CN107987148A - 一种人工生物膜系统以及制备方法和应用 - Google Patents

一种人工生物膜系统以及制备方法和应用 Download PDF

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彭艳春
李子剑
陈智杰
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Abstract

本发明提供了一种人工生物膜系统及其制备方法和应用，人工生物膜系统为含有膜蛋白的脂立方相，其特征在于：所述膜蛋白为钠葡萄糖蛋白。本发明的人工生物膜系统中膜蛋白的浓度高，且保留了多跨膜区整合膜蛋白结构完整性所需的膜环境。本发明制得的抗体能够很好的识别膜蛋白，能够识别连续性的空间表位，并且能显著抑制SGLT2的葡萄糖转运功能。

Description

一种人工生物膜系统以及制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种人工生物膜系统以及制备方法和应用。
背景技术
横跨生物膜两次以上的蛋白统称为多跨膜区整合膜蛋白，主要包括G蛋白偶联受体，离子通道，转运蛋白。多跨膜区整合膜蛋白约占细胞总蛋白的30%，是三分之二以上药物的靶点。多跨膜区整合膜蛋白主要由疏水性氨基酸组成，蛋白的大部分被生物膜的脂质双分子层所覆盖。在分离纯化多跨膜区整合膜蛋白的时候要使用特定去污剂溶解细胞膜。此后去垢剂能取代细胞膜覆盖跨膜区整合膜蛋白的疏水性部位，形成蛋白/去垢剂复合物。由于去垢剂和构成细胞膜的脂类物质特性不一样，这样在蛋白/去垢剂复合物中的多跨膜区整合膜蛋白大多不具备原始蛋白的结构和功能。
保持多跨膜区整合膜蛋白结构和功能完整性的有效方法是将纯化后的蛋白重新构建到人工生物膜中。最常见的人工生物膜是人工脂质体（liposome），这是一种由磷脂组成的双层脂分子球体。分离纯化后的多跨膜区整合膜蛋白可以重新嵌入人工脂质体中，并恢复其结构和功能完整性。重新嵌入时蛋白质溶液和脂类分子的重量比例一般是1:100以上，因此在人工脂质体中多跨膜区整合膜蛋白的浓度低。
尽管多跨膜区整合膜蛋白是目前三分之二小分子药物的靶点，但是小分子药物对靶点的选择性通常较差。抗体由于其安全性、有效性和高度特异性，目前已经广泛用于肿瘤、自身免疫以及感染性疾病等的治疗。可以预见功能性多跨膜区整合膜蛋白的抗体具有显著临床和研究意义。钠葡萄糖共转运蛋白(SGLT) 包括SGLT1以及SGLT2，属于多跨膜区整合膜蛋白。他们主要分布在小肠以及肾小管，是葡萄糖的主要吸收蛋白，其中抑制SGLT2的功能能有效降低人II型糖尿病人血糖含量。钠葡萄糖共转运蛋白SGLT2是目前主要在研的糖尿病药物靶点之一。已经批准或者还处于研发后期（III临床）用于II型糖尿病SGLT2的小分子抑制剂已经有达到7种之多。
现阶段还是采用制备水溶性蛋白抗体的方法来制备多跨膜区整合膜蛋白抗体，即以分离纯化的蛋白或者蛋白中的一个多肽片段为抗原来免疫动物。这种方法一般获得特异抗体的成功率低，主要原因包括：1）多跨膜区整合膜蛋白的特异性抗原表位在很大程度上依赖于生物膜的存在，由于失去了生物膜，蛋白产生结构变化，抗原表位也随之丧失；2）蛋白的特异性表位抗体识别的往往是跨膜蛋白质中不连续的部分，无法用多肽免疫技术产生。
为了获得特异性的针对多跨膜区整合膜蛋白的抗体，一些研究尝试了将纯化的蛋白嵌入到脂质体中，或者直接使用含有目的蛋白的细胞膜为抗原来制备抗体。但是上述两种方案中，目标蛋白的浓度往往很低，很难获得目标抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工生物膜系统以及制备方法和应用。
本发明人通过用脂立方相克服了以上缺点，本发明人认为，这是因为：1）脂立方相中在多跨膜区膜蛋白浓度高；2）脂立方相提供了多跨膜区整合膜蛋白结构完整性所需的膜环境。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种人工生物膜系统，其为含有膜蛋白的脂立方相，所述膜蛋白为钠葡萄糖蛋白。
具体地，所述钠葡萄糖蛋白为人钠葡萄糖蛋白。
更具体地，所述人钠葡萄糖蛋白为SGLT1或SGLT2。
优选地，所述人钠葡萄糖蛋白为人SGLT2的氨基酸序列第10位到第672位组成的蛋白（SEQ ID NO：1）。
具体地，所述脂立方相包括甘油酯和磷脂。
更具体地，所述脂立方相包括油酸甘油酯和磷脂A。
