CN1076398C - 溶血磷脂酰胆碱的制造方法 - Google Patents

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Abstract

这项发明提供制造溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括利用磷脂酶A2促进磷脂酰胆碱和制剂的混合物的水解。本发明还揭示了制造溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体的方法。

Description

溶血磷脂酰胆碱的制造方法
本发明所属技术领域
这项发明涉及磷脂水解领域。具体地说，本发明涉及利用磷脂酶A2促进磷脂酰胆碱的水解来生产溶血磷脂酰胆碱的改进方法。这项发明还涉及制造包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基质的方法。
本发明的技术背景
早在二十世纪初人们就已经知道磷脂酰胆碱可以借助酶催水解转化成溶血磷脂酰胆碱。借助蛇毒提取物使卵磷脂(磷脂酰胆碱)降解的早期研究结果已经证明蛇毒的溶血作用发生在细胞膜的卵磷脂部分。1935年，Hughes用实验证明卵磷脂转化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰胆碱)的单分子膜水解与诸如pH值、温度和卵磷脂分子的表面浓度等因素有关。在单分子层中卵磷脂分子填充物大大降低了水解速度。Hanahan证明在鸡蛋卵磷脂与磷脂酶A2之间的醚溶性络合物导致释放不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。采用95％的乙醇、氯仿或石油醚作溶剂时，不能察觉磷脂酶A2对磷脂酰胆碱的水解作用。在1963年的报告中，Dawson完成的实验也发现了磷脂酶A2将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱和脂肪酸分子。Dawson曾确定酶的活性与钙离子存在与否有关，并且添加醚或丁醇将激发磷脂酶的活性。授权给Unilever Ltd.的英国专利第1,215,868号介绍了进一步方案改进，即在有脂肪(油)存在的条件下进行有磷脂酶A2参与的磷脂的水解反应。
现有技术中揭示的磷脂酰胆碱水解方法由于存在某些缺点受到损害，其中包括水解不完全和在水解反应中产生不需要的副产物。现有方法的缺点是严重的，因为存在未反应的原始物质或不需要的副产物表示在反应的终产物中污染物的含量是不可接受的。为了获得需要的产品(即溶血磷脂酰胆碱)必须从反应产物中除掉这些不需要的成分，因此必须增补纯化步骤。
采用上述的现有方法，溶血磷脂酰胆碱的最大得率近似为磷脂酰胆碱原始物质的70％。Dawson的工作表明为了在磷脂酰胆碱水解中激发磷脂酶A2的活性，使最大得率达到大约60至70％，需要添加醚。采用包含8vol.％(体积百分比，下同)二乙基醚的水缓冲液作为反应介质将获得溶血磷脂酰胆碱的最大得率，采用这种反应介质看到的是两相体系。Dawson还发现为了提高溶血磷脂酰胆碱的得率可以在反应介质中用6vol.％的丁醇代替二乙基醚，而乙醇和甲基异丁基己烷对增强磷脂酰胆碱的水解是无效的。Dawson的结论是醚(或丁醇)对磷脂酰胆碱水解的促进作用可能是由于密集地填充在脂界面的定向的磷脂酰胆碱分子的表面稀释作用和从界面除去抑制性的脂肪酸的羰基的结果。添加脂肪酸抑制磷脂酰胆碱的酶解，这个证据支持Dawson的结论。添加脂肪酸使反应受到抑制的原因它抑制从界面除去脂肪酸，或使钙离子与脂肪酸形成螯合物，即除去了维持磷脂酶A2活性所需的钙离子(Ca+2)。Dawson认为除去钙离子是更可信的解释，因为进一步添加醚将形成两相并增加脂肪酸的溶解性，但不促进磷脂酰胆碱的水解；反之钙的浓度增加9倍将部分地减缓抑制作用。这还表明，眼镜蛇毒经纯化得到的酶(磷脂酶A2)在水解中的活性取决于钙离子的存在。在水解反应中磷脂酶A2对钙离子的需求以及钙离子与磷脂酰胆碱水解释放的脂肪酸的联系在技术上是已知的(Novo Nordisk)。
本发明人以前发明过多种方法，这些方法适合制备脂类混合颗粒，这些颗粒在传送药物和提供易于吸收的卡路里方面是有用的(参阅美国专利第4,874,795号和第5,314,921号)。这些方法涉及使溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸按指定的摩尔比混合。尽管这些早期的方法容易完成，但是它们都采用价格昂贵的经离析获得的高纯度的溶血磷脂酰胆碱，因此增加了脂类混合颗粒终产品的成本。
由于现有技术有上述的缺点，所以需要提出更有效地将磷脂酰胆碱转化成溶血磷脂酰胆碱的方法。该方法将更有效地利用磷脂酰胆碱，并且使反应终产物中不需要的副产物(如甘油磷酰胆碱)和污染物(如未水解的磷脂酰胆碱)更少。采用新方法将获得纯度更高的终产物，从而由于对终产物的纯化要求降低导致大幅度地降低成本和节约工时。此外，还需要简化的方法，该方法将适合生产包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类混合颗粒。用磷脂酰胆碱作原始物质将减少使用纯化的溶血磷脂酰胆碱的需求，因此将降低制造脂类混合颗粒终产品的总成本。
本发明概述
本发明的第一个目标是提供一种比现有方法更有效的方法制造溶血磷脂酰胆碱。例如，采用现有方法制造溶血磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱原始物质的转化效率不超过60-70％。本发明在优先的实施方案中提供一种方法，利用该方法磷脂酰胆碱转化成溶血磷脂酰胆碱的效率可以接近100％。此外，按照本发明磷脂酰胆碱水解产生的不需要的副产物即使有也是少量的。借助磷脂酰胆碱以接近100％的效率转化，本发明还提供一种降低了生产成本的溶血磷脂酰胆碱的生产方法。
本发明涉及改进磷脂酰胆碱的酶催水解。按照本发明某些制剂将与磷脂酰胆碱合并，借此提高磷脂酰胆碱酶催水解生成溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的效率，该效率将高于不添加这类制剂的磷脂酰胆碱的水解反应的效率。因此，本发明提供了制造溶血磷脂酰胆碱的改进方法。它还提供了制造包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的组合物的改进方法。这些改进方法涉及磷脂酰胆碱和制剂的水分散体的酶催水解，其中所述制剂将增强磷脂酰胆碱的水解。为了提供生物学优选的溶血磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱的水解酶将优选从磷脂酰胆碱的2-位摘除脂肪酸的酶(如磷脂酶A2)。
