CN104250658A - 高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括在钙离子溶液中，先加入磷脂酰胆碱与胆酸盐搅拌后，再加入磷脂酶A2保温进行水解反应得到溶血磷脂酰胆碱，丙酮沉淀将产品分离出。本发明加入胆酸盐，使磷脂酰胆碱乳滴变小、变细，反应溶液变稀，使反应物在5小时左右水解完全，能明显缩短反应时间，其中在磷脂酰胆碱浓度高达30-40%，其转化成溶血磷脂酰胆碱的效率仍能达到100%。此外，本法副产物如甘油磷酰胆碱和未水解的磷脂酰胆碱相比现有技术显著减少。本发明生产的溶血磷脂酰胆碱纯度高，可以省去多次的纯化步骤，进而可以缩短生产周期并能大幅降低生成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备方法，尤其涉及一种以卵磷脂为原料制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法。
背景技术
溶血磷脂酰胆碱是卵磷脂的代谢产物，亦称溶血卵磷脂，在食品工业及化妆品工业中可以作为食品添加剂及乳化剂使用，高纯度的溶血磷脂酰胆碱在药学上可以作为药物中间体用，是一类安全无毒的药物载体。例如在专利CN100536851中作为丙戊酸的载体，其结合物可以作为一类优良的抗癫痫药物使用，其制备通常利用磷脂酶A2促进磷脂酰胆碱的水解来生产溶血磷脂酰胆碱。
早在二十世纪初人们就已经知道磷脂酰胆碱可以借助酶促水解转化成溶血磷脂酰胆碱。1935年Hughes用实验证明卵磷脂转化成溶血卵磷脂（溶血磷脂酰胆碱）的单分子膜水解与诸如pH值、温度和卵磷脂分子的表面浓度等因素有关。Hanahan证明在鸡蛋卵磷脂与磷脂酶A2之间的醚溶性络合物导致释放不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。1963年，Dawson也发现了磷脂酶A2将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱和脂肪酸分子，并确定酶的活性与钙离子存在与否有关，并且添加丁醇将激发磷脂酶的活性。英国专利GB1215868介绍了进一步改进方案，即在有脂肪（油）存在的条件下进行有磷脂酶A2参与的磷脂的水解反应。中国专利 CN1210560通过加入单酸甘油酯以期改进水解效果，但是由于反应温度过高、反应时间过长，致使反应物中副产物仍然很多，并且单酸甘油酯加入量非常大，是磷脂酰胆碱的5倍量），成本很高。
现有技术揭示的磷脂酰胆碱水解方法依然存在一些缺点，如产品纯度低，磷脂酰胆碱原始物质的转化效率不超60-70%，甘油磷酰胆碱和未水解的磷脂酰胆碱等副产物高，特别是高浓度（浓度为30-40%）的磷脂酰胆碱水解时，由于浓度高，反应物粘稠，需要长达96小时的反应时间，转化为溶血磷脂酰胆碱的效率更低，副产物的产生比例更高，为了得到高纯度的终产物需要多次纯化去除副产物，从而限制了其工业化生产。
由于现有技术上的缺陷，所以需要提出更有效的将磷脂酰胆碱转化成溶血磷脂酰胆碱的方法，以得到高纯度的可药用的溶血磷脂酰胆碱。
发明内容：
本发明的目的是提供一种溶血磷脂酰胆碱的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，该方法包括在钙离子溶液中，先加入磷脂酰胆碱与胆酸盐搅拌后，再加入磷脂酶A2保温进行水解反应得到溶血磷脂酰胆碱。
上述制备溶血磷脂酰胆碱的方法中，所述水解反应得到的反应混合物通过丙酮沉淀将溶血磷脂酰胆碱分离出。
上述制备溶血磷脂酰胆碱的方法中，所述的胆酸盐选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠中的一种或几种。优选为胆酸钠。所述的钙离子溶液为CaCl2水溶液。所述CaCl2水溶液的浓度为0.1~0.4mol/L，优选0.1~0.2 mol/L。所述的胆酸盐与磷脂酰胆碱的摩尔比为0.05~1：1，优选0.1~0.3：1。
上述制备溶血磷脂酰胆碱的方法中，所述磷脂酶A2加入前反应体系的起始pH值7~9，优选7~8。再加入磷脂酶A2保持一定温度进行水解反应，磷脂酶A2的使用量通常为100g磷脂酰胆碱（卵磷脂）加入1~2ml酶液（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark）。加完磷脂酶A2后将反应混合物升温至40~80℃的温度，优选大约50~60℃，并将混合物再搅拌一定时间进行水解反应，如3~6h，优选4~5h，然后使用丙酮沉淀分离溶血磷脂酰胆碱。
上述制备溶血磷脂酰胆碱的方法中，所述保温的温度为40~80℃，温度优选50~60℃。所述水解反应的时间为3~6h，优选4~5h。
本发明所述的室温为本领域技术人员所公知的25±5℃。本发明所涉及的原料除特别说明外均可以通过市场购买获得。
本发明的有益效果：
本发明加入胆酸盐，使磷脂酰胆碱乳滴变小、变细，反应溶液变稀，加快反应速度，使反应物在5小时内水解完全，显著缩短了反应时间，即使磷脂酰胆碱在溶液中的浓度高达30~40%（重量比），其转化成溶血磷脂酰胆碱的效率仍能达到100%。此外，本法副产物如甘油磷酰胆碱（二个脂肪酸完全水解下来的副产物）和未水解的磷脂酰胆碱相比现有技术显著减少。本发明生产的溶血磷脂酰胆碱纯度高，可以省去多次的纯化步骤，进而可以缩短生产周期并能大幅降低生成本。本方法得到的产物，氢化后产品性质更加稳定，易于储存，更加适合药用或应用于食品工业。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
磷脂酰胆碱购自上海太伟药业，分子量785；磷脂酶A2购自丹麦诺和诺德制药公司，胆酸钠购自国药集团化学试剂公司。
实施例1
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入116ml 0.1mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，6g胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/L NaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至50℃搅拌5h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得25g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度99.2%。
实施例2
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入75ml 0.2mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，8.22g胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值8，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至50℃搅拌5h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得26.7g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度98.7%。
实施例3
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入70ml 0.4mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，5.48g胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至60℃搅拌4h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得26g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度99.1%。