本发明的另一个目的是提供一种所述的人工生物膜系统的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1）、根据钠葡萄糖蛋白的氨基酸序列设计合成适合酵母表达的DNA序列；
步骤（2）、将所述的DNA序列全基因合成到表达质粒中；
步骤（3）、将所述的表达质粒在酵母细胞中表达、分离、纯化得到合成的钠葡萄糖蛋白溶液；
步骤（4）、将所述的脂立方相的原料与步骤（3）合成的钠葡萄糖蛋白溶液混合形成所述的人工生物膜系统。
优选地，步骤（1）中，在所述钠葡萄糖蛋白的氨基酸序列的氮末端添加用于蛋白的亲和纯化的多个连续的组氨酸序列、用于酶联免疫的FLAG 表位序列、用于去除所述的组氨酸序列和所述的FLAG 表位序列的TEV酶切位点序列，然后设计合成适合酵母表达的DNA序列。
进一步优选地，所述的FLAG 表位序列为DYKDDDK；所述的TEV酶切位点序列为NLYFQGS。
进一步优选地，所述的组氨酸序列为10个连续的组氨酸。
更为优选地，在所述钠葡萄糖蛋白的氨基酸序列的氮末端添加的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，步骤（4）的具体实施方式为：将甘油酯融解，将步骤（3）得到的钠葡萄糖蛋白溶液和磷脂形成混合溶液，然后将融解后的甘油酯与所述的混合溶液按体积比为1~2.5:1进行混合形成所述的人工生物膜系统，其中，所述的混合溶液中所述的钠葡萄糖蛋白与所述的磷脂的质量比为15~25:1。进一步优选地，将融解的甘油酯加入注射器中，在另一个注射器中加入所述的混合溶液，两个注射器用专用接头连接后，将上述两个注射器中的内容物混合，直至形成透明的人工生物膜系统。
进一步优选地，所述的甘油酯与所述的混合溶液的体积比为1.5:1。
进一步优选地，所述的混合溶液中所述的钠葡萄糖蛋白与所述的磷脂的质量比为20:1。
本发明的制备方法，在酵母细胞中表达、分离并纯化氮末端含有10×His和FLAG表位，TEV酶切位点的人SGLT2：10-672蛋白，也可以为氮末端不含上述额外序列的人SGLT2：10-672蛋白。
更为优选地，将分离纯化的人SGLT2：10-672浓缩后与油酸单甘油酯和单磷酰脂A混合，制备成含有SGLT2的脂立方相。
本发明提供的人工生物膜系统是一种双连续立方相的矩阵结构，其中具有无限三维周期性结构的膜系统被连续的水通道贯穿，弯曲的脂质双分子层与插入的膜蛋白分子包围一个水导管。该立方相的60％（体积）通常是由油酸甘油酯组成的双层膜系统。疏水性蛋白溶液占40%体积，可以在膜上横向自由扩散。该系统的主要特点是多跨膜区膜蛋白高浓度地嵌入到生物膜中，此外，脂立方相提供了多跨膜区整合膜蛋白结构完整性所需的膜环境。
本发明的第三个目的是提供一种由所述的人工生物膜系统经破碎制成的微型颗粒。
本发明的第四个目的是提供一种免疫组合物，其包括所述的人工生物膜系统或所述的微型颗粒。
本发明的第五个目的是提供所述的人工生物膜系统或所述的微型颗粒作为免疫原的用途。
本发明的第六个目的是提供一种使用所述的人工生物膜系统、所述的微型颗粒或所述的免疫组合物经免疫获得的抗体。
本发明的第七个目的是提供一种所述的抗体的制备方法，使用所述的人工生物膜系统、所述的微型颗粒或所述的免疫组合物免疫动物，获得所述的抗体。
本发明提供的抗体的制备方法能够有效制备出能识别完整多跨膜区整合膜蛋白的抗体。
该抗体的制备方法由三个步骤组成：a) 多跨膜区整合蛋白的分离纯化；b)将纯化好的多跨膜区整合蛋白与脂类分子混合制成脂立方相；c) 动物免疫。
优选地，利用细胞破碎仪将脂立方相制备成悬浮液。
进一步优选地，用脂立方相制备成悬浮液皮下免疫小鼠。
优选地，用分离纯化的SGLT2：10-672与弗氏非完全佐剂混合并皮下免疫小鼠。
优选地，利用抗FLAG抗体将氮末端含有10xHis、FLAG 表位和TEV酶切位点的人SGLT2：66-668蛋白固定在细胞培养微孔板内，用酶联免疫方法检测抗人SGLT2：10-672抗体。
本发明还提供了免疫印迹鉴定SGLT2：10-672特异性抗体的方法。
本发明还提供了体外测定SGLT2介导的葡萄糖转运的方法，并利用该方法鉴定抗体的功能。本发明的第八个目的是提供所述的抗体在制备用于预防和/或治疗糖尿病药物中的应用。
优选地，所述的糖尿病为II型糖尿病。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的人工生物膜系统中膜蛋白的浓度高，且保留了多跨膜区整合膜蛋白结构完整性所需的膜环境。