按照本发明的第一方面，提供了生产溶血磷脂酰胆碱的方法。制剂和磷脂酰胆碱与水合并，使制剂与磷脂酰胆碱的混合物在水中形成水分散体。优先在有钙离子存在的条件下，让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，以形成反应混合物。该制剂可以是单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油。在某些实施方案中，混合物中的磷脂酰胆碱的含量低于混合物总量的大约40wt％(重量百分比，下同)，而且优先是混合物总量的大约30wt％。在某些实施方案中，该方法进一步包括回收在反应混合物中形成的溶血磷脂酰胆碱。回收溶血磷脂酰胆碱优先包括使溶血磷脂酰胆碱与反应混合物成分分离，这些成分选自包括脂肪酸、制剂、或脂肪酸和制剂的一组成分。在特别优先的实施方案中，后继的分离包括用丙酮萃取。因此，本发明包括使溶血磷脂酰胆碱与上述各种成分分离的方法，以致基本纯净的终产物不需要进一步纯化就可以使用。在上述的任何实施方案中，制剂优先是单酸甘油酯，更优先的是单酸甘油酯所包含的酰基具有8至22个碳原子。
按照本发明的第二方面，在制造溶血磷脂酰胆碱的方法中，制剂、磷脂酰胆碱和有机溶剂与水合并，使制剂和磷脂酰胆碱混合物在水中形成包含有机溶剂的水分散体。优先在有钙离子存在的条件下，让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，以形成反应混合物。该制剂可以是单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油。在优先的实施方案中，有机溶剂是叔丁醇。在补充实施方案中，有机溶剂可以是二乙基醚、二乙基醚与乙醇的混合物(优先的是乙醇大约占有机溶剂总量的4％)、叔丁醇与乙醇的混合物(优先的是乙醇大约占有机溶剂总量的4％)、或者甲基异丁基酮。
按照本发明的第三方面，在制造溶血磷脂酰胆碱的方法中，制剂和磷脂酰胆碱与水合并，在水中形成水分散体。让水分散体与磷脂酶A2接触，以形成反应混合物，在反应混合物中制剂以能够有效地增强磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化的剂量存在，与没有该制剂的反应混合物相比有效的增强了磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化。优先的是该制剂的剂量使转化效率增加到80％或更高，更优先的是使转化效率达到90％或更高，更进一步优先的是达到95％或更高，最优先的是达到99％或更高。该制剂优先从包括单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一组制剂中选定。
尽管实际上优先的制剂(即单酸甘油酯)以任何剂量都能增强由磷脂酶A2催化的磷脂酰胆碱的水解，但是按照本发明的第四方面，在制造溶血磷脂酰胆碱的方法中磷脂酰胆碱与单酸甘油酯的摩尔比从大约1∶1至大约1∶5。优先的是磷脂酰胆碱与单酸甘油酯的摩尔比大约为1∶3。按照本发明的这些实施方案，磷脂酰胆碱的水解效率接近100％。
实际上任何单酸甘油酯对于增强磷脂酶A2催化的磷脂酰胆碱水解都是有用的。但是，依据优先的实施方案，在本发明中有用的单酸甘油酯可以包含一个酰基，该酰基包括8至22个碳原子。优先的是单酸甘油酯的酰基具有1至4个不饱和键，即碳-碳双键。因此，优先的是混合物中的单酸甘油酯包括一个酰基，该酰基是从包括具有一个不饱和键的酰基、具有两个不饱和键的酰基、具有三个不饱和键的酰基和具有四个不饱和键的酰基的一组酰基中选出的。最优先的是在混合物中50％以上的单酸甘油酯包括从上述的那组具有一个、两个、三个或四个不饱和键的酰基中选定的酰基。因此，按照本发明，为了使磷脂酰胆碱有效的水解，选定具体的单酸甘油酯时依据的是单酸甘油酯分子使磷脂酰胆碱分子分开进行有效水解的能力，并且可以进一步依据在反应的终产品(如下述的脂类基体组合物)中可能需要的酰基的长度和不饱和度。
按照本发明的第五方面，提供了制造包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体组合物的方法。让磷脂酰胆碱和单酸甘油酯与磷脂酶A2接触，并且借助诸如除水之类的方法回收最终的脂类络合物。如果需要，可以将单酸甘油酯和/或脂肪酸添加到该脂类络合物中，以获得优先选择的摩尔比。在一个优先的实施方案中，脂类络合物中溶血磷脂酰胆碱与另两种成分之和(即单酸甘油酯与脂肪酸之和)的摩尔比介于大约1∶4至1∶12之间。更优先的是溶血磷脂酰胆碱与与另两种成分之和(即单酸甘油酯与脂肪酸之和)的摩尔比介于大约1∶5至1∶6之间。在另一个优先的实施方案中，脂类络合物各种成分的摩尔比介于1∶4∶2至1∶2∶4之间(溶血磷脂酰胆碱∶单酸甘油酯∶脂肪酸)。最优先的是脂类络合物由溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸组成，这些成分的摩尔比为1∶4∶2、1∶3∶3或1∶3∶2(溶血磷脂酰胆碱∶单酸甘油酯∶脂肪酸)。在补充实施方案中，制造包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体的方法可以包括使用来源于天然的甘油三酯的单酸甘油酯。
按照本发明的第六方面，在制造溶血磷脂酰胆碱的方法中制剂与磷脂酰胆碱合并，形成制剂与磷脂酰胆碱的混合物。其中制剂可以是单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油。将该混合物与水合并，在水中形成该混合物的水分散体，该分散体优先在有钙离子存在的条件下与磷脂酶A2接触，以形成反应混合物。然后，回收溶血磷脂酰胆碱。
尽管不希望受任何发明理论的束缚，但是发明人认为按照本发明的方法在磷脂酰胆碱/制剂/水向溶血磷脂酰胆碱/制剂/脂肪酸/水转化的酶催水解期间，保持着Small介绍的磷脂酰胆碱/制剂/水的层状结构(J.Am.Oil Chemists’Soc.，45∶108-109，1968)。借助提供一组保持该层状结构的反应条件，使磷脂酰胆碱分子在反应进程中始终保持与磷脂酶A2接触，从而使水解反应效率得到提高。
本发明的这些方面和目标以及其它方面和目标将结合本发明的详细说明进一步详细介绍。
附图的简要说明
图1描述不添加甘油一油酸酯的磷脂酰胆碱水解混合物的组成随时间的变化。
图2描述以1∶3的摩尔比添加甘油一油酸酯的磷脂酰胆碱水解混合物的组成随时间的变化。
本发明的详细叙述