实施例4
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入75ml 0.3mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，1.37g胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值9，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至80℃搅拌3h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得25.3g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度99.2%。
实施例5
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入116ml 0.1mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，2.74g胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至40℃搅拌6h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得24.8g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度为99.3%。
实施例6
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入90ml0.2mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，2.64g脱氧胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至50℃搅拌5h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得26.7g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度为98.9%。
实施例7
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入90ml 0.2mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，10.27g牛黄胆酸钠，剧烈搅拌50min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值8，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至60℃搅拌4h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得25.4g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度为98.6% 。
实施例8
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入90ml 0.2mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，6.65g牛黄脱氧胆酸钠，剧烈搅拌40min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至60℃搅拌4h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得26.0g粉末状溶血磷脂酰胆碱，纯度为98.8%。
实施例9
氢化釜中加入10g上述实施例制备的溶血磷脂酰胆碱，160ml二氯甲烷/95%乙醇溶液（V二氯甲烷：V95%乙醇=3:1）搅拌溶解，加入0.5g 10%Pd/C，密封后，以氮气，氢气置换气体3次，充入氢气，保持0.5MPa，50℃反应5h。排空后，取出反应液，抽滤，滤液浓缩干，加入15ml无水乙醇溶解，室温下滴加150ml丙酮，析出白色固体，冷却至0℃搅拌2h，抽滤，40℃真空干燥，得9.3g白色粉末，纯度99.5%。
实施例10
70ml 0.4mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，不同量的胆酸钠，剧烈搅拌30min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L, 10580IU/ml, NovoNordisk, Denmark），保持50℃进行水解反应，转化为溶血磷脂酰胆碱的百分比（见表1）。
其通过HPLC法测定转化率：利用高效液相色谱测定酶解反应前后反应体系中磷脂酰胆碱的含量来计算溶血磷脂酰胆碱的转化率。柱条件：nova-paksilica柱长15cm，柱径3.9mm，柱压280psi，流速0.4ml/min。检测波长204mm。流动相：乙腈：甲醇：水=65： 2：14（v:v:v）。
其中：A1%为反应前磷脂酰胆碱含量，A2%为反应后磷脂酰胆碱含量。
表1 添加不同量的胆酸钠时不同时间内溶血磷脂酰胆碱的转化率
比较例
配有氮气保护装置的1000ml反应瓶中加入70ml 0.4mol/L CaCl2水溶液，50g磷脂酰胆碱，剧烈搅拌50min，使其分散均匀，通过加入4mol/LNaOH溶液控制体系初始pH值7，加入1ml磷脂酶A2（Lecitase 10L,10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark），升温至60℃搅拌96h，冷却至室温，慢慢加入2L丙酮，析出固体，倾出上层清液，固体再以1L丙酮分三次搅拌洗涤，分散成粉末状，抽滤，40℃真空干燥，得23g粉末状溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱纯度58%。
Claims (10)
1.一种制备溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于该方法包括在钙离子溶液中，先加入磷脂酰胆碱与胆酸盐搅拌后，再加入磷脂酶A2保温进行水解反应得到溶血磷脂酰胆碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水解反应得到的反应混合物通过丙酮沉淀将溶血磷脂酰胆碱分离出。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的胆酸盐选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的胆酸盐是胆酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的钙离子溶液为CaCl2水溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述CaCl2水溶液的浓度为0.1~0.4mol/L，优选0.1~0.2 mol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的胆酸盐与磷脂酰胆碱的摩尔比为0.05~1：1，优选0.1~0.3：1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷脂酶A2加入前反应体系的起始pH值7~9，优选7~8。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述保温的温度为40~80℃，温度优选50~60℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水解反应的时间为3~6h，优选4~5h。
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