本发明制得的抗体能够很好的识别膜蛋白，能够识别连续性的空间表位，并且能显著抑制SGLT2的葡萄糖转运功能。
附图说明
图1 为SGLT2蛋白的拓扑图。
图2为 SGLT2：10-672跨膜蛋白在酵母中表达、分离纯化以及TEV酶切后的SDS-PAGE图。
图3 为 TEV酶切后SGLT2：10-672 的分子筛层析色谱图。
图4 为脂立方相模型示意图。
图5 为针对SGLT2：10-672抗体的酶联免疫分析结果。
图6 为针对SGLT2：10-672抗体的免疫印迹分析。
图7显示抗SGLT2抗体对SGLT2生物学功能的影响（葡萄糖转运分析）。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚，结合附图和实施例对本发明做进一步说明，应当理解，本实施例并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1 人钠葡萄糖转运蛋白的设计
人钠葡萄糖蛋白的氨基酸残基 (SGLT2)第10到672位的氨基酸包含了该蛋白所有跨膜区，根据其氨基酸序列设计了适合于酵母表达的cDNA序列。此外在SGLT2：10-672前面添加额外的序列MHHHHHHHHHHDYKDDDDKGSGENLYFQS。其中HHHHHHHHHH用于Talon™的亲和层析，DYKDDDDKG用于抗FLAG抗体结合，ENLYFQS为TEV蛋白酶识别位点。经过TEV 酶处理后，SGLT2蛋白的N端的额外序列将被去除。整条DNA由美国invitrogen公司全基因合成到表达质粒pPS293中。序列表中SEQ ID NO：1为人SGLT2氨基酸序列，SEQ ID NO：2为合成的编码人SGLT2：10-672的DNA序列， SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为在SGLT2：10-672氮末端的添加的氨基酸以及相应的DNA序列。
实施例2 人钠葡萄糖转运蛋白2的克隆表达和纯化
具体步骤包括：
酵母细胞的转化
将过夜培养的酿酒酵母FGY217加入到50毫升(ml)新鲜的YPAD培养基中使得OD600为0.1，待生长到OD600为0.6时候， 5000g离心收集菌体。分别用10 ml冰预冷的无菌水和100mM氯化锂各洗涤一次。最后用冰预冷的500微升(μl)的100mM氯化锂悬浮。取50 μl 的上述细胞，5000g离心去除氯化锂，然后依次加入240 μl的50% PEG3500、36 μl 100 mM 氯化锂、50 μl煮沸的浓度为2毫克每毫升的单链载体DNA、5 微克（μg）实施例1制得的含有SGLT2的表达质粒，最后加无菌水到360μl。漩涡震荡后30℃和42℃分别培养30分钟。5000g离心15秒，去除上清后加入1ml的无菌水悬浮，取100 μl涂布含有2%葡萄糖的SC-ura-minus（Sigma）平板，30℃培养3天。
酵母细胞的培养
挑取SC-ura-minus平板上的单菌落，在含有2%葡萄糖SC-ura-minus液体培养基30℃培养24小时后，细胞用含有0.1%葡萄糖的YPA培养基稀释到OD600为0.15，继续培养6小时，然后加入半乳糖到终浓度为2%，继续培养24小时。5000g离心15分钟收获细胞。
酵母细胞生物膜成分的分离
酵母细胞悬浮到pH为7.4的50mM HEPES缓冲液中。利用高压破细胞器在压力为40Kpsi、35Kpsi、32Kpsi以及 30Kpsi各处理一次。未破碎细胞以及细胞碎片用10000g离心10分钟去除。上清用100000g离心1小时，去除上清后即可得酵母的生物膜成分。生物膜成分重新用含有1M NaCl的pH为7.4的50 mM HEPES 洗涤一次。（说明：“摩尔”与“M”的含义不同，“摩尔”指量，而“M”表示浓度）
SGLT2的纯化
将上述制备的生物膜悬浮到pH为7.4的含有5%甘油、200 mM氯化钠、1%的Fos-choline-12(去垢剂)、5mM的咪唑的50mM HEPES缓冲液中。上述悬浮液25℃孵育1小时后，用100000g离心1小时，在上清中加入TalonTM 25℃继续孵育1小时，装入层析柱中。用相当于TalonTM体积50倍的含有5% 甘油、200mM氯化钠、0.12%的Fos-choline-12、15mM咪唑的pH为7.4 50mMHEPES缓冲液清洗层析柱。最后用含有300mM咪唑的上述缓冲液将目的蛋白洗脱。得到蛋白的缓冲液用PD10脱盐柱转换成含有200mM氯化钠、5%甘油、0.12% Fos-choline-12的pH为7.4的20 mM的HEPES缓冲液中。