本发明是一种制造溶血磷脂酰胆碱的改进方法，该方法包括使磷脂酰胆碱和制剂与磷脂酶A2接触。磷脂酶A2是优先的，因为借助磷脂酰胆碱在2-位水解生产的溶血磷脂酰胆碱是优先生物学优选的溶血磷脂酰胆碱(与借助磷脂酰胆碱在1-位水解生产的溶血磷脂酰胆碱恰好相反)。由此形成的溶血磷脂酰胆碱可以非必选地与添加的制剂和(或)由于磷脂酶A2对磷脂酰胆碱的作用释放的脂肪酸分开。这种方法使磷脂酰胆碱只需一步就基本上完全水解，形成溶血磷脂酰胆碱。如果需要，制剂可以是单酸甘油酯，而且由此获得的溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体可以与磷脂酶A2、微量的未反应的磷脂酰胆碱、水、有机溶剂、以及在反应混合物中存在的任何杂质分开。
本方法的起始物质是磷脂酰胆碱，即一种包括亲水的胆碱极性首基和与磷酸酯和丙三醇链接的组成两个脂肪酸分子的疏水的非极性尾基的磷脂。磷脂酰胆碱可以有特殊脂肪酸基团，也可以是有各种各样的与首基链接的脂肪酸基团的磷脂酰胆碱的混合物。例如，Phospholipon80(American Lecithin，Oxford，CT)就是有各种各样脂肪酸酰基与极性首基链接的磷脂酰胆碱分子的混合物。
就象在这里揭示的那样，磷脂酰胆碱与制剂以及其它非必选的参与反应的成分的混合物可以通过合并这些成分来制备。术语“混合物”仅仅表示这些成分彼此接触。例如，混合物可以是磷脂酰胆碱和制剂的胶态混合物；在与水或其它含水溶剂合并时，可以说磷脂酰胆碱和制剂的混合物胶体被分散在水中。混合物还可以不作为微粒分散在水中，而是作为较大的胶态的或非胶态的络合物分散在水中。尽管本发明不受分层结构理论的限制，但是我们认为磷脂酰胆碱和制剂形成双层或多层结构。因此，只要该混合物在磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化中能增强磷脂酶A2的活性，本发明可以包括物理形态或结构不同的混合物。
在本发明的方法中，将制剂和磷脂酰胆碱与水合并，以形成磷脂酰胆碱和制剂的混合物的水分散体，随后让该分散体在允许磷脂酰胆碱分子水解的条件下与磷脂酶A2接触。我们认为磷脂酰胆碱在水中或在任何实际的含水溶剂中将形成分散体。换言之，在这里使用的“水”是泛指与磷脂酰胆碱和制剂的混合物形成的分散体相容的水或其它含水缓冲液。如上所述，我们认为这种分散体包含层状结构(双层或多层)，而且磷脂酰胆碱的极性首基朝双层或多层结构的外侧取向。我们进一步认为，磷脂酰胆碱在与本发明的制剂混合并加热时仍将在水性溶剂中形成分散体并且保持类似的层状结构。我们认为添加制剂可以达到几个目的。第一，我们认为制剂的分子将磷脂酰胆碱的分子分开，使磷脂酰胆碱更频繁地被磷脂酶A2接触，从而使磷脂酰胆碱完全转化成溶血磷脂酰胆碱。第二，我们认为添加制剂可以在水解反应期间保持层状结构。第三，我们认为添加制剂可以保持两层磷脂酰胆碱的流动性，从而增强磷脂酶A2的酶催水解。因此，任何具有一种或多种上述特征的制剂都适合添加到磷脂酰胆碱中，以利于磷脂酶A2的酶催水解。优先的是从包括单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油的一组制剂中选定该制剂。最优先选择单酸甘油酯。
单酸甘油酯是由与脂肪酸酰基链接的甘油首基组成的。在本发明中有用的单酸甘油酯的酰基优先包含8至22个碳原子。单酸甘油酯的酰基可以是饱和的，也可以是不饱和的，优先的是在碳链中有1至4个双键。添加的单酸甘油酯可以是高纯度的，也可以是原始形态的，这取决于用户的要求和反应混合物对杂质的允许程度。在本发明中有用的单酸甘油酯可以是酰基的大小和饱和状态各不相同的单酸甘油酯分子的混合物，也可以只有一种类型的酰基，如甘油一油酸酯、甘油一棕榈酸酯。在本发明中有用的单酸甘油酯的实例包括DimodanTM LSK和DimodanTM OK(Danisco IngrdientsUSA，Inc.，New Century，KS)。
在本发明的方法中也可用甘油二酯增强受磷脂酶A2催化的磷脂酰胆碱水解。甘油二酯的分子由与两个脂肪酸的酰基相连的甘油首基组成。与单酸甘油酯的酰基相同，甘油二酯的酰基的碳链优先具有8至22个碳原子和1至4个不饱和键。与单酸甘油酯一样，在本发明中有用的甘油二酯的酰基特征、纯度和混合物取决于各用户的要求。只要能增强磷脂酰胆碱的水解，任何类型的甘油二酯或它们的组合都是可用于本发明的。
其它制剂，例如聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油，也可以借助使磷脂酰胆碱分子分开、保持分层结构和流动性来增强磷脂酰胆碱的水解。这些化合物在美国专利第4,849,132号中已有描述。聚脂肪酸甘油酯由脂肪酸的单酯、二酯或聚酯与4至12个聚合的丙三醇分子组成。脱水山梨糖醇脂肪酸酯由脂肪酸的单酯、二酯或聚酯与山梨糖醇、脱水山梨糖醇和山梨糖醇酐组成。蔗糖脂肪酸酯的分子由脂肪酸的单酯、二酯或聚酯与蔗糖组成。与单酸甘油酯的酰基相同，在聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯中脂肪酸中的酰基碳链优先具有8至22个碳原子和1至4个不饱和键。如上所述，在本发明中有用的制剂的酰基特征、纯度和混合物取决于各用户的要求。
任何能增强磷脂酰胆碱水解的单一制剂或不同制剂的混合物都被看作是对本发明有用的的制剂。上述的制剂可以通过各种商业渠道购买。
借助磷脂酶A2的作用磷脂酰胆碱被水解成溶血磷脂酰胆碱，其中酶的作用是割断将脂肪酸基团与磷脂酰胆碱的首基中丙三醇的2-位链接起来的酯键。通过各种渠道购买的磷脂酶A2可以提纯后再用，也可以直接使用(例如LecitaseTM 10L，Novo Nordisk，Denmark)。为了使磷脂酶A2获得充足的活性，磷脂酶A2需要在反应混合物中有Ca+2离子。尽管在市售的磷脂酶A2制剂中通常都有少量的Ca+2离子，使磷脂酶A2具有活性，但是优先的是将Ca+2离子添加到反应混合物中，以获得充足的活性。应当注意，由于Ca+2离子与磷脂酰胆碱水解期间释放的脂肪酸的酸基形成离子键，钙离子会从反应混合物中消失。所以，优先的是将足够的Ca+2离子添加到反应混合物中，以保持磷脂酶A2有充足的活性。在本发明中，最优先的是由用户增补钙离子的浓度，以保证钙离子与磷脂酰胆碱的摩尔比至少达到1∶1。
本领域的技术人员都可以认识到的是，为了保持磷脂酶A2具有充足的活性可以用其它离子代替Ca+2离子。尽管不是所有的离子都能代替这个反应中的Ca+2离子，但是本领域的技术人员很容易通过试验确定适合保持磷脂酶A2活性的离子的具体类型和浓度。
