CN103115885A - 光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，该方法将纯化后的目标蛋白均匀混入脂立方样品后，对样品进行一个温度逐级升高的梯度加热/冷却过程。每一步升温后，水分子会析出脂立方样品而使样品变得浑浊，因此重新冷却样品并高速离心，使水分子重新进入脂立方，让样品变回无色透明状态。然后通过采集样品的荧光信号，鉴定目标蛋白的稳定性。本发明方法设计合理，可操作性强，可以实现在脂立方样品中直接测定蛋白的稳定性，为随后的晶体和相关研究提供了数据和理论的支持。本发明方法中应用的基因也可以为蛋白已经各类小分子的控制研究提供支持。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质基因工程技术领域，具体涉及一种通过光谱学测定脂立方样品中的膜蛋白的活性以和稳定性的方法。
背景技术
早在1960年研究者就已经证明，亲水性和疏水性的两性分子在水中可以形成很多形态各异结构的理论。1962年luzzati的研究组测定了层状相的结构，也获得了六角相的电子显微结构。随后不久，又用X射线技术测定了类脂立方相的结构。1968年luzzati与加拿大的研究专家对脂质-水体系（lipid-water system）进行了X射线的研究，得到了脂质-水体系的随脂质浓度和温度变化的部分相图。1980年larsson提出，立方液晶中无限循环排列的脂双层膜非常类似于生物膜中的脂双层膜。1990年Engbrom S.及其同事根据脂质立方液晶的结构特点，提出可以将类脂立方液晶用作药物载体。脂质立方相 (Lipidic cubic phase, LCP) 应用于膜蛋白结晶最早是在1996年，Landau & Rosenbusch通过脂质立方相获得了第一个完整的细菌视紫红质蛋白的2.5埃的晶体结构。在此之后，通过脂质立方相结晶膜蛋白就成为一个很实用的技术，并被广泛传播。实践证明，这项技术对于阐明膜蛋白的结构机制是至关重要的，近年来，通过LCP获得了很多关键蛋白的结构信息，譬如，各种细菌视紫红质蛋白以及第一个高分辨率的人源G蛋白偶联受体（2-adrenergic receptor）。 运用脂质立方相能成功获得高分辨率膜蛋白晶体，主要归结为以下两个原因：第一，与使用去垢剂与蛋白形成微球的恶劣环境不同，脂质立方相提供了一个更加接近天然的类似生物膜的环境；第二，在脂质立方相中，晶体生长时蛋白分子是按照I型堆积方式堆积，也就是蛋白分子不仅通过亲水部位相互作用堆积，也通过疏水部位相互接触而堆积，从而使得晶体结构更加有序，所含的水更少。到目前为止，通过LCP获得的晶体结构达102个，蛋白种类达22种，晶型27种。因此，我们可以看出LCP为结构生物学研究提供了一个强有力的工具，在未来膜蛋白结构生物学研究中将扮演着举足轻重的角色。
在获得更多的蛋白结晶并解析其结构的基础上，我们可以来进行基于蛋白结构的药物设计，从而更加有效快速的筛选潜在药物，减少药物研发的成本和周期，并且可以有效的提高药物的疗效和减少药物的副作用。热稳定性越高的蛋白，其相应结晶成功率也就越高。因此为了更好的用脂立方技术进行蛋白结晶实验，筛选有前景的蛋白construct又是其中的重中之重。另外，脂立方主要的脂质和脂质添加剂，以及限定可能的沉淀剂和缓冲液的范围，都有可能影响蛋白的热稳定性。
现有技术中，蛋白的热稳定性测定办法非常多，包括底物结合曲线，圆二色光谱，升温曲线等等。然而这些技术都是基于蛋白在溶液中的情况，并不反映蛋白在脂立方样品中的具体表现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法设计合理、可操作性强、可以在脂立方样品内直接测定膜蛋白的稳定性的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特点是，其步骤如下：
（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；
（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；
①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20℃的冰箱取出中，加热至37-40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 - 二油酰-sn-甘油-3 - 磷酸胆碱，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3 - 磷脂酰甘油，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；
②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；
③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18-22℃的条件下离心；
（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；
采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5-10℃为一升温梯度循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100℃；以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。
本发明所述的方法中：步骤（2）所述的甘油一油酸酯与脂类分子混合物可以采用以下方法配制：将甘油一油酸酯与所述的脂类分子按比例置于适量的氯仿中，使用氮气流蒸发大部分溶剂，随后在真空21-23℃下处理至少12小时，除尽其余的残留氯仿后，在-20℃下储存。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明方法设计合理，可操作性强，可以实现在脂立方样品中直接测定蛋白的稳定性，为随后的晶体和相关研究提供了数据和理论的支持。
