–转变型和慢性骨髓单核细胞性白血病5种亚型。

目前，阿扎胞苷的制备方法是通过六甲基硅氮烷和三甲基氯硅烷对起始原料5-氮杂胞嘧啶进行硅烷基化反应生成硅烷基化的5-氮杂胞嘧啶；然后和四乙酰核糖在三氟甲磺酸三甲基硅脂作用下对接，得到乙酰化的阿扎胞苷，最后通过甲醇钠脱乙酰基制备阿扎胞苷。

因为阿扎胞苷分子结构含有多个手性中心，合成工艺中的对接的过程也可能会使得核糖上的手性中心构型发生变化，从而产生新的手性中心。多个手性中心的化合物，其手性的绝对构型的检测是非常难的，虽然核磁可以确定部分手性碳的绝对构型，但采取的只是是相对的检测手段。

通过培养单晶进行结构测定，特别是对多个手性中心的化合物的绝对手性构型的测定是最直接确证手性绝对构型的方法。但单晶的制备目前尚无统一的理论支持，故单晶的制备有一定难度，对化合物的纯度、结晶条件等有着严苛的要求。阿扎胞苷的单晶没有公开报道。绝对手性构型也是困扰着本领域技术人员的难题。

发明内容

发明目的提供一种阿扎胞苷单晶的制备方法，以提高阿扎胞苷原料药的质量控制。

本发明旨在通过合成阿扎胞苷，然后对所制备的阿扎胞苷进行单晶培养，获得了阿扎胞苷单晶。本发明阐释了一种阿扎胞苷单晶的培养方法。进一步确定了阿扎胞苷的手性中心和空间结构的正确性。本发明通过对阿扎胞苷单晶制备的大量研究，得到了阿扎胞苷单晶。

技术方案

本发明通过对阿扎胞苷进行单晶培养；获得了阿扎胞苷单晶；并对阿扎胞苷单晶进行了单晶衍射检测，得到了阿扎胞苷的空间立体结构数据。

本发明所涉及的阿扎胞苷单晶培养方法，其主要特征在于，包含以下步骤：

第一步阿扎胞苷固体的溶解

取一定量的阿扎胞苷固体于某一温度下加入适量有机溶剂(一种或者多种混合溶剂)溶解，然后通过微孔滤膜进行过滤，得到一定浓度的阿扎胞苷溶液，同时保证所得溶液澄清透明，无任何肉眼可见微粒。

本步骤所述某一温度为15-40℃之间的任何温度，优选15℃到30℃之间，最优选为25℃到30℃之间。

本步骤所述有机溶剂包含极性溶剂和非极性溶剂两类，其中极性溶剂包括二甲基亚砜，二甲基甲酰胺，甲醇，乙醇，异丙醇；非极性溶剂包括甲苯，二氯甲烷，正己烷，环己烷等，其中优选二甲基亚砜，甲苯，甲醇，二氯甲烷或者其中的两种及其多种溶剂组合。特别优选的二甲基亚砜，甲苯，二氯甲烷的混合溶剂体系。

本步骤所述一定浓度的阿扎胞苷溶液所指的浓度范围为10mg/mL到200mg/mL之间的浓度范围，优选 100mg/mL。

本发明所指的过滤是指一切能够去除未知颗粒物的或者机械杂质的操作。

第二步阿扎胞苷单晶的培养

本发明采用的单晶培养方法为挥发溶剂扩散法，其具体方法如下：

1)将第一步所获得的无色澄清溶液用注射器定量量取转移至烧杯(容器A)。

2)随后对容器A用封口膜进行密封处理，并且需要在容器A的封口膜密闭处用注射器针头扎上适当数量的小孔(8到15个最佳)，使得溶剂能通过小孔自由扩散。

3)另取一个烧杯(容器B)，加入适量二氯甲烷。本步骤所要求的容器B其体积必须大于容器A，并且保证容器A能够顺利放入容器B内。

4)步骤1所制备的无色澄清溶液连同其盛放容器A，放入到盛有有机溶剂的容器B中。

5)而后用封口膜对容器B进行密封，确保容器B中的有机溶剂不能通过气化溢出容器B外面。

6)整个装置置于恒温恒湿的环境中，避光，静置放置，严格避免装置晃动。本步骤所要求的恒温是指25℃，恒湿指湿度为50RH-60％Rh。

7)最初每隔2至4小时观察一次，第二天每隔8小时观察一次，并记录单晶情况。直至出现单晶，当单晶出现时，继续培养2-4天。

本发明所得到的阿扎胞苷单晶为单斜晶系，其关键数据如下

本发明单晶解析的具体数据，包括键长，键角，扭转角等见下列数据：

Table 1:Crystal data and structure refinement for Azacitidine

Table 2 Fractional Atomic Coordinates(×104)and equivalent isotropicDisplacement Parameters

for Azacitidine.Ueq is defined as 1/3 of thetrace of the orthogonalised UIJ tensor.

