CN107779440B - 一种葡萄球菌噬菌体及其在葡萄球菌感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葡萄球菌噬菌体及其在葡萄球菌感染中的的应用，具体公开了一种葡萄球菌噬菌体，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月27日，保藏编号为CGMCC No.14330。该噬菌体对葡萄球菌具有较强的裂解作用。该制剂可以单独或鸡尾酒使用，为葡萄球菌感染的治疗提供一种安全、无毒副及无残留作用的噬菌体产品来源。

Description

一种葡萄球菌噬菌体及其在葡萄球菌感染中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及到一株能够裂解葡萄球菌的噬菌体，利用该噬菌体在葡萄球菌感染中的应用。

背景技术

葡萄球菌是革兰氏阳性球菌。葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，菌体直径约0.8μm，小球形。根据生化反应和产生色素不同，葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌三种。其中金黄色葡萄球菌多为致病菌，表皮葡萄球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般不致病。

葡萄球菌感染鸡后能引起鸡葡萄球菌病，临床症状为急性败血症状、关节炎、皮肤坏死和雏鸡脐炎等。该病常年发生，在高温高湿环境中最易发病，雏鸡和中雏感染葡萄球菌后死亡率最高，是养鸡业中危害严重的疾病之一。奶牛感染葡萄球菌后表现为临床乳腺炎，通过产生毒素而导致乳腺炎，如果治疗不及时的话，很容易进一步诱发败血症或者是乳区的坏死，并最终导致患病牛的死亡，带来严重的经济损失。葡萄球菌感染可造成猪的急性、亚急性或慢性乳腺炎，坏死性葡萄球菌皮炎及乳房的脓疱病和渗出性皮炎，猪的渗出性皮炎又称仔猪油皮病，是最常见的葡萄球菌感染。羊葡萄球菌病一般表现为毛囊炎、皮下脓肿、脱毛或乳腺炎等，经消化道感染可引起食物中毒和胃肠炎，经呼吸道感染可引起气管炎、肺炎。葡萄球菌也是人类化脓性感染的主要病原菌，可引起细菌性食物中毒、肺炎、心包炎和脑膜炎，甚至败血症、脓毒血症等全身感染。

葡萄球菌是一种普遍存在于自然界中的革兰氏阳性条件致病菌，对畜牧业危害较大，由于畜禽养殖中抗生素的滥用，使得葡萄球菌多重耐药性问题日趋严重。以往抗生素是治疗此菌感染较有效的药物，但近年来萄球菌的耐药性越来越强，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的产生，又给临床治疗带来很大的困难。随着人们对新型抗菌药物的迫切需求，噬菌体治疗重新得到人们的关注。

发明内容

为了解决治疗葡萄球菌感染的问题，同时为了避免使用抗生素耐药，本发明提供一株葡萄球菌噬菌体，对引起皮肤感染的葡萄球菌具有较强的裂解作用，该制剂可以单独或鸡尾酒使用，为葡萄球菌感染的治疗提供一种安全、无毒副及无残留作用的噬菌体产品来源。

本发明一个方面提供了一种葡萄球菌噬菌体，保藏号为CGMCC No.14330。

本发明的葡萄球菌噬菌体于2017年7月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.14330，分类命名为噬菌体。

本发明另一个方面提供了本发明所述的葡萄球菌噬菌体在制备治疗或预防葡萄球菌感染的药物中的用途。

在本发明中，所述的葡萄球菌感染的疾病选自鸡葡萄球菌病、奶牛乳房炎、猪子宫内膜炎、猪坏死性葡萄球菌皮炎、猪脓疱病和猪渗出性皮炎、羊毛囊炎、羊皮下脓肿、羊乳腺炎。

本发明另一个方面提供了一种本发明所述的葡萄球菌噬菌体在治疗或预防葡萄球菌感染中的应用，其特征在于，利用纯化好的噬菌体喷洒于受试者体表，葡萄球菌噬菌体的效价≥10⁸PFU/mL。

