CN1086203C - 构建多功能基因工程菌生产聚β－羟基丁酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种构建多功能基因工程菌制备聚β-羟基丁酸酯的方法，即分别以大肠杆菌或真养产碱杆菌为宿主菌，将透明颤菌血红蛋白合成基因，λ噬菌体裂解基因以及PHB合成基因转入宿主中，从而构建出新菌株。将菌株在含葡萄糖的LB培养基中进行摇瓶培养，最后用螯合剂溶液诱导，使细胞裂解，将胞内的PHB释放出来。本发明的方法在发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。
Description
本发明涉及一种构建多功能基因工程菌生产聚β-羟基丁酸酯的方法，属生物化工技术领域。
近年来，由于化学合成塑料与植物纤维、动物蛋白等多种天然材料相比，具有防潮、耐磨、质轻、价廉、易成型、抗腐蚀等许多特点，因此广泛应用于国民经济的各部门，同人们的生产和生活息息相关。目前地球上每年生产的化学合成塑料已高达1亿吨。但由于合成塑料制品很难在自然界中降解(长达20-500年以上)，且废旧塑料的回收利用和运输处理的效率都很低，从而造成了日益严重的环境污染。因此，为了人类的生存和发展，世界各国政府、科研机构和环保部门越来越密切关注由塑料垃圾引起的“白色污染”问题，传统塑料开始面临严峻的挑战。
微生物聚酯正是在这种情况下发展起来的一类新型可降解高分子材料，而聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate，以下简称PHB)则是它的典型代表。PHB不仅具有通常高分子材料的力学性能和加工性能，而且作为一种由微生物合成的高分子材料，还具有化学合成塑料所没有的一些特殊性能，如可生物降解性、生物相容性、比重大、光学活性好、透氧性低、抗紫外辐射、压电性和抗凝血性以及在生物合成过程中可利用再生原料的特性等等，从而在医药、农业、电子、包装材料等领域具有独特而广泛的应用前景，并深受国际生物工程界的重视。然而，到目前为止，PHB的大规模生产和广泛应用仍未实现，其中一个最主要的原因就是PHB的生产成本要比石油化工塑料高得多：目前，以石油为原料的化学合成塑料的价格约为1$/kg，而PHB的价格却高达16-22$/kg。所以，要使PHB获得更广泛的应用，必须降低其包括发酵、分离等各方面在内的生产成本。为此，选育和构建新的高产基因工程菌，提高发酵产率，缩短发酵周期以及开发廉价的分离新工艺等可以说是亟须解决的问题。
利用微生物发酵法来生产PHB的成本主要包括两个方面：即发酵成本和分离成本。要想降低PHB的发酵成本，则必须使菌体细胞能利用廉价的原料和实现高密度发酵培养及PHB的大量积累；而要想降低PHB的分离成本，则必须改造现有的分离提取工艺。
在进行好氧生物发酵培养的过程中，维持充足氧气以满足好氧细胞生长的氧需求是一个极需高度重视的问题。由于生物发酵体系的多相性将导致极低的溶氧利用速率，因此在大规模细胞培养或高密度发酵如补料分批培养和固定化细胞发酵系统中，供氧问题尤为突出。解决该问题的传统方法一般都局限于提高细胞生长环境中的氧气传递性质，其中包括通入纯氧、通气/搅拌优化配置以及通过加入化学物质(氧载体)如正十二烷或全氟碳(Forane F66)来增加液相中氧气的溶解度(Rols et al，Biotechnology andBioengineering，1990，35：427-435)；而解决氧需求问题的另一途径则是利用基因工程技术来提高细胞自身对氧气的利用率。由于细胞呼吸生化机制的复杂性以及无数基因操作均能影响好氧代谢，从而使选择一种特定的基因修饰更加复杂。革兰氏阴性专性好氧菌--.透明颤菌(Vitreoscilla)于微氧条件下可以合成一种类似于血红蛋白的胞内可溶物质，即为透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hernoglobin，VHb)(Khosla et al，Bio/technology，1990，8：849-853)。1988年，Khosla和Bailey成功地解决了透明颤菌血红蛋白(VHb)在重组大肠杆菌中的外源表达问题(Khosla and Bailey，1988，331：633-635；Khosla and Bailey，214：158-161)。透明颤菌血红蛋白能够从分子水平上提高透明颤菌血红蛋白基因克隆菌对氧气的利用能力，因此能在限氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而大幅度提高发酵过程中目的产物的产量和收率。又由于VHb的应用不仅可以降低氧气及能量的消耗，还不需要附加的设备投资，故而可大大降低发酵成本。因此，利用VHb在其它菌种中进行外源表达这一基因策略来解决好氧生物发酵过程中的供氧问题具有极大的科研意义，并可能带来巨大的经济效益。