如上所述，制造溶血磷脂酰胆碱的方法包括使磷脂酰胆碱和制剂的化合物的水分散体与磷脂酶A2接触。我们认为反应混合物的含水性有利于磷脂酰胆碱分子中极性部分的取向，以致形成分层结构。就借助磷脂酶A2使磷脂酰胆碱有效的转化成溶血磷脂酰胆碱而言，我们认为分层结构是优先的。所以，如果某种无水的混合物能使磷脂酰胆碱和制剂的分子在分层结构中精确取向，如果磷脂酶A2的酶催水解特性可以保留下来，那么磷脂酰胆碱和制剂的无水混合物也能在本发明的方法中使用。
其它的反应条件，如pH值、时间和温度等都可以变化，以使磷脂酰胆碱的水解达到最佳状态。例如，适合磷脂酶A2的最佳pH值为8-9，为了保持最大的酶活性就应当维持这个值。在反应进程中伴随着磷脂酰胆碱水解将释放出脂肪酸，反应混合物的pH值会发生变化。这种变化要求补充碱来维持pH值在8至9的范围内。任何能够将pH值提高到最佳范围的碱在不妨碍磷脂酰胆碱水解的前提下都可以使用。本申请人为此目的已成功地使用过氢氧化钠水溶液，但是其它的氢氧化钠配方或其它的碱为了同样的目的也可以使用。如果使用特殊的反应条件致使pH值增高，则应添加酸来维持最佳的pH值。
磷脂酶A2催化的磷脂酰胆碱水解将在许多种温度下进行，但优先选择在酶的活性最佳的温度下进行反应(即70至80℃)。由于在这个温度下磷脂酰胆碱/制剂的双层结构将既有流动性又有粘合力，有利于磷脂酶A2与磷脂酰胆碱分子接触，所以这个温度是优先的。本领域的技术人员用最少的实验就可以确定其它的最佳温度，该温度取决于在本发明的方法中使用的具体的反应混合物。
只要磷脂酰胆碱水解的程度能达到要求，可以由方法的使用者适当地选择反应时间。优先选择反应时间为1至5天，最优先选择反应时间为2天。
如上所述，我们认为在反应混合物中保持分层结构对磷脂酰胆碱的水解是最有效的。因此，优先选择反应物中各种成分的量将以在反应进程中始终保持分层结构为宜。在本发明的方法中使用的磷脂酰胆碱的剂量是按反应混合物总量的重量百分比确定的。重量百分比的计算方法是用一种反应物的重量除以全部反应物的总重量。
优先选择在反应混合物中磷脂酰胆碱的量不超过反应混合物总量的大约40wt％。磷脂酰胆碱的含量超过大约40wt％的反应混合物可能形成不分层的两相体系，这种体系不利于磷脂酰胆碱的有效水解。最优先选择磷脂酰胆碱大约是反应混合物总量的30wt％。
只要使磷脂酰胆碱的水解量超过只有磷脂酶A2参与时的水解量，只要足以增强磷脂酰胆碱水解，制剂可以按任何重量百分比添加到混合物中。最优先选用的制剂是单酸甘油酯。实际上单酸甘油酯以任何剂量存在于反应混合物中都将增强有磷脂酶A2参与的磷脂酰胆碱的水解。优先选择磷脂酰胆碱与单酸甘油酯的摩尔比在1∶0.1至1∶10之间。为了实现溶血磷脂酰胆碱的高得率，优先选择磷脂酰胆碱与单酸甘油酯的摩尔比在大约1∶1至1∶5之间。最优先的是磷脂酰胆碱与单酸甘油酯的摩尔比大约为1∶3。
有磷脂酶A2参与的磷脂酰胆碱和制剂的水解反应生成的理想的终产物是溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱与脂肪酸或制剂的组合物、或溶血磷脂酰胆碱与脂肪酸和制剂的组合物。具体地说，当制剂是单酸甘油酯时，优先的终产物是包括溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体。在美国专利第4,874,795和5,314,921号中已经揭示了这种脂类基体的效用。
在终产物是溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体组合物时，脂类基体中溶血磷脂酰胆碱成分与另两种成分(即单酸甘油酯和脂肪酸)之和的摩尔比大约为1∶3至1∶12。最优先选用的溶血磷脂酰胆碱成分与另两种成分(即单酸甘油酯和脂肪酸)之和的摩尔比介于1∶5至1∶6之间。脂类基体中各成分的摩尔比也优先选定在某一范围内。因此，优先的溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的摩尔比在1∶4∶2至1∶2∶4之间。最优先的溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的摩尔比为1∶4∶2、1∶3∶3、或1∶3∶2。
为了获得美国专利第4,874,795号定义的组合物，可以将补充的单酸甘油酯和脂肪酸添加到溶血磷脂酰胆碱/单酸甘油酯/脂肪酸的组合物中，然后熔融或混合。因此，为了获得符合要求的产品而需要而改变单酸甘油酯和/或脂肪酸的摩尔比时，可以将单酸甘油酯和/或脂肪酸加到脂类基体中。
用本发明的方法生产的脂类基体可用于输送药物。在这样要求时，只要对药物组合物的完整性不产生不利的影响，任何时候都可以将药物组合物加到反应混合物中，以使药物包容在脂类基体中。优先选择在形成脂类基体之后添加需要的药物组合物。
在这里揭示的方法还包括从反应混合物中回收在反应混合物中形成的溶血磷脂酰胆碱。在这里使用的术语“回收”的含义是从反应混合物的一种或多种反应混合物成分中回收溶血磷脂酰胆碱。溶血磷脂酰胆碱的实际形态可以变化，即回收的溶血磷脂酰胆碱可能是与反应混合物中其它成分络合的溶血磷脂酰胆碱。例如，回收溶血磷脂酰胆碱包括回收包含溶血磷脂酰胆碱、脂肪酸和制剂的脂类络合物。回收溶血磷脂酰胆碱还包括回收包含溶血磷脂酰胆碱和制剂的脂类络合物或包含溶血磷脂酰胆碱和脂肪酸的脂类络合物。在回收时不必考虑溶血磷脂酰胆碱或包含溶血磷脂酰胆碱的脂类络合物的纯化问题。所以，溶血磷脂酰胆碱或包含溶血磷脂酰胆碱的脂类络合物可以包含反应混合物中存在的其它成分，如Ca+2离子或磷脂酶A2。但是，回收应足以使溶血磷脂酰胆碱与其它物质分离，以便成为有用的溶血磷脂酰胆碱提取物或包含溶血磷脂酰胆碱的脂类络合物的提取物。如果需要，回收的溶血磷脂酰胆碱或包含溶血磷脂酰胆碱的脂类络合物也可以被纯化。
回收步骤可以包括一个或多个处理步骤，借助这些处理步骤足以将溶血磷脂酰胆碱与反应混合物中的一种或多种成份分开。因此，溶血磷脂酰胆碱可以与脂肪酸、制剂(如单酸甘油酯)、或脂肪酸和制剂分开。分离包括将需要的溶血磷脂酰胆碱或包含溶血磷脂酰胆碱的脂类络合物从反应混合物中分离出来，以及将不需要的成分从反应混合物中分离出来。例如，反应混合物可以利用丙酮萃取将溶血磷脂酰胆碱与反应混合物的其它成分分开。在其他的实施方案中，在包括溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类基体是符合需要的终产物时，可以将其他的反应成分，如磷脂酶A2、水、有机溶剂和过剩的单酸甘油酯或脂肪酸等与脂类基体分开。此外，借助加热或干燥可以将水与其他的反应混合物成分分开。本文提出一些分离方法适合将选中的产物从磷脂酰胆碱的酶催水解产物中分离出来，还有一些其它方法是本领域技术人员已知的。