本发明另一个方面提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的葡萄球菌噬菌体。

在本发明的具体技术方案中，所述的药物组合物中还包含药学上可接受的载体。

在本发明的具体技术方案中，所述的药物组合物的药物制剂形式为经皮给药剂型、口服给药剂型或肠外给药剂型。

所述的外用给药剂型为凝胶剂、溶液剂、洗剂、霜剂、软膏剂和贴剂。

在本发明的具体技术方案中，所述的药物组合物中还包含至少一种治疗葡萄球菌感染中的活性成分。

在本发明的技术方案中，所述治疗葡萄球菌感染的活性成分选自其他种类葡萄球菌噬菌体。

本发明另一个方面提供了一种饲料组合物，其包含本发明所述的葡萄球菌噬菌体。

本发明再一个方面提供了一种清洁组合物，其包含本发明所述的葡萄球菌噬菌体。

所述清洁组合物可以用于家畜饲养场所的消毒。

本发明中以葡萄球菌为宿主，分离到1株葡萄球菌裂解性噬菌体，一步生长曲线发现，其潜伏期、裂解期分别约为30min及200min；对50株葡萄球菌中的36个菌株具有裂解作用，有较宽的裂解谱；对小鼠灌服无毒副作用；经体表喷洒的方式，与抗生素组对照组相比，试验组能够明显改善猪体表的皮肤，而且不影响猪的正常生长；葡萄球菌噬菌体的效价≥10⁸PFU/mL，连用5d，可以有效治疗猪的皮肤感染。

本文所使用的术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文所使用的术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。

可以通过包被或喷射将本发明的预防性或治疗性组合物局部施用于受影响的区域。

可选择地，可以通过外用、口服或肠胃外途径给予本发明的组合物。可用肠胃外途径为静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、皮下给药或外用给药。

根据包括剂型，给药方式，待治疗的患者或动物的年龄、体重、性别、状态和饮食，给药时间，给药途径，排泄速率以及应答敏感度的多种因素，当施用、喷射或给予时，本发明组合物的合适剂量可以不同。本领域技术人员显而易见的是，当给予患者药物组合物时，主治医生或兽医通过适当的医学判断可以确定合适的单日总剂量。

本发明组合物的口服剂型可以采用片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、水悬液或乳悬液、散剂或粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂的形式。诸如片剂和胶囊的口服剂量形式可以包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰延胡索酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊，还可以进一步使用诸如脂质的液体载体。

对于非口服给药，可以将本发明的组合物配制成用于经皮下、静脉内或肌内途径施用的注射剂，配制成栓剂，或经呼吸道施用的喷雾吸入剂，例如气雾剂。可以通过将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂一起溶解或悬浮在水中，并将所述溶液或悬浮液分装在安瓿或单位小瓶中来制备注射剂形式。对于喷剂，例如气雾剂，可以将用于喷射水分散浓缩物或湿粉末的推进剂与添加剂组合使用。

本文所使用的术语“抗生素”是指可给予动物以杀灭细菌或抑制细菌生长的物质或化合物，并且意图包括防腐剂、杀菌剂和抗菌剂。所述动物在本发明中主要是指猪，或者其他有可能被仔猪渗出性皮炎危害的物种。归因于比传统抗生素具有更高的葡萄球菌特异性，本发明的噬菌体可以杀灭特定病原体而不影响益生菌。此外，本发明的噬菌体不诱导药物抗性，使其作为具有长生命周期的新型抗生素来提供。

可以将本发明的药物组合物以药物制剂的形式给予动物，例如皮肤制剂或者可以作为与动物饲料或饮用水的混合物被动物摄取，且优选作为外用制剂形式给药。在本发明中，所述动物包括猪、鸡、家禽、牲畜和人，但并不限于此。

只要能到达靶组织，本发明药物组合物的给药可以采用任何途径，外用、口服或肠胃外，具体而言，可以经由皮肤、口服、经直肠、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鼻内和吸入途径来给予本发明的组合物。

本发明的治疗疾病的方法包括给予治疗有效量的本发明组合物。对于本领域技术人员显而易见的是，主治医生或兽医通过适当的医学判断可以确定单日总剂量。对于指定患者来说，治疗有效量可能根据医学领域熟知的各种因素而变化，包括要获得的应答的种类和程度，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食，给药时间和途径，组合物的分泌率，治疗时间周期，根据是否使用其它试剂的具体组合物等。

本发明的葡萄球菌噬菌体，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年7月27日，保藏编号为CGMCC No.14330。