在上述蛋白溶液中加入等量浓度的氮末端含有6个组氨酸的TEV酶，4℃处理过夜后，加入TalonTM去除TEV酶。酶切后蛋白浓缩到1毫升，用Supedex 20010/300凝胶柱进行纯化，缓冲液为含有0.12% Fos-choline-12的磷酸盐缓冲液（PBS）。收集主要蛋白峰，用100K的浓缩器浓缩到5 mg/ml。附图2显示用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对分离纯化的蛋白分析的结果。条带C是TalonTM纯化的蛋白，条带D是经过TEV处理后的TalonTM纯化蛋白，条带A是去除了TEV酶后的蛋白产物，条带B是经过分子筛层析后的SGLT2：10-672 。附图3是SGLT2：10-672 的分子筛层析色谱图，单一对称性蛋白吸收峰，表明纯化SGLT2：10-672物理性质均一。
实施例3 脂立方相的制备
将油酸甘油酯在40℃融解，并加入到一只Haminton注射器中，在另外一只Haminton注射器中加入体积比为4:1的实施例2制得的SGLT2：10-672 蛋白溶液（5 mg/ml）以及磷脂A溶液（1mg/ml），形成蛋白磷脂混合溶液；两只Haminton注射器中分别加入的油酸甘油酯与蛋白质磷脂混合液的体积比为3:2，两个注射器用专用接头连接后将上述两个注射器中的内容物混合，直到形成透明的脂立方相。将制备的脂立方相悬浮于PBS中，使得每毫升磷酸盐缓冲液中含有浓度为1毫克每毫升的蛋白，然后使用小量高压破细胞器用20Kpsi两次将脂立方相分散成微型颗粒，见附图4。
实施例4 SGLT2多克隆抗体的制备
在用上述在脂立方相中的SGLT2:10-672直接免疫家兔。此外实施例2制得的SGLT2：10-672 蛋白溶液稀释至2mg/ml（其为水溶性蛋白抗原），然后与等体积的弗氏非完全佐剂混合乳化，免疫家兔，首次免疫时候按照每只家兔600μg的剂量。后背部皮下以及腹股沟多点注射：每点200μg抗原。加强免疫抗原的量为初次免疫的一半。于前次免疫后2周进行。最后一次加强免疫后14天放血，取血清。免疫血清用蛋白G纯化。
实施例5 SGLT2的酶联免疫（ELISA）检测
用50µl共计2µg的鼠抗FLAG单克隆抗体包被96孔酶联板过夜。第二天每孔加入50µl共计5µg纯化的TalonTM纯化的SGLT2蛋白，37℃孵育1小时后用含有0.12% Fos-choline-12的PBS洗3次，然后加入封闭液（含有5%BSA以及0.12% Fos-choline-12的PBS）处理一个小时，移走封闭液后，每孔加入50µl用封闭液倍比稀释的兔抗SGLT2多克隆血清，每个样品设计2个复孔，37℃孵育1个小时，用含有0.12% Fos-choline-12的PBS洗5次，每孔加入50µl的封闭液体稀释的1:5000的辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，37℃孵育1小时，同样洗5次然后加入OPD显色，用硫酸终止反应，490 nm读数。如图5显示，ELISA试验表明，用脂立方相方法得到的多克隆抗体（LCP抗体）能识别分离纯化的SGLT2蛋白，而直接用分离纯化蛋白作为抗原免疫后得到的抗体（蛋白抗体）不能识别SGLT2。
实施例6 SGLT2的免疫印迹（Western Blot）
大约25ng的SGLT2：10-672蛋白经过SDS-PAGE电泳，转移到醋酸纤维素膜，加入1:1000稀释的兔抗SGLT2多克隆血清，然后加入HRP羊抗兔多抗，ＥＣＬ显色（图6）。在1：1000的稀释度，该用脂立方相方法制备的多克隆抗体不能识别已经用SDS变性的蛋白（条带B）；而直接纯化蛋白作为抗原免疫得到的血清能明显识别SDS变性的SGLT2蛋白（条带A）。表示脂立方相方法得到的抗体（LCP抗体）能识别连续性的空间表位（原始蛋白），而用纯化蛋白免疫的抗体（蛋白抗体）只能识别线性表位（变性蛋白）。
实施例7 抗体对SGLT2功能的影响
钠葡萄糖转运分析使用的是表达有该SGLT2: 10-672的酵母细胞。酵母细胞的培养如实施例2和3。细胞用5000g离心后用含有20%蔗糖、100 mM NaCl 、100µg/ml的Zymolyase的10 mM Tris, pH 7.5悬浮到OD600为5.0，37℃孵育 30分钟。然后，在每100 µl细胞中加入1mM 的荧光葡萄糖类似物（同时分别加入SGLT2 的抑制剂pholizine, 制备的多克隆抗体（即LCP抗体）），30分钟后，细胞用0.1N的NaOH溶解，测量荧光。图7显示：在1：500的稀释度用脂立方相方法制备抗体该能显著抑制SGLT2的葡萄糖转运功能，而用纯化蛋白作为抗原免疫得到的抗体（蛋白抗体）没有明显抑制作用。