许多本领域技术人员已知的方法可以用于分离溶血磷脂酰胆碱和其它反应成分，这些方法建立在溶解度、分子量、分子尺寸或其它性质存在差异的基础上。例如，可以借助氧化硅凝胶制备色谱将溶血磷脂酰胆碱与其它成分分开。优先借助丙酮萃取从反应混合物中将溶血磷脂酰胆碱分离出来。这种方法靠的是磷脂类不溶于丙酮，溶血磷脂酰胆碱作为固体沉淀下来，很容易从其它反应成分中回收。其它方法将是本领域技术人员已知的。
无论溶血磷脂酰胆碱的组合物只包含溶血磷脂酰胆碱，还是与单酸甘油酯和(或)脂肪酸结合，包含溶血磷脂酰胆碱的组合物在化妆品和皮肤科制剂中作为乳化剂、抗氧剂和表面活性剂都是有用的。
如上所述，本发明的方法还包括从反应混合物中除去水和/或其它溶剂，以便回收需要的终产物。因此，制造上述任何产品的方法都可以将除去水和溶剂作为分离方法的一部分。
只要符合需要的水解反应终产物不会受到不利的影响，在技术上已知的任何除去水、含水溶剂、或含水溶剂和有机溶剂的混合物的方法都可以被使用。优先采用那些在工业化生产溶血磷脂酰胆碱或脂类基体组合物时可以使用的方法。例如，可以借助加热法、冷冻干燥法、或喷雾干燥法从符合需要的终产物中除去溶剂。为了除去全部或部分的水或溶剂，可以根据用户的要求决定这类方法的持续时间以及除水或溶剂的程度。优先选择反应产物通过加热除水，借此获得糊状的溶血磷脂酰胆碱或脂类基体。
本发明的最佳实施例
                  实施例1
磷脂酶A2是由眼镜蛇(Naja naja siamenesis)和响尾蛇(Crotalus atrox)制备的。包含各种酶的贮备液是用pH值为7.4的包含0.74mM Ca+2离子的10mM硼酸盐缓冲液制备的，其中酶的浓度均为2mg/ml。用己烷和乙醇的混合物(己烷与乙醇的比例为95/5)制备脂类混合物，该混合物包含大豆卵磷脂(Phospholipon，Nattermann Phospholipid GMBH，lot#60020；250μg/ml)、含棕榈酰基和同位素的磷脂酰胆碱(每分钟大约衰变800000次，其质量可以忽略)(1-palmitoyl-2-(I-[14C-oleoyl])-phosphatidylcholine)和甘油一油酸酯[MO](4.54mg/ml)。在6个样品中磷脂酰胆碱[PC]与MO的摩尔比分别为1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、和1∶5。在每个1ml的“管状瓶(ReactiVial)”(Pierce，Rockford，IL)中放一个样品并在氮气气氛中干燥。添加硼酸盐/Ca+2离子缓冲液(0.01M、pH7.4)，然后使样品形成涡旋并用配备了盘形喇叭的W-375型声处理器(Branson sonifier)进行声处理，样品温度47℃、持续时间10分钟，功率6至7级。在总体积为0.2ml的缓冲液中反应混合物包含250μg PC和各种磷脂酶A2制剂，每种制剂4μg。样品中甘油一油酸酯的量用上述的摩尔比表示。在摇动浴器中使样品在30℃下培养，并抽取等分试样以供分析。
在第5小时抽取的10μl等分试样经过放射性分析后，发现除1∶0和1∶1的样品之外在所有的样品中脂类物质都不呈均匀分布，即我们没有获得有代表性的样品。样品的目测结果也是明显的，在摩尔比为1∶≥2的样品中脂类物质呈聚集状态并且附着在瓶壁上。所有的管状瓶都再次用盘形喇叭声处理器进行声处理并且在第24小时进行检验。除1∶2的样品之外，摩尔比为1∶≥3的样品外观都没有变化，而且它们的放射性表明这些样品仍然没有均匀分散。大约在向管状瓶中添加酶之后的第24小时，给每个样品添加100μl缓冲液，再将每个样品温度升到50℃，用功率设在2至3级的W-225型声处理器进行声处理，其中微型振动棒直接放在样品中，处理时间30秒。尽管后来在1∶4和1∶5的样品中观察到絮凝现象并且放射性很低，但是这样处理能使每个样品中的脂类物质分散。紧接声处理，立即将另一份酶溶液的等分试样添加到每个样品中，并且重新开始在30℃下培养。用于分析的等分试样的抽取量增加到20μl。在添加酶240小时以后，按与在中间时间点抽取等分试样进行分析相同的方式提取所有的样品进行分析。
将抽取的分析试样加到0.6ml 2∶1的氯仿与甲醇混合物和0.3ml的2mM的EGTA水溶液(pH5.25)中。为了在薄层色谱分析中用于每个样品的载体包含各种脂类物质而且每种脂类物质的量均为25μg，有机溶剂包含PC、溶血磷脂酰胆碱、油酸[OA]和MO，它们的浓度均为0.0417mg/ml。在室温下使样品形成涡旋，然后用Sorvall SS-34型离心机以3000xg对样品进行离心处理，处理时间10分钟，使有机相与水相分离。用注射器将下层的有机相从管状瓶中取出，放到小试管中，在氮气气氛中干燥(水相干燥后，用闪烁计数器检测放射性，结果不再是800,000dpm，而是＜1200dpm)。将样品再次用60μl 2∶1的氯仿和甲醇混合物溶解后，在氮气气氛中及样品溶液滴在带19条刻槽的20×20WhatmanLK5D硅胶薄层色谱板上的交错道上。用60∶40∶1的己烷、二乙基醚和乙酸混合液展开。溶剂在空气中蒸发后，色谱板上的痕迹距底部7cm。用60∶40∶1的氯仿、甲醇和氨水混合液二次展开，使PC离开原点、并且使MO与PC分开。带放射性标记的产物油酸位于7cm的上沿。该色谱板干燥后，用Berthode线性分析仪的放射性探头测定每条道上的放射性分布。这个单元给出一个视在效率，近似为7-9％。在模拟实验中，在培养的样品等分采样后立即将酶加到提取的混合物中。带放射性标记的PC没有发生水解，表明在样品检验的过程中提取介质中的条件妨碍磷脂酶表达活性。
实验结果列于表1并且绘制成图1和图2。结果与磷脂酰胆碱的最大转化率是一致的，即不添加单酸甘油酯(PC∶MO＝1∶0)将有大约70％的磷脂酰胆碱转化成溶血磷脂酰胆碱，这是测量带放射性标记的磷脂酰胆碱水解生成的带放射性标记油酸获得的结果。以任何摩尔比添加单酸甘油酯都将增加生成的溶血磷脂酰胆碱的量，这也是测量带放射性标记油酸获得的结果。应当注意，在反应混合物中添加单酸甘油酯减少了副产物的累积，实际上以各种摩尔比(PC∶MO)，在第96小时之前(包括第96小时)没有副产物生成。即使反应时间更长，生成的副产物也减少了。我们认为副产物是甘油磷脂酰胆碱。在有单酸甘油酯存在的条件下将增加溶血磷脂酰胆碱的形成，利用具有带14C标记的胆碱基的磷脂酰胆碱证实这一命题的研究工作现在已经完成。
表1添加甘油一油酸酯对磷脂酰胆碱的磷脂酶A2酶催水解的影响
                摩尔比(PC∶MO)
时间(小时) 1∶0 1∶1 1∶2 1∶3 1∶4 1∶5
PC
0 100 100 100 100 100 100
5 84 67 49 41 14 57
24 79 41 29 22 18 31
48 49 16 26 19 27 14