（2）本发明方法中应用的基因也可以为蛋白已经各类小分子的控制研究提供支持。
附图说明
图1为在甘油一油酸酯和其它脂质分子组成的脂立方中，β2肾上腺素受体，以及β2肾上腺素受体-T4溶菌酶融合蛋白与噻吗洛尔结合的热稳定性图；
图2为在甘油一油酸酯和不同的pH值缓冲液组成的脂立方中，β2肾上腺素受体-T4溶菌酶融合蛋白与噻吗洛尔结合物的热稳定性图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其步骤如下：
（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；
（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；
①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20℃的冰箱取出中，加热至37-40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 - 二油酰-sn-甘油-3 - 磷酸胆碱，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3 - 磷脂酰甘油，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；
②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；
③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18-22℃的条件下离心；
（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；
采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5-10℃为一升温梯度循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100℃；以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。
实施例2，实施例1所述的方法，步骤（2）所述的甘油一油酸酯与脂类分子混合物采用以下方法配制：将甘油一油酸酯与所述的脂类分子按比例置于适量的氯仿中，使用氮气流蒸发大部分溶剂，随后在真空21-23℃下处理至少12小时，除尽其余的残留氯仿后，在-20℃下储存。
实施例3：实验例。
1、肾上腺素受体膜蛋白的表达与纯化
（1）在NCBI网站上输入“beta2 adrenergic receptor”搜索序列。根据NCBI网站上公布的序列，得到在真核细胞中编码肾上腺素受体基因的全长序列。
（2）将目标基因转入昆虫HEK293细胞表达系统。在塑料培养皿上培养HEK293细胞，在37℃下，在Dulbecco的基础上修改Eagle培养基（Cellgro）中加入5%的二氧化碳和5％胎牛血清。约48小时后，加入1微克的 载体pCDNA3受体质粒和3微升Fugene6试剂进行转染。约48小时后，细胞 用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定，用PBS +2％山羊血清阻断，用PBS +2％山羊血清+0.5％NONIDET P-40（Sigma公司）进行透性化。
（3）Dulbecco的基础上修改Eagle培养基（Cellgro）技术优势：用吡哆醇代替了盐酸吡哆醛，而从确保原配方提高了稳定性。Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）是Eagle的基础培养基（BME）的基础上提高了4倍浓度的氨基酸和维生素。原始配方被用来培养小鼠胚胎细胞和已经被修改，以支持各种正常和转化的细胞，如小鼠和鸡细胞的原代培养。该培养基制剂包括葡萄糖，丙酮酸钠，碳酸氢钠和L-谷氨酰胺。的DMEM10-013-CV-CM-LB，-LX含有4.5克/升葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠等等。
（4）FuGENE 6转染试剂是一个专有的混合脂类和其他组成成分的试剂。试剂来源于提供的80％乙醇溶液中，无菌过滤，并包装在玻璃小瓶中。它不包含任何成分的人类或动物组织。
（5）PBS溶液的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L即可。在15 lbf/in2(1034×105Pa) 高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存于室温或4℃冰箱中。
a.当感染的昆虫细胞超表达目标蛋白后，将细胞收集好，并用低盐细胞清洗液初步去除杂质。
b.低盐细胞清洗液包括： 25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5；10毫摩的氯化镁；20毫摩的氯化钾。保存于室温或4℃冰箱中。
c.用低盐细胞清洗液初步去除杂质，再用高盐细胞清洗液进一步清洗去除杂质。
d.高盐细胞清洗液包括： 25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5；10毫摩的氯化镁；20毫摩的氯化钾和1摩尔的氯化钠。保存于室温或4℃冰箱中。
e.用高盐细胞清洗液进一步清洗去除杂质后，重新将细胞悬浮在细胞悬浮液中。
f.细胞悬浮溶液包括： 25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5；10毫摩的氯化镁；20毫摩的氯化钾和40%(体积比)的甘油。保存于-80℃冰箱中。