序列表
<110> 苏州因湃生物科技有限公司
<120> 一种多跨膜区整合膜蛋白抗体的制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 672
<212> PRT
<213> Homo sapiens (人)
<400> 1
Met Glu Glu His Thr Glu Ala Gly Ser Ala Pro Glu Met Gly Ala Gln
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ile Asp Asn Pro Ala Asp Ile Leu Val Ile Ala Ala Tyr
20 25 30
Phe Leu Leu Val Ile Gly Val Gly Leu Trp Ser Met Cys Arg Thr Asn
35 40 45
Arg Gly Thr Val Gly Gly Tyr Phe Leu Ala Gly Arg Ser Met Val Trp
50 55 60
Trp Pro Val Gly Ala Ser Leu Phe Ala Ser Asn Ile Gly Ser Gly His
65 70 75 80
Phe Val Gly Leu Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Gly Leu Ala Val Ala
85 90 95
Gly Phe Glu Trp Asn Ala Leu Phe Val Val Leu Leu Leu Gly Trp Leu
100 105 110
Phe Ala Pro Val Tyr Leu Thr Ala Gly Val Ile Thr Met Pro Gln Tyr
115 120 125
Leu Arg Lys Arg Phe Gly Gly Arg Arg Ile Arg Leu Tyr Leu Ser Val
130 135 140
Leu Ser Leu Phe Leu Tyr Ile Phe Thr Lys Ile Ser Val Asp Met Phe
145 150 155 160
Ser Gly Ala Val Phe Ile Gln Gln Ala Leu Gly Trp Asn Ile Tyr Ala
165 170 175
Ser Val Ile Ala Leu Leu Gly Ile Thr Met Ile Tyr Thr Val Thr Gly
180 185 190
Gly Leu Ala Ala Leu Met Tyr Thr Asp Thr Val Gln Thr Phe Val Ile
195 200 205
Leu Gly Gly Ala Cys Ile Leu Met Gly Tyr Ala Phe His Glu Val Gly
210 215 220
Gly Tyr Ser Gly Leu Phe Asp Lys Tyr Leu Gly Ala Ala Thr Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Glu Asp Pro Ala Val Gly Asn Ile Ser Ser Phe Cys Tyr
245 250 255
Arg Pro Arg Pro Asp Ser Tyr His Leu Leu Arg His Pro Val Thr Gly
260 265 270
Asp Leu Pro Trp Pro Ala Leu Leu Leu Gly Leu Thr Ile Val Ser Gly
275 280 285
Trp Tyr Trp Cys Ser Asp Gln Val Ile Val Gln Arg Cys Leu Ala Gly
290 295 300
Lys Ser Leu Thr His Ile Lys Ala Gly Cys Ile Leu Cys Gly Tyr Leu
305 310 315 320
Lys Leu Thr Pro Met Phe Leu Met Val Met Pro Gly Met Ile Ser Arg
325 330 335