72 15 9 9 6 13 4
表1(续表)
96 13 11 6 3 9 3
168 7 6 3 2 * *
240 7 5 5 1 1 1
OA
    0  ND  ND  ND  ND  ND  ND
    5     15     32     46     51     64     35
    24     19     58     65     70     66     59
    48     49     82     73     80     71     83
    72     70     89     89     93     84     93
    96     64     86     92     95     83     93
    168     59     71     87     97     *     *
    240     59     64     75     96     86     95
副产物
    0     ND     ND     ND     ND     ND     ND
    5     0     0     0     1     1     0
    24     0     0     0     1     3     1
    48     2     0     0     1     1     1
    72     12     1     1     0     1     1
    96     21     2     2     1     3     1
    168     33     22     9     0     *     *
    240     32     28     20     3     12     3
*在等分试样中没有足够的放射性供定量分析使用；ND表示未测定。
实施例2
将卵磷脂(Phospholipon80，分子量785，American Lecithin，含大约80％磷脂酰胆碱)和单酸甘油酯(DimodanTM LSK和DimodanTM OK，分子量356，Danisco Ingrdients)合并，其中磷脂酰胆碱与单酸甘油酯的摩尔比为1∶1至1∶5。优先的摩尔比为1∶3(磷脂酰胆碱∶单酸甘油酯)。将这些成分混合到一起并加热到70至80℃，以获得均匀的熔体，即没有任何可见的折射度差异。然后添加足够的水，使磷脂酰胆碱在反应物总量中占30wt％。将这些反应物加热到70至80℃的反应温度进行混合，以达到均匀一致。用氢氧化钠水溶液将pH值调至8-9，并保持这个pH值。按每公斤Phospholipon80添加大约2ml的比例添加LecitaseTM 10L，一种磷脂酶A2的酶制剂(Novo Nordisk，Denmark)。没有必要进一步添加钙离子，因为在酶制剂中有钙离子。保持温度、搅拌和pH值等反应条件2天，直至磷脂酰胆碱完全水解为止。在完全水解后，加热除去水，以得到糊状物。
非必选地将附加的单酸甘油酯和脂肪酸加到由溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸组成的脂类基体中，并按上述方法熔融混合，以得到在美国专利第4,874,975号中定义的组合物。
为了获得高纯度的溶血磷脂酰胆碱，用丙酮沉淀反应的终产物，其中丙酮将从上述的包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的水解产物中将单酸甘油酯和脂肪酸两种成分萃取出来。在添加丙酮时，溶血磷脂酰胆碱将从溶液中沉淀出来，并且可以用标准方法回收。
已经使用的术语和表达仅仅是说明性的用语，而不是限制性的，在使用这些术语和表达时无意排斥全部或部分特征相同的术语和表达，应当明了的是在本发明的范围内可能有各种各样的改进方案。

Claims (28)

1.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括：
将一种制剂与磷脂酰胆碱与水合并，在水中形成制剂与磷脂酰胆碱的水分散液；以及
让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，形成反应混合物，其中所述制剂是从包括单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一组制剂中选出的。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括从反应混合物中回收溶血磷脂酰胆碱。
3.根据权利要求2所述的方法，其中回收步骤包括使溶血磷脂酰胆碱与反应混合物成分分离，这些成分是在包括脂肪酸、制剂、或脂肪酸和制剂的一组成分中选定的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中对溶血磷脂酰胆碱与脂肪酸和制剂的分离包括用丙酮萃取。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂是单酸甘油酯。
6.根据权利要求5所述的方法，该方法进一步包括从反应混合物中回收溶血磷脂酰胆碱。
7.根据权利要求6所述的方法，其中回收步骤包括使溶血磷脂酰胆碱与反应混合物成分分离，这些成分是从包括脂肪酸、单酸甘油酯、或脂肪酸和单酸甘油酯的一组成分中选定的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中对溶血磷脂酰胆碱与脂肪酸和单酸甘油酯的分离包括用丙酮萃取。
9.根据权利要求5所述的方法，其中单酸甘油酯具有含8至22个碳原子的酰基。
10.根据权利要求1所述的方法，其中制剂与磷脂酰胆碱混合物的水分散体在有钙离子存在的条件下与磷脂酶A2接触。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在混合物中磷脂酰胆碱的含量低于40wt％。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在混合物中磷脂酰胆碱的含量是30wt％。
13.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括：
将制剂、磷脂酰胆碱和有机溶剂与水合并，形成含有机溶剂的制剂与磷脂酰胆碱的混合物在水中的水分散体，其中所述溶剂是从包括乙醚、叔丁基醇、乙醚和乙醇的混合物、叔丁基醇和乙醇的混合物和甲基异丁基酮的一组溶剂中选定的；以及