此外，由于PHB是微生物在不平衡生长条件下以颗粒状态贮存于细胞内的一种高分子聚合物，因此要应用PHB，首先必须将它从细胞内分离提取出来。到目前为止，国内外学者已经进行了大量的研究，开发出了从微生物细胞中分离提取PHB的许多方法，如溶剂萃取法(专利EP 0,015123 A1；专利JP 63,198,661；专利JP 07 79,788；专利JP 0779,985；专利DE 4,215,860；专利AT 390,068)、化学试剂法(专利WO 94/24,302；专利JP07 79,787)、机械法(Harrison et al，Bioseparation，1991，2：155-166)和酶法(专利US4,910,1445)以及近年来发展起来的利用生物技术破壁的方法(Garrett et al，Mol.Gen.Genet.，1981，182：326-331；Kloos et al，J.Bacterio.，1994，176(23)：7352-7361；Crabtree et al，J.Bacteriol.，1984，158(1)：354-356)等等。除利用生物技术破壁的基因工程方法外，其余化学工程方法按分离时细胞被溶解的物质的不同又可分为两类：一类是将PHB直接溶解提取，而去除非PHB物质的方法，如溶剂萃取法；另一类则是将非PHB物质转化为可溶性的物质除去，而保留固态的PHB的方法，如化学试剂法和酶法。机械破壁法只是将细胞破碎，但作为预处理细胞的方法，与前面的两类方法联用，将有助于提高对PHB的分离效果。上述每一种方法都各有其优缺点，但随着基因工程技术的日益发展，利用生物技术破壁的方法越来越受到人们的重视。根据对细胞结构的分析可知，细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁致密的肽聚糖结构，因此，利用可控的λ噬菌体裂解基因破坏细胞壁的肽聚糖层结构，从而实现菌体细胞的自动裂解，释放出胞内的PHB产品，将为大幅度降低PHB的分离成本提供可能。与现有的细胞破壁法：机械法、化学试剂法、酶法等相比较，利用噬菌体裂解基因破细胞壁的方法具有许多优点：可避免机械法所需的昂贵设备所带来的费用问题；可避免化学试剂法所带来的试剂回收和环境污染问题。另外，由于该法是一种温和的细胞破壁方法，从而可以避免机械法和化学试剂法破壁时对产品性能所造成的不良影响如降解、变性等。与酶法相比，用可控的噬菌体裂解基因破壁的方法则具有操作简单、可方便控制细胞裂解、不需加入外源酶等优点。
本发明提出了一种构建多功能基因工程菌生产聚β-羟基丁酸酯的方法，其目的是将上游的基因工程技术与下游的发酵和后处理技术结合起来，利用分子克隆技术构建能成功表达透明颤菌血红蛋白合成基因(vgb)和λ噬菌体裂解基因(S-RRz)的产PHB新菌株，从而提出一种利用多功能基因工程菌制备PHB的新方法，进一步实现PHB的高密度发酵培养和菌体细胞的可诱导裂解破壁，以期同时从发酵和分离两个方面降低PHB的生产成本。
本发明提出的构建多功能基因工程菌生产聚β-羟基丁酸酯的方法，由以下步骤组成：
1、首先采用分子克隆操作制备大肠杆菌和真养产碱杆菌的感受态细胞(CaCl2法)：从菌体的固体平板上挑取单菌落，接种于装有3-10毫升的LB液体培养基(酵母浸膏粉：5g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：10g/L，pH7.0)的试管中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养6-15小时；取0.1-1.0毫升培养液接种于装有50-100毫升LB液体培养基的三角瓶中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养至吸光度OD600为0.3-1.0；将培养液转入预冷的已灭菌离心管中，冰浴冷却5-20分钟后于2-6℃的离心机上以3000-8000转/分钟的转速离心5-20分钟；倒出培养液，在无菌条件下将管倒置1-3分钟以使残留的培养液流尽；加5-25毫升用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，冰浴放置5-25分钟；于2-6℃的离心机上以3000-8000转/分钟的转速离心5-20分钟，弃上清；用1-5毫升用冰预冷过的0.1mol/L CaCl2再次重悬每份沉淀，最后在冰上放置片刻即得到感受态细胞。将制好的感受态细胞转移到已灭菌的1.5毫升离心管中，每管100-500微升。