Ile Leu Tyr Pro Asp Glu Val Ala Cys Val Val Pro Glu Val Cys Arg
340 345 350
Arg Val Cys Gly Thr Glu Val Gly Cys Ser Asn Ile Ala Tyr Pro Arg
355 360 365
Leu Val Val Lys Leu Met Pro Asn Gly Leu Arg Gly Leu Met Leu Ala
370 375 380
Val Met Leu Ala Ala Leu Met Ser Ser Leu Ala Ser Ile Phe Asn Ser
385 390 395 400
Ser Ser Thr Leu Phe Thr Met Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Arg Pro Arg
405 410 415
Ala Gly Asp Arg Glu Leu Leu Leu Val Gly Arg Leu Trp Val Val Phe
420 425 430
Ile Val Val Val Ser Val Ala Trp Leu Pro Val Val Gln Ala Ala Gln
435 440 445
Gly Gly Gln Leu Phe Asp Tyr Ile Gln Ala Val Ser Ser Tyr Leu Ala
450 455 460
Pro Pro Val Ser Ala Val Phe Val Leu Ala Leu Phe Val Pro Arg Val
465 470 475 480
Asn Glu Gln Gly Ala Phe Trp Gly Leu Ile Gly Gly Leu Leu Met Gly
485 490 495
Leu Ala Arg Leu Ile Pro Glu Phe Ser Phe Gly Ser Gly Ser Cys Val
500 505 510
Gln Pro Ser Ala Cys Pro Ala Phe Leu Cys Gly Val His Tyr Leu Tyr
515 520 525
Phe Ala Ile Val Leu Phe Phe Cys Ser Gly Leu Leu Thr Leu Thr Val
530 535 540
Ser Leu Cys Thr Ala Pro Ile Pro Arg Lys His Leu His Arg Leu Val
545 550 555 560
Phe Ser Leu Arg His Ser Lys Glu Glu Arg Glu Asp Leu Asp Ala Asp
565 570 575
Glu Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Val Gln Asn Gly Cys Pro Glu Ser
580 585 590
Ala Met Glu Met Asn Glu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ser Leu Phe Arg
595 600 605
Gln Cys Leu Leu Trp Phe Cys Gly Met Ser Arg Gly Gly Val Gly Ser
610 615 620
Pro Pro Pro Leu Thr Gln Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Leu
625 630 635 640
Glu Asp Ile Ser Glu Asp Pro Ser Trp Ala Arg Val Val Asn Leu Asn
645 650 655
Ala Leu Leu Met Met Ala Val Ala Val Phe Leu Trp Gly Phe Tyr Ala
660 665 670
<210> 2
<211> 2076
<212> DNA
<213> （rengongxulie）人工序列
<400> 2
atgcatcacc atcatcacca tcatcatcat catgattata aggacgatga cgacaaaggt 60
agtggggaaa atctatactt tcaaggttcc gccccggaga tgggggccca aaaagcactt 120
attgacaatc ctgcagacat attggttatt gccgcttatt ttcttttagt cataggtgtc 180