有益效果

1、本发明首次将噬菌体应用于猪体外葡萄球菌引起的渗出性皮炎的治疗和预防。

2、本发明分离得到葡萄球菌噬菌体具有宽宿主谱的。

3、本发明利用噬菌体治疗不仅可以提高养殖的经济效益，而且可以减少由于抗生素治疗引起的耐药菌株出现的频率。

附图说明

图1为噬菌体的电镜图片。

图2为噬菌体的热稳定性。

图3为噬菌体的pH值稳定性。

图4为噬菌体的一步生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不是用来限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1噬菌体的筛选与纯化

1、葡萄球菌的复苏培养

挑取葡萄球菌的菌液，在普通琼脂平板上划线，分离单菌落，37℃的恒温培养箱中培养16-24h。

2、制备葡萄球菌增殖液

挑取单菌落，接种于5mL的LB肉汤试管中，37℃，170rpm振荡培养过夜，得到增殖液。

3、样品的采集及处理

取猪场的污水及皮毛，利用营养肉汤进行浸泡，37℃孵育过夜，取出5mL的液体，10000r/min离心10min，上清液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体原液，置于4℃保存。

4、噬菌体的分离

利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液10倍比稀释，分别取100μL稀释液与200μL相应的葡萄球菌混合，37℃孵育10min，置于50℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)混合，均匀的铺在下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，冷却后37℃倒置培养过夜。次日，观察噬菌斑情况，挑取单个噬菌斑，重复纯化3次，得到单一的噬菌体，将该噬菌体命名为SA1。

5、噬菌体的扩增

挑取单个噬菌斑置于1mL的LB肉汤中，置于40℃水浴锅中孵育30min，得到噬菌体浸出液。挑取葡萄球菌单个菌落，接种于5mL液体LB培养基中，37℃，170rpm振荡培养过夜；取200μL噬菌体浸出液与200μL宿主菌增殖液于5mL液体LB培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，10000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。实施例2噬菌体的生物学特性

1、噬菌体的电镜观察

取超速离心提纯的噬菌体悬液滴于覆有聚乙烯甲醛膜的铜网上少许，以2％磷钨酸染色5-10min，将铜网放于干燥滤纸上，自然干燥，利用日立HT7700型透射电子显微镜观察。

噬菌体SA1通过透射电镜观察，其形态如图1所示。该噬菌体头部呈多面体结构，有细长的尾部，噬菌体头部长径约160nm，横径约100nm，尾部约160nm。根据噬菌体分类，本研究噬菌体形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。

2、温度及pH对噬菌体SA1的影响

各取100μL噬菌体SA1增殖液(效价为2.3×10⁹pfu/mL)分装于无菌EP管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和60min。每一温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，通过10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体SA1热稳定性曲线。

于无菌试管加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的LB肉汤4.5mL，然后将上述试管置于37℃的水浴锅中，待温度平衡后各加入500μL噬菌体增殖液混匀后，37℃水浴作用1h、2h和3h。每管样品采用双层平板法测定噬菌体效价，并且每个pH值设定2个重复。以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体pH值稳定性曲线。

热稳定性结果发现(图2)，噬菌体SA1在40℃和50℃作用1h后依然保持较高活性，在60℃作用1h后效价下降5个梯度，在70℃及80℃时完全失活。说明本发明噬菌体的热稳定性较好，能够满足在饲料或药物中使用的需要。

如图3所示，噬菌体SA1在pH4-11范围内1h后保持原有效价；在pH3-12范围内作用3h后均有活性，在pH5-10噬菌体更稳定，在pH为7时作用3h后效价基本保持不变，稳定性最好。

3、噬菌体的一步生长曲线

将感染复数为0.1的噬菌体SA1增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时)，37℃温育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1mL LB肉汤洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的LB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μL，10000g离心1min，吸取100μL的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体SA1的潜伏期、爆发期。

通过图4噬菌体SA1一步生长曲线发现，噬菌体感染宿主菌后，在30min内效价基本没变化甚至有所下降，表明噬菌体SA1潜伏期约为30min，噬菌体侵染宿主菌后的30-230min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体SA1的爆发期约为200min，在随后的20min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。