2、在第一步制备好的感受态细胞中加入体积小于10微升、质量小于50纳克的携带透明颤菌血红蛋白基因的质粒pBR322-vgb，进行质粒的转化：混匀内容物，在冰上放置10-50分钟；接下来在42℃的循环水浴中，放置30-150秒，再冰浴1-10分钟后，每管加入0.5-5毫升的LB培养基，在25-38℃水浴或培养箱中温浴20-120分钟，将50-200微升已转化的感受态细胞涂布到含有相应抗生素的LB固体平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收，倒置平板，于25-38℃培养箱中培养10-30小时后，即可出现重组菌的菌落，完成质粒的转化。
3、从转化后的重组大肠杆菌E.coli JM105(pBR322-vgb)的固体平板上挑取单菌落，接种于装有1-10毫升的LB液体培养基的试管中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养6-15小时；对收获的菌体采用试剂盒法提取并纯化其中的质粒pBR322-vgb，从而得到扩增的含透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pBR322-vgb。
4、采用限制性核酸内切酶对质粒pBR322-vgb进行透明颤菌血红蛋白(vgb)基因片段的酶切分离，酶切温度为25-38℃，时间为1-5小时。酶切后的vgb片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。
5、将酶切收获的透明颤菌血红蛋白基因(vgb)与PHB合成基因(phbCAB)及λ噬菌体裂解基因(S-RRz)采用常规克隆操作进行基因重组，并引入宿主大肠杆菌和真养产碱杆菌中，构建多功能基因工程菌。
6、在含葡萄糖的LB液体培养基中对新构建的基因工程菌进行培养：种子液为试管培养液，接种量为1％-10％，培养基体积为30-100毫升，pH6.0-8.0，摇床转速为150-300转/分钟，培养温度为35-38℃。当细胞生长约24-36小时后，用离心机以4000-8000转/分钟的转速，离心10-20分钟，弃上清液，收获离心后的细胞。
7、用紫外照射、电击、冻融等物理方法或乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液和氯仿等化学试剂诱导细胞裂解，释放出胞内的聚β-羟基丁酸酯。菌悬液在离心机上以4000-8000转/分钟离心10-20分钟，收集沉淀，于60-80℃烘箱中烘干24-48小时，即可获得本发明的产品聚β-羟基丁酸酯。
利用本发明构建的能够在有效表达透明颤菌血红蛋白合成基因(vgb)的同时，还能分别或同时表达λ噬菌体裂解基因(S-RRz)以及PHB合成基因(phbCAB)的多功能基因工程菌，可以从分子水平上提高菌体细胞对氧气的利用率，从而实现菌体细胞的高密度发酵培养和PHB产品的大量积累，部分菌株还可以在此基础上进一步实现菌体细胞的可诱导裂解破壁，从而释放出胞内的PHB产品。因此可以说，利用透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的分子克隆实现PHB的高密度发酵培养，同时利用λ噬菌体裂解基因(S-RRz)的表达实现菌体细胞可诱导裂解破壁的方法，必将在发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。
附图说明：
图1质粒pBR322-vgb的基因谱图
下面介绍本发明的实施例：
实施例1：
(1)首先制备大肠杆菌E.coli JM105的感受态细胞：从大肠杆菌Ecoli JM105的固体平板上挑取单菌落，接种于装有5毫升的LB液体培养基的试管中，在37℃的温度下于250转/分钟的摇床上培养10小时；取0.5毫升培养液接种于装有50毫升LB液体培养基的250毫升三角瓶中，在37℃的温度下于250转/分钟的摇床上培养至吸光度OD600为0.4-0.6；将培养液转入预冷的已灭菌50毫升离心管中，冰浴冷却10分钟后于4℃的离心机上以4000转/分钟的转速离心10分钟；倒出培养液，在无菌条件下将管倒置1分钟以使残留的培养液流尽；以10毫升用冰预冷的0.1mol/L CaCl2小心重悬每份沉淀，冰浴放置15分钟；按上述同样条件进行离心，弃上清；用2毫升用冰预冷过的0.1mol/L CaCl2小心重悬每份沉淀，最后在冰上放置片刻即成；将制好的感受态细胞转移到已灭菌的1.5毫升离心管中，每管200微升，可于4℃冰箱中储存24～48小时，待用。