ggattatgga gcatgtgtag aaccaatagg ggaaccgtag gtggctactt cttagccgga 240
agatcaatgg tttggtggcc agtgggtgct tccctgttcg caagtaatat tggaagcggg 300
cattttgtcg gtttggccgg tactggtgca gcatccgggt tggcagttgc agggtttgaa 360
tggaacgcgt tatttgtagt cttgcttcta ggctggttat tcgcccctgt gtatttaact 420
gctggcgtaa taacgatgcc ccaatactta agaaaaaggt ttgggggtag gaggattaga 480
ttgtatttat ctgttttgag tctgtttctt tacatattca caaagatctc cgtcgatatg 540
ttctccggtg cagtattcat ccaacaagca ttgggttgga atatttatgc ctccgtaatt 600
gcactattag ggattactat gatatataca gtaactggtg gtttggctgc acttatgtat 660
accgacacag ttcaaacctt tgttatcctt ggcggtgcat gtattttgat gggatatgct 720
ttccatgaag ttggcggtta tagtggttta ttcgataaat acttaggtgc agcaacttca 780
ttaactgttt ctgaggatcc agcagttggt aatatttcat ccttttgcta cagaccaagg 840
ccggactcat atcacctact tagacatcca gttacaggtg atttgccttg gccagccttg 900
ctgcttggtt taacaatagt ttcaggctgg tactggtgct ctgaccaagt aatagttcag 960
cgttgtttag cgggaaaatc cttgacacat ataaaggctg ggtgtatcct atgtggttat 1020
ttaaagttga ctcctatgtt ccttatggtg atgcccggca tgataagtag gattctgtac 1080
ccagatgaag ttgcctgtgt tgttcccgag gtatgtagga gggtttgcgg tacagaagta 1140
ggatgctcta acatcgctta tccgagactg gtcgtaaagc tgatgccaaa tggactgaga 1200
ggtctaatgt tagccgtaat gcttgcggca ttgatgagta gtttggctag catcttcaat 1260
tcctcctcca cacttttcac tatggatata tatactcgtt tgcgtcccag agctggagat 1320
agggagctgt tattagtagg tagattatgg gttgtgttta tagttgttgt tagtgtcgcc 1380
tggctgcccg tagtccaagc tgcacaagga ggtcagctat tcgattacat acaggcagtt 1440
agcagttatt tagcgcctcc cgtcagtgct gtgtttgttt tggccttatt cgtaccccgt 1500
gtcaatgaac aaggcgcctt ttggggactg attggtggtc tgttgatggg attagcaaga 1560
ctaatccccg aattctcctt cgggtcaggt tcttgtgtgc agcctagtgc ctgtcccgct 1620
ttcttatgtg gagttcatta cctatacttc gctattgtgc tttttttctg cagtggttta 1680
actttaacag tctctttatg cactgctcca attccacgta agcatttaca tagactagtt 1740
ttttctctaa gacattcaaa agaagaaaga gaagatttag atgcggacga acaacaggga 1800
