CN1104683A

CN1104683A - 制取聚-β-羟基丁酸酯的新方法

Info

Publication number: CN1104683A
Application number: CN 93115676
Authority: CN
Inventors: 赵树杰; 范成英
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 1993-12-29
Filing date: 1993-12-29
Publication date: 1995-07-05

Abstract

用微生物以甲醇为原料制取聚-β-羟基丁酸酯系采用二级连续发酵工艺，在一级罐中连续增殖细胞，在二级罐中限氮提高细胞内PHB含量，从而使发酵罐一次灭菌、接种即能连续生产PHB含量较高且较稳定的发酵液，提高了设备利用率，缩短了生产周期，可大幅度降低微生物法生产PHB的发酵成本，有利于大规模生产。

Description

本发明涉及微生物菌种及其发酵制取聚-β-羟基丁酸酯的过程。

聚-β-羟基丁酸酯（PHB）是微生物合成的一种聚合物，作为细胞内碳源和能源的贮藏物，广泛存在于各类微生物细胞内。PHB具热可塑性，并可被生物降解利用，是一种优良的生物可降解塑料。自七十年代以来，英、美、日等国均广泛开展了用微生物发酵法生产PHB的研究，如美国专利（4336334），使用PseudomonasAM₁，以甲醇为碳源，在无机培养基中好氧发酵，菌体浓度达13g/L，PHB含量35%;文献CA111095624中记载了一种使用Protomonas extorguensk发酵生产PHB的方法，在以甲醇、NH₃或铵盐为C.N源的无机培养基中好氧发酵至菌体浓度达50g/L以上，限制N源供给72小时，PHB积累至细胞干重的35%，停止发酵;美国专利（4433053），使用Alcaliyenes entrophus以糖为碳源，发酵70小时，菌体浓度达45g/L，限氮后停止发酵，PHB含量70%。以上这些方法均属批式发酵，发酵罐灭菌、接种一次只能生产相当于发酵罐体积的70%的发酵液。设备利用率低，生产周期长，成本较高，不利于规模化生产。PHB的发酵生产，包括细胞增殖期和PHB积累期，这两个时期不能在同一罐内同时进行，因此，使用一个发酵罐只能采用批式发酵，而一般的一级连续发酵只能解决细胞的连续增殖，不能解决PHB的连续积累。

本发明的目的是提供一种连续生产PHB的发酵工艺，以发挥生产菌的生产潜力，提高设备利用率，降低生产成本，使之有利于规模化生产。

本发明的技术解决方案是：采用二级连续发酵，一级罐为菌体的连续增殖，贰级罐为限氮培养，进行PHB的连续积累。

本发明的实施方法：

将甲基营养菌（以甲烷或甲醇为唯一碳源，能源生长的微生物）接种于以甲醇、铵盐为C.N源的无机培养基中，在一级罐中好氧培养20-30hr，至菌体浓度达15g/L以上，用氮水将发酵过程的pH维持在6.2-7.5，N含量0.02-0.30g/L，维持温度25-40℃，流加甲醇维持其浓度0.1-6g/L，流加磷酸盐维持P含量0.1-1g/L，维持溶解氧1-5ppm，并补加Ca、Cu、Fe、Zn、Mn、Mo等微量元素。这是发酵的起始阶段，然后开始二级连续发酵：把发酵液（菌浓达15g/L以上）按一定流速从一级罐泵入二级罐，并按同样的速度流加无机盐培养基至一级罐以保持其液位，稀释率（每小时流加的无机盐培养基体积除以一级罐内发酵液体积），控制在0.01-0.20h^-1。流入二级罐的发酵液按一级罐中的发酵条件进行限氮培养，用4%的NaOH溶液代替氨水以维持pH6.2-7.5，适当补加铵盐以维持N含量在0.02g/L以下，但不变为零。限氮培养亦为连续方式，经限氮培养富含PHB的发酵液从二级罐中连续流出进入菌体的分离装置，一级罐中流出的发酵液维持二级罐的液位，调节该液位控制二级罐的稀释率0.05-0.40h^-1。大于一级罐。

本发明的优点：

改变以往PHB生产的批式工艺为连续工艺，菌体生产罐一次灭菌、接种，即可生产相当于批式两倍以上的发酵液，提高了生产效率和设备利用率，且PHB含量稳定。

实施例：

把嗜甲基营养菌8502-3（查氏生丝微菌属成都亚种Hyphomicrobium Zavarzinil Suhsp chengduense supsp nov）接种于250ml三角瓶中（内盛100ml无机培养基含甲醇3g/L，（NH₄）₂SO₄0.5g/L，内盛无机培养基500ml）同样振摇培养24小时。无机培养基组成如下：

成分含量（克/升）

（NH₄）₂SO₄0.5

CaCl₂·2H₂O 0.2

MgSO₄·7H₂O 1.0

CuSO₄·5H₂O 0.0040

FeSO₄·7H₂O 0.0080

MnSO₄H₂O 0.00030

ZnSO₄·7H₂O 0.00034

Na₂MoO₄·2H₂O 0.00023

NaCl 0.5

EDTANa₂0.01

KH₂PO₄0.52

Na₂HPO₄·12H₂O 0.48

pH 6.8

蒸馏水配制

二级连续发酵用10升自控发酵罐作一级罐，工作体积6升;用5升发酵罐作二级罐，工作体积1.5升，一级罐发酵参数如下：

温度：33-35℃ pH7.0-7.2

溶氧：30-50% 甲醇：2-4g/L

（NH₄）SO₄0.4-0.6g/L 磷酸盐：1-2g/L

发酵过程中还需补加Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、Mo等微量元素，扩大于2L三角瓶的种液接种于10升罐按以上参数发酵48小时，菌浓达25g/L，然后开始连续发酵，发酵液从10升罐泵入5升罐，同时给10升罐流加无机盐培养基，流量控制在250-300ml/小时，平均稀释率为0.046，二级罐为限氮积累PHB过程，发酵参数同一级罐，但（NH₄）₂SO₄含量小于0.1g/L，但不得为零。当二级罐的液位达1.5升时，开始按250-300ml/小时的流量收取发酵液，发酵液在二级罐中的限氮时间为：4-5小时，平均稀释率为0.17。连续发酵40小时，共获发酵液17升，菌浓为23.2克/升，PHB含量59.3%。

Claims

1、利用微生物以甲醇为原料生产聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的方法，其特征是：整个生产过程采用两级连续发酵；一级罐为菌体的连续增殖，二级罐为限氮培养PHB的连续积累。

2、依据权利要求1所述用微生物以甲醇为原料生产PHB的方法，其特征是：菌体在一级罐中好氧发酵参数为：pH6.2-7.5，N含量0.02-0.30g/L，维持温度25-40℃，甲醇浓度0.1-6g/L，P含量0.1-1g/L，溶解氧1-5ppm，并补加Ca、Mg、Cu、Fe、Zn、Mn、Mo等微量元素;在二级罐中限氮培养时间为3-6小时，参数同一级罐，但N含量≤0.02g/L，但≠0。

3、依据权利要求2所述用微生物以甲醇为原料生产PHB的方法，其特征是：在二级发酵过程中，流加无机盐培养基至一级罐，流速与菌液从一级罐流入二级罐相同以保持液位，稀释率控制在0.01-0.2h^-1。

4、依据权利要求3所述用微生物以甲醇为原料生产PHB的方法，其特征是：二级罐的稀释率控制在0.05-0.40h^-1，大于一级罐的稀释率。