(2)携带透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pBR322-vgb由上海生物工程研究中心赠送。从冰箱中取出盛有大肠杆菌E.coli JM105感受态细胞的1.5毫升离心管，放在冰上融化后，加入体积约6微升，质量约30纳克的pBR322-vgb质粒DNA进行质粒的转化。轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30分钟。将管放到42℃的循环水浴中，放置90秒，再冰浴2分钟后，每管加入0.8毫升的LB培养基，在37℃水浴或培养箱中温浴45分钟。将约100微升已转化的感受态细胞涂布到含有100微克/毫升抗生素氨苄青霉素的LB固体平板上。将平板置于室温下直至液体被吸收。倒置平板，于37℃培养箱中培养12-16小时后，即可出现重组菌E.coli JM105(pBR322-vgb)的菌落。
(3)从转化后的重组大肠杆菌E.coli JM105(pBR322-vgb)的固体平板上挑取单菌落，接种于装有3毫升的LB液体培养基的试管中，在37℃的温度下于250转/分钟的摇床上培养10小时；对收获的菌体采用试剂盒法提取并纯化其中的质粒pBR322-vgb，从而得到大量扩增的含透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pBR322-vgb。
(4)质粒pBR322-vgb的长度为5.76kb，vgb基因长度为1.4kb，且该片段可用限制性内切酶HindIII和SalI从质粒上酶切下来。因为HindIII和SalI在质粒pBR322-vgb上均只有一个酶切位点，故可一次酶切分离出vgb片段(如图1)。酶切时质粒pBR322-vgb及限制酶的用量比为：
质粒pBR322-vgb 5μl
HindIII(10U/μl) 1μl
SalI(10U/μl) 2μl
BufferC(10×) 2μl
无菌水 10μl
总体积 20μl
酶切温度为37℃，时间为3小时。酶切后的vgb片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。实验中所用各种酶及酶切缓冲液均为Promega公司产品。酶切后的vgb片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳法(J.萨姆布鲁克等著，分子克隆实验指南，科学出版社，1996)回收。
(5)同样用限制性核酸内切酶HindIII和SalI酶切携带λ噬菌体裂解基因(S-RRz)及PHB合成基因(phbCAB)的质粒载体pTU14(本实验室构建)，其酶切位点位于多克隆位点上。用T4噬菌体DNA连接酶将vgb基因片段连接到酶切后的质粒载体pTU14上，进行基因重组，得到能成功表达三种基因的多功能质粒载体pTU14-vgb(Ampr，氨苄青霉素抗性)。质粒pTU14酶切时限制酶及质粒的配比为：
质粒pTU14 2μl
HindIII(10U/μl) 1μl
SalI(10U/μl) 2μl
BufferC(10×) 2μl
无菌水 13μl
总体积 20μl质粒pTU14-vgb连接时连接酶和质粒的配比为：
pTU14质粒DNA片段 3μl
vgb基因片段 6μl
T4噬菌体DNA连接酶 1μl
T4连接酶Buffer(10×) 2μl
无菌水 8μl
总体积 20μl连接反应在16℃或4℃温育过夜即可完成。连接后的质粒pTU14-vgb再按照上述感受态细胞制备及质粒转化等方法，转入感受态大肠杆菌E.coli JM105中，进一步构建出多功能基因工程菌株E.coli JM105(pTU14-vgb)。
(6)在含葡萄糖的LB培养基中对重组菌进行分批培养。接种前加入100微克/毫升的氨苄青霉素和约20克/升的葡萄糖。种子液为试管培养液，10％接种量接种于300毫升三角瓶中，装液量为1/6，pH7.0，摇床转速为250转/分钟，培养温度为37℃。当细胞生长约24-36小时后，用离心机以4000转/分钟的转速，离心15分钟，弃上清液，收获离心后的细胞。
(7)用2mM的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液诱导细胞裂解，释放出胞内的聚β-羟基丁酸酯。在离心机上以4000转/分钟离心15分钟，收集沉淀，于80℃烘箱中烘干48小时，即可获得PHB产品。