Table 3 Anisotropic Displacement Parameters

forAzacitidine.The Anisotropic Displacement Factor exponent takes the form:-2π2[h2a*2U11+......+2hka×b×U12]

Table 4 Bond Lengths for Azacitidine

Table 5 Bond Angle for Azacitidine.

Table 6 Torsion Angles for Azacitidine

Table 7 Hydrogen Atom Coordinates

and Isotropic DisplacementParameters

for Azacitidine.

Experimental

Single crystals of C10H18N4O6S(Azacitidine)were recrystallized fromDMSO mounted in inert oil and transferred to the cold gas stream of thediffractometer.

Crystal structure determination of[Azacitidine]

Crystal Data.C10H18N4O6S,M＝322.34,monoclinic,

β＝102.167(7)0,

T＝108.7,spacegroup P2I(No.4),Z＝2,μ(Cu Kα)＝2.358,4396 reflections measured,2671unique(R＝0.0305)which were used in all calculations.The final wR(F2)was 0.01086(alldata).

有益效果：

本发明提供了一种阿扎胞苷单晶的培养方法，为阿扎胞苷原料药的质量控制，特别是手性中心的绝对构型确证提供了科学的方法。

本发明自制了阿扎胞苷，并进行了精制处理，进一步提高阿扎胞苷的纯度。使用精制后的阿扎胞苷进行单晶培养实验。通过尝试多种方法(包括挥发法，溶剂扩散法等)单晶培养方法，最终找到并且确定了单晶的培养方法，获得了阿扎胞苷单晶，进而进行了单晶检测，进一步证明了阿扎胞苷空间结构。

附图说明

图1为阿扎胞苷单晶的单晶衍射解析后结果图谱。

实施例1阿扎胞苷精制，过程如下：

氮气保护下，将130mL的二甲基亚砜(DMSO)加入四口瓶中，升温到70-75℃，缓慢加入50g阿扎胞苷粗品，搅拌至溶清。加入1.5g活性炭，控温70℃，搅拌脱色30分钟。精密过滤。所得液体加入 0.1g的甲醇钠固体，滴加35mL甲醇，滴加入于55-60℃搅拌2小时，滴加550mL甲醇，滴完降温到室温，过滤，100mL甲醇洗涤，得到湿品43g，于50℃，-0.09MPa真空下减压干燥至恒重，得到阿扎胞苷40.4g。HPLC纯度99.84％。

实施例2单晶培养过程

向25mL烧杯中加入实施例1所获得的阿扎胞苷固体0.5g，而后加入1mL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻用玻璃棒搅拌使溶解。然后加入0.5mL甲醇和1mL甲苯，玻璃棒继续搅拌至澄清。然后用0.25μ m滤膜过滤至另一干净的25mL烧杯内。用封口膜或者保鲜膜将此烧杯密封，然后用针在封口膜上扎出10个小孔(尽可能保证所扎出的小孔分布均匀)。此烧杯编号A。另取100mL烧杯一只，编号为B。向其中加入20mL二氯甲烷，然后将烧杯A放入烧杯B内，用封口膜将烧杯B密封。而后放置于恒温 25℃，湿度为50％环境中，避免晃动，静置放置一到两周左右。第一天每隔2小时观察一次，如果没出晶体，第二天每隔4小时观察一次，还没出晶体，第三天每隔8小时观察一次，如果还没出现晶体，以后每天观察一次。整个过程持续一周，能观察到单晶出现。起初是在烧杯的内壁，然后逐渐长大，当长大到3mm左右时，将晶体用针头取出放入离心管，密封好，得本发明单晶。

实施例3本实施例是在实施例2的基础上，直接制备饱和溶液，其单晶形成时间较实施例2明显缩短，其过程如下：

向25mL烧杯中加入实施例1所获得的阿扎胞苷固体0.5g，而后加入1mL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻用玻璃棒搅拌使溶解。然后加入0.2mL甲醇和1mL甲苯，玻璃棒继续搅拌至澄清。此时用滴管向澄清溶液中滴加二氯甲烷，滴加过程中局部会变浑浊，此时等到浑浊消失继续滴加，直到体系变得微微浑浊，摇晃后也不消失时，停止滴加二氯甲烷。此时认为获得了阿扎胞苷的饱和溶液。然后用0.25μm滤膜过滤至另一干净的25mL烧杯内。用封口膜或者保鲜膜将此烧杯密封，然后用针在封口膜上扎出10 个小孔(尽可能保证所扎出的小孔分布均匀)。此烧杯编号A。另取100mL烧杯一只，编号为B。向其中加入20mL二氯甲烷，然后将烧杯A放入烧杯B内，用封口膜将烧杯B密封。而后放置于恒温25℃，湿度为50％环境中，避免晃动，静置放置一到两周左右。第一天每隔2小时观察一次，如果没出晶体，第二天每隔4小时观察一次，还没出晶体，第三天每隔8小时观察一次，如果还没出现晶体，以后每天观察一次。整个过程持续一周，能观察到单晶出现。起初是在烧杯的内壁，然后逐渐长大，当长大到3mm 左右时，将晶体用针头取出放入离心管，密封好，得本发明单晶。