g.当细胞被低盐和高盐洗液清洗之后，在细胞悬浮液中加入蛋白提取液将蛋白从细胞膜提取到溶液中。
h.膜蛋白提取液包括： 25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5；300毫摩的氯化钠， 0.5%（体积比）的 n-十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷和0.1%（体积比）胆甾醇半琥珀酸酯。保存于4℃冰箱中。
i.将目标膜蛋白提取到溶液中之后，将其结合到钴结合介质上去。然后用膜蛋白清洗液1去除多余的杂质。
j.膜蛋白清洗液1包括：25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5； 800毫摩的氯化钠， 0.1%（体积比）的 n-十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷，0.02%（体积比）胆甾醇半琥珀酸酯，5毫摩的咪唑，10毫摩的氯化镁和8毫摩的三磷酸腺苷。保存于4℃冰箱中。
k.将目标膜蛋白提取到溶液中之后，将其结合到钴结合介质上去。然后用膜蛋白清洗液2去除多余的杂质。
l.膜蛋白清洗液2包括：25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5； 150毫摩的氯化钠， 0.05%（体积比）的 n-十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷，0.01%（体积比）胆甾醇半琥珀酸酯和5毫摩的咪唑。保存于4℃冰箱中。
m.用膜蛋白清洗液1和2去除多余的杂质后，用膜蛋白洗脱液将蛋白从钴结合介质上洗脱，重新回到溶液中。
n.膜蛋白清洗液2包括：25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5； 150毫摩的氯化钠， 0.05%（体积比）的 n-十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷，0.01%（体积比）胆甾醇半琥珀酸酯和200毫摩的咪唑。保存于4℃冰箱中。
o.对于所有测量蛋白样品，都要准备其对照样品。即无蛋白的缓冲液(含有的蛋白质溶液中的所有的部件相同的部件，除了目标蛋白质)。
p.无蛋白的缓冲液：25毫摩的4-羟乙基哌嗪乙磺酸， pH 7.5； 150毫摩的氯化钠， 0.05%（体积比）的 n-十二烷基-β -D-吡喃麦芽糖苷，0.01%（体积比）胆甾醇半琥珀酸酯和200毫摩的咪唑。保存于4℃冰箱中。本溶液中不含洗脱蛋白，这是和（12）中溶液的区别。
2、数据采集
采用“实施具体步骤”中的步骤制备包含膜蛋白的脂立方样品，并采集吸光度和荧光光谱。
3、数据分析
在这项研究中，所有的实验样品的制备和分析至少设置三个技术重复。蛋白质热变性的数据适合使用GraphPad棱镜软件（加利福尼亚州拉霍亚，玻尔兹曼S型函数）进行分析。
F(T) = Fmin +(Fmax-Fmin)/(1+exp((Tm-T)/S))
其中F是标准化荧光，T是温度，Fmin的和Fmax是拟合参数描述过渡之前和之后的荧光，Tm是化退火温度， S是过渡的斜率。荧光以及温度和斜率信号是以任意单位表示的，温度单位为℃表示。实验结果可以参见下表1-3和图1-图2。
表1 样品测定的重复性验证
表2 蛋白稳定性在不同的脂质分子混合物中有显著不同
表3 蛋白稳定性在不同的pH环境中有显著不同
4、实验结论
通过上述图表可以看出，通过本发明专利的实验方法对肾上腺素受体进行光谱学稳定性测试，我们可以得到膜蛋白在不同环境中的稳定性（包括pH值，脂质添加剂等等），从而对后续的实验起到指导性的作用。本发明方法可以推广到其他的实例中，能实现不同膜蛋白稳定性的测定，达到预期的实验目的。
Claims (2)
1.一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；
（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；
①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20℃的冰箱取出中，加热至37-40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 - 二油酰-sn-甘油-3 - 磷酸胆碱，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3 - 磷脂酰甘油，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；
②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；
③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18-22℃的条件下离心；
（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；
采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5-10℃为一升温梯度循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100℃；以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的甘油一油酸酯与脂类分子混合物采用以下方法配制：将甘油一油酸酯与所述的脂类分子按比例置于适量的氯仿中，使用氮气流蒸发大部分溶剂，随后在真空21-23℃下处理至少12小时，除尽其余的残留氯仿后，在-20℃下储存。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130522 |