让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，形成反应混合物，其中所述制剂是从包括单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一组制剂中选出的。
14.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括：
将磷脂酰胆碱和单酸甘油酯与水合并，使磷脂酰胆碱和单酸甘油酯的混合物在水中形成水分散体，其中磷脂酰胆碱和单酸甘油酯的比例从1∶1至1∶5；以及
让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，形成反应混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中磷脂酰胆碱和单酸甘油酯的比例是1∶3。
16.一种制备包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的组合物的方法，该方法包括：
使磷脂酰胆碱和单酸甘油酯的水合混合物与磷脂酶A2接触；以及
回收包含溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的脂类络合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中回收脂类络合物的步骤包括除去水。
18.根据权利要求16所述的方法，其中溶血磷脂酰胆碱在回收的脂类络合物的组合物中与单酸甘油酯和脂肪酸之和的摩尔比介于1∶3至1∶12之间。
19.根据权利要求18所述的方法，其中溶血磷脂酰胆碱在回收的脂类络合物的组合物中与单酸甘油酯和脂肪酸之和的摩尔比介于1∶5至1∶6之间。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在回收的脂类络合物的组合物中溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的摩尔比介于1∶4∶2至1∶2∶4之间。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在回收的脂类络合物的组合物中溶血磷脂酰胆碱、单酸甘油酯和脂肪酸的摩尔比从包括1∶4∶2、1∶3∶3和1∶3∶2的一组比值中选定。
22.根据权利要求16或20所述的方法，其中单酸甘油酯来源于天然的甘油三酯。
23.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括：
将制剂和磷脂酰胆碱与水合并，使制剂与磷脂酰胆碱的混合物在水中形成分散液；以及
让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，形成反应混合物，在反应混合物中制剂以有效地增强磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化的剂量存在，其中所述制剂是从1包括单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一组制剂中选出的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述制剂以使磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化的效率增加到80％或更高的有效剂量存在。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述制剂以使磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化的效率增加到90％或更高的有效剂量存在。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述制剂以使磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化的效率增加到95％或更高的有效的剂量存在。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述制剂以使磷脂酰胆碱向溶血磷脂酰胆碱转化的效率增加到99％或更高的有效的剂量存在。
28.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在添加水之前，将制剂和磷脂酰胆碱合并，形成制剂与磷脂酰胆碱的混合物，其中该制剂是从包括单酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一组制剂中选定的；
(b)向上述制剂/磷脂酰胆碱的混合物中加入水，形成该制剂/磷脂酰胆碱混合物的水分散体；以及
(c)让该混合物的水分散体与磷脂酶A2接触，形成反应混合物。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3853464B2 (ja) * 1997-04-08 2006-12-06 辻製油株式会社 植物性リゾレシチンの製造法
EP1119360B1 (en) 1998-09-08 2006-12-06 Biomolecular Products, Inc. Compositions for increasing intestinal absorption of fats
US6068997A (en) * 1999-03-01 2000-05-30 Kemin Industries, Inc. Method for the conversion of lecithin into lysolecithin
KR100331932B1 (ko) * 1999-11-30 2002-04-09 최승철 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법
CA2788500C (en) * 2001-10-11 2017-08-01 Biomolecular Products, Inc. Modifications of solid 3-sn-phosphoglycerides
US7763264B2 (en) * 2005-04-26 2010-07-27 John Kulesza Composition and method for reducing the appearance of cellulite
KR100810866B1 (ko) * 2006-10-16 2008-03-06 학교법인 한림대학교 라이소 포스파디딜콜린 및 유도체의 전합성