实施例2：
(1)同实施例1中的(1)，制备大肠杆菌E.coli JM105的感受态细胞。
(2)同实施例1中的(2)，将携带透明颤菌血红蛋白基因(vgb)片段的质粒载体pBR322-vgb转入大肠杆菌E.coli JM105中。
(3)同实施例1中的(3)，扩增质粒pBR322-vgb。
(4)同实施例1中的(4)，酶切分离质粒pBR322-vgb，获得长为1.4kb的透明颤菌血红蛋白基因片段vgb。
(5)以限制性核酸内切酶HindIII和SalI酶切质粒pTZ18u-PHB(Ampr，氨苄青霉素抗性)(来源于中国农业大学)，其酶切位点位于多克隆位点上。用T4噬菌体DNA连接酶将vgb基因片段连接到酶切后的质粒载体pTZ18u-PHB上，得到能够同时表达PHB合成基因(phbCAB)及透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的新质粒pTZ18u-PHB-vgb(Ampr，氨苄青霉素抗性)。在进行酶切及连接反应时，各种限制酶、连接酶及不同质粒的配比和反应条件基本同实施例1。连接后的质粒pTZ18u-PHB-vgb一部分进行琼脂糖凝胶电泳以验证质粒大小；另一部分转入感受态大肠杆菌E.coli JM105中，获得新的基因工程大肠杆菌：E.coli JM105(pTZ18u-PHB-vgb)。
(6)将新建重组菌E.coli JM105(pTZ18u-PHB-vgb)在含葡萄糖(20克/升)的LB培养基中进行分批培养，培养条件同实施例1中的(7)；当细胞生长约24小时后，用离心机以4000转/分钟的转速，离心15分钟，弃上清液，收获离心后的细胞。
(7)收集离心后的沉淀，置于80℃烘箱中烘干48小时，即可获得一定纯度的PHB产品。
实施例3：
将宿主菌改为大肠杆菌E.coli JM109，其它各项操作基本同实施例2，制备单质粒系统重组菌E.coli JM109(pTZ18u-PHB-vgb)；将其在含葡萄糖的LB培养基中进行约24小时的分批培养，即可收获一定纯度的PHB产品。
实施例4：
(1)制备真养产碱杆菌的感受态细胞，各项操作基本同实施例1中的(1)，只是将培养温度改为30℃。
(2)将携带透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pBR322-vgb转入感受态真养产碱杆菌A.eutrophus NCIMB11599中，质粒转化操作基本同实施例1中的(2)，只是将转化后涂布的重组菌A.eutrophus NCIMB11599(pBR322-vgb)的固体平板培养温度改为30℃，培养时间则一般为24小时。
(3)对重组真养产碱杆菌A.eutrophus NCIMB11599(pBR322-vgb)在含葡萄糖的LB培养基中进行摇瓶培养，培养条件基本同实施例1中的(7)，只是将培养温度改为30℃。当细胞生长约24小时后，用离心机以4000转/分钟的转速，离心15分钟，弃上清液，收获离心后的细胞。
(4)收集离心后的沉淀，置于80℃烘箱中烘干48小时，即可获得一定纯度的PHB产品。
实施例5：
(1)同实施例1中的(1)，制备大肠杆菌E.coli JM105的感受态细胞。
(2)将pSC101型严紧型质粒pWSK129-vgb(Kanr，卡那霉素抗性)(来源于上海生物工程研究中心)和pTU14(Ampr，氨苄青霉素抗性)同时转入感受态E.coli JM105中，构建双质粒系统多功能基因重组菌。各项操作基本同实施例1中的(2)，只是将约100微升已转化的感受态细胞涂布到同时含有卡那霉素抗性(10微克/毫升)和氨苄青霉素抗性(100微克/毫升)的LB固体平板上，置于37℃培养箱中培养约16小时，即可出现双质粒基因重组菌E.coli JM105(pTU14，pWSK129-vgb)，Ampr，Kanr的菌落。
(3)挑取重组菌E.coli JM105(pTU14，pWSK129-vgb)的一个单菌落，接种于装有5毫升LB液体培养基的试管中，在37℃的温度下于250转/分钟的摇床上培养10小时；再以10％接种量接种于装液量为1/6的300毫升三角瓶中进行摇瓶培养。培养条件同实施例1中的(7)；当细胞生长约24小时后，用离心机以4000转/分钟的转速，离心15分钟，弃上清液，收获离心后的细胞。
(4)收集离心后的沉淀，置于80℃烘箱中烘干48小时，即可获得一定纯度的PHB产品。
实施例6：
将宿主菌改为真养产碱