4、噬菌体裂解谱的测定

采用单斑法法测定噬菌体的裂解谱：取1mL新鲜噬菌体SA1增殖液，10000rpm离心10min沉降细菌碎片。初步选择噬菌体原液进行试验。分别挑取实验室保存的50株葡萄球菌的单菌落分别接种于5mL营养肉汤中，37℃，170rpm培养12h，得到各株细菌菌液，取100μL细菌菌液分别均匀涂布在普通琼脂平板上，待干燥后，分别取1μL噬菌体增殖液滴于平板的不同位置上，加样时，各种噬菌体增殖液间不能有接触，以免影响试验结果，待自然干燥后37℃培养8-12h，观察结果。

通过裂解谱测定实验发现，噬菌体SA1对50株葡萄球菌中的36个菌株具有裂解作用，有较宽的裂解谱。

实施例3噬菌体的安全性试验

选择20只18-20g初成年的昆明小鼠(雌雄各半)，随机分成实验组和空白对照组(每组雌雄各半)，利用灌服的方式，分别灌服噬菌体裂解液10⁹PFU/mL和肉汤0.2mL，连续灌服5d，观察小鼠的行为表现及其生长情况。

结果发现噬菌体组和对照组小鼠生长情况一致，无不良反应，从而确定噬菌体SA1安全无毒副作用。

实施例4噬菌体的模型治疗试验

选择2只健康的20日龄的仔猪，雌雄各一头，利用0.25％-0.5％的普鲁卡因进行局部浸润麻醉，利用16mm的切割器进行切割至深筋膜，脊柱左右各4个切口，剪去切口内的组织形成全面皮肤缺损创面，止血。创面形成30min后，进行攻菌，每个创面接种10⁹CFU/mL的金黄色葡萄球菌ATCC29213 0.1mL，对创面利用无菌纱布进行包扎；脊柱左侧作为噬菌体组，右侧作为对照组，噬菌体组每日创面进行接种10⁸PFU/mL的SA1 0.1mL，对照组接种等量的无菌生理盐水，连续5d。

停用10d后进行观察，结果发现噬菌体组创面局部出现黑色结痂，对照组边缘红肿，创面有脓性分泌物；停用20d后进行观察，发现噬菌体组创面全部形成黑色结痂将创面覆盖，对照组创面小范围形成结痂但仍有脓性分泌物渗出。

实施例5噬菌体的体外治疗试验

从临床收集到15头15-20日龄的渗出性皮炎猪，试验随机分成三组，每组5头，噬菌体组每只均匀喷洒5-10mLSAI(效价为10⁸PFU/mL)在患病猪只皮肤上，连用5d；抗生素组利用盐酸林可霉素注射液(0.033mL/kg)进行肌肉注射治疗，连续注射5d；对照组不进行处理。

停药10d后进行观察，结果发现噬菌体组患病猪只100％皮肤出现结痂；抗生素组患病猪只60％皮炎症状有所减轻，其余40％皮炎症状没有减轻；对照组患病猪只60％死亡，其余40％皮炎症状没有减轻。

停药20d后进行观察，结果发现噬菌体组患病猪只100％皮肤全部痊愈；抗生素组患病猪只60％皮肤全部痊愈，20％患病猪只死亡，20％猪只生长缓慢成为僵猪；对照组患病猪只100％死亡。通过猪只生长状况统计发现，噬菌体组优于抗生素组。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一株葡萄球菌噬菌体，其保藏号为CGMCC No.14330。

2.一种如权利要求1所述的噬菌体在制备治疗或预防葡萄球菌感染的疾病的药物中的用途，其中，所述的葡萄球菌为ATCC29213葡萄球菌，所述感染的疾病为皮肤感染。

3.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，所述的药物组合物中还包含药学上可接受的载体。

5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，所述的药物组合物的药物制剂形式为外用给药剂型，所述外用给药剂型选自凝胶剂、溶液剂、洗剂、霜剂、软膏剂和贴剂。

6.根据权利要求3-4任一项所述的药物组合物，所述的药物组合物中还包含至少一种治疗葡萄球菌感染疾病的活性成分；所述治疗葡萄球菌感染疾病的活性成分选自其他种类葡萄球菌噬菌体。

7.根据权利要求3-4任一项所述的药物组合物，所述的药物组合物中权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体的效价≥10⁸PFU/mL。

8.一种用于预防葡萄球菌感染的清洁组合物，其包含权利要求1所述的葡萄球菌噬菌体。