US20080241085A1 (en) * 2007-03-29 2008-10-02 Lin Connie B Compositions for use in darkening the skin
CN102277393B (zh) * 2011-08-18 2014-03-26 河南工业大学 一种酶催化醇解制备溶血磷脂酰胆碱的方法
CN103131736B (zh) * 2013-02-25 2015-08-05 上海艾韦特医药科技有限公司 高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备及应用
EP2805612A1 (en) 2013-05-22 2014-11-26 University of Graz Lysophospholipids against American Foulbrood
CN104250658A (zh) * 2013-06-26 2014-12-31 江苏恩华药业股份有限公司 高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备方法
JP6692748B2 (ja) 2013-09-26 2020-05-13 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール リゾホスファチジルコリンの足場を利用する組成物及び方法
US20160303148A1 (en) 2013-11-28 2016-10-20 Kewpie Corporation Multidrug-Resistant Gram-Positive Bacteria Antibacterial Agent and Topical Agent
BR112017008023A2 (pt) * 2014-10-20 2018-02-20 Int Flavors & Fragrances Inc nanoemulsão flavorizante, bebida líquida ou concentrado de bebida líquida, e, método para preparar uma nanoemulsão.
CN105296556A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 福建师范大学 一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法
CN105400838B (zh) * 2015-12-30 2019-09-20 厦门金达威生物科技有限公司 一种生物酶催化制备磷脂型dha的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1104683A (zh) * 1993-12-29 1995-07-05 中国科学院成都生物研究所 制取聚-β-羟基丁酸酯的新方法
CN1111285A (zh) * 1993-09-17 1995-11-08 日清制油株式会社 用粉状脂酶转酯基的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1215868A (en) * 1967-07-13 1970-12-16 Unilever Ltd Fat emulsions
US4874795A (en) * 1985-04-02 1989-10-17 Yesair David W Composition for delivery of orally administered drugs and other substances
US4849132A (en) * 1986-05-16 1989-07-18 Asahi Denka Kogyo Kabushiki Kaisha Surfactant composition having improved functions
JPS6333387A (ja) * 1986-07-28 1988-02-13 Q P Corp 中性脂質含量が減らされたリゾリン脂質含有リン脂質の製造法
JPS63248430A (ja) * 1987-04-04 1988-10-14 Nisshin Oil Mills Ltd:The 乳化剤組成物
JPH066032B2 (ja) * 1987-05-12 1994-01-26 太陽化学株式会社 酵素改質レシチンの製造法
JPH01233290A (ja) * 1988-03-15 1989-09-19 Nippon Oil & Fats Co Ltd リゾレシチンの製造法
JP2794574B2 (ja) * 1988-08-11 1998-09-10 昭和産業株式会社 リゾレシチンの製造方法
JP2830072B2 (ja) * 1989-06-06 1998-12-02 日本油脂株式会社 合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法
JPH05236974A (ja) * 1991-03-29 1993-09-17 Nichiro Corp 高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法
DK0546215T3 (da) * 1991-12-12 1998-10-19 Nestle Sa Varmestabil olie-i-vandemulsion og proces til dens fremstilling
JPH05168498A (ja) * 1991-12-24 1993-07-02 Asahi Chem Ind Co Ltd カルシウムイオン測定用組成物
DE69332217T3 (de) * 1992-06-16 2009-01-15 Sankyo Lifetech Co.Ltd. Phospholipase A1, Verfahren zu seiner Herstellung und Anwendung
KR950003530B1 (ko) * 1992-07-02 1995-04-14 제일제당 주식회사 조리유

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1111285A (zh) * 1993-09-17 1995-11-08 日清制油株式会社 用粉状脂酶转酯基的方法
CN1104683A (zh) * 1993-12-29 1995-07-05 中国科学院成都生物研究所 制取聚-β-羟基丁酸酯的新方法

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