实施例4向25mL烧杯中加入实施例1所获得的阿扎胞苷固体0.5g，而后加入1mL二甲基亚砜 (DMSO)，轻轻用玻璃棒搅拌使溶解。然后加入5mL甲醇，玻璃棒继续搅拌至澄清。此时用滴管向澄清溶液中滴加二氯甲烷，滴加过程中局部会变浑浊，此时等到浑浊消失继续滴加，直到体系变得微微浑浊，摇晃后也不消失时，停止滴加二氯甲烷。此时认为获得了阿扎胞苷的饱和溶液。然后用0.25μm滤膜过滤至另一干净的25mL烧杯内。用封口膜或者保鲜膜将此烧杯密封，然后用针在封口膜上扎出10 个小孔(尽可能保证所扎出的小孔分布均匀)。此烧杯编号A。另取100mL烧杯一只，编号为B。向其中加入20mL二氯甲烷，然后将烧杯A放入烧杯B内，用封口膜将烧杯B密封。而后放置于恒温25℃，湿度为50％环境中，避免晃动，静置放置一到两周左右。第一天每隔2小时观察一次，如果没出晶体，第二天每隔4小时观察一次，还没出晶体，第三天每隔8小时观察一次，如果还没出现晶体，以后每天观察一次。整个过程持续一周，能观察到单晶出现。起初是在烧杯的内壁，然后逐渐长大，当长大到3mm左右时，将晶体用针头取出放入离心管，密封好，得本发明单晶。

Claims (6)

1.一种阿扎胞苷单晶培养方法，其特征在于，包含以下步骤：

第一步阿扎胞苷固体的溶解：

取一定量的阿扎胞苷固体于某一温度下加入适量有机溶剂溶解，然后通过微孔滤膜进行过滤，得到一定浓度的阿扎胞苷溶液，同时保证所得溶液澄清透明，无任何肉眼可见微粒；

本步骤所述有机溶剂选自二甲基亚砜，二甲基甲酰胺，甲醇，乙醇，异丙醇，甲苯，二氯甲烷其中的两种或两种以上溶剂组合；

第二步阿扎胞苷单晶的培养：采用挥发溶剂扩散法,其具体方法如下：

1)将第一步所获得的无色澄清溶液用注射器定量量取转移至容器A；

2)随后对容器A用封口膜进行密封处理，并且需要在容器A的封口膜密闭处用注射器针头扎上适当数量的小孔，使得溶剂能通过小孔自由扩散；

3)另取一个容器B，加入适量二氯甲烷，本步骤所要求的容器B其体积必须大于容器A，并且保证容器A能够顺利放入容器B内；

4)步骤1所制备的无色澄清溶液连同其盛放容器A，放入到盛有有机溶剂的容器B中；

5)而后用封口膜对容器B进行密封，确保容器B中的有机溶剂不能通过气化溢出容器B外面；

6)整个装置置于恒温恒湿的环境中，避光，静置放置，严格避免装置晃动,本步骤所要求的恒温是指25℃，恒湿指湿度为50RH-60％Rh；

7)最初每隔2至4小时观察一次，第二天每隔8小时观察一次，并记录单晶情况，直至出现单晶，当单晶出现时，继续培养2-4天；

第一步骤所述一定浓度的阿扎胞苷溶液所指的浓度范围为10mg/mL到200mg/mL之间的浓度范围。

2.按照权利要求1所述单晶培养方法，其特征在于，第一步所述某一温度为15-40℃之间的任何温度。

3.按照权利要求1所述单晶培养方法，其特征在于，第一步所述某一温度为15℃到30℃之间。

4.按照权利要求1所述单晶培养方法，其特征在于，第一步所述某一温度为25℃到30℃之间。

5.按照权利要求1所述单晶培养方法，其特征在于，第一步所述有机溶剂为二甲基亚砜，甲苯，二氯甲烷的混合溶剂体系。

6.按照权利要求1所述单晶培养方法，其特征在于，第一步骤所述一定浓度的阿扎 胞苷溶液所指的浓度为100mg/mL。

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