tcttcactac cagtacaaaa tggctgccca gaaagcgcaa tggaaatgaa cgaacctcaa 1860
gcaccagcgc catccctatt cagacaatgt ttattatggt tttgtggcat gtcaagaggt 1920
ggggttggat ccccgccccc attgactcaa gaagaagcag ccgcagctgc cagaagactt 1980
gaagacatta gtgaagatcc ttcttgggca agggttgtaa atttaaatgc tttattaatg 2040
atggccgttg ctgttttcct ttggggattc tatgct 2076
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> （rengongxulie）人工序列
<400> 3
Met His His His His His His His His His His Asp Tyr Lys Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Lys Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 91
<212> DNA
<213> （rengongxulie）人工序列
<400> 4
atgcatcacc atcatcacca tcatcatcat catgattata aggacgatga cgacaaaggt 60
agtggggaaa atctatactt tcaaggttcc g 91

Claims (15)

1.一种人工生物膜系统，其为含有膜蛋白的脂立方相，其特征在于：所述膜蛋白为钠葡萄糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的人工生物膜系统，其特征在于：所述钠葡萄糖蛋白为人钠葡萄糖蛋白。
3.根据权利要求2所述的人工生物膜系统，其特征在于：所述人钠葡萄糖蛋白为SGLT1或SGLT2。
4.根据权利要求3所述的人工生物膜系统，其特征在于：所述人钠葡萄糖蛋白为人SGLT2的氨基酸序列第10位到第672位组成的蛋白。
5.根据权利要求1所述的人工生物膜系统，其特征在于：所述脂立方相包括甘油酯和磷脂。
6.根据权利要求5所述的人工生物膜系统，其特征在于：所述脂立方相包括油酸甘油酯和磷脂A。
7.一种如权利要求1至6中任一项所述的人工生物膜系统的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）、根据钠葡萄糖蛋白的氨基酸序列设计合成适合酵母表达的DNA序列；
步骤（2）、将所述的DNA序列全基因合成到表达质粒中；
步骤（3）、将所述的表达质粒在酵母细胞中表达、分离、纯化得到合成的钠葡萄糖蛋白溶液；
步骤（4）、将所述的脂立方相的原料与步骤（3）合成的钠葡萄糖蛋白溶液混合形成所述的人工生物膜系统。
8.根据权利要求7所述的人工生物膜系统的制备方法，其特征在于：步骤（4）的具体实施方式为：将甘油酯融解，将步骤（3）得到的钠葡萄糖蛋白溶液和磷脂形成混合溶液，然后将融解后的甘油酯与所述的混合溶液按体积比为1~2.5:1进行混合形成所述的人工生物膜系统，其中，所述的混合溶液中所述的钠葡萄糖蛋白与所述的磷脂的质量比为15~25:1。
9.一种由如权利要求1至6中任一项所述的人工生物膜系统经破碎制成的微型颗粒。
10.一种免疫组合物，其特征在于：其包括如权利要求1至6中任一项所述的人工生物膜系统或如权利要求9所述的微型颗粒。
11.如权利要求1至6中任一项所述的人工生物膜系统或如权利要求9所述的微型颗粒作为免疫原的用途。
12.一种使用如权利要求1至6中任一项所述的人工生物膜系统、如权利要求9所述的微型颗粒或如权利要求10所述的免疫组合物经免疫获得的抗体。
13.一种如权利要求12所述的抗体的制备方法，其特征在于：使用如权利要求1至6中任一项所述的人工生物膜系统、如权利要求9所述的微型颗粒或如权利要求10所述的免疫组合物免疫动物，获得所述的抗体。
14.如权利要求12所述的抗体在制备用于预防和/或治疗糖尿病药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述的糖尿病为II型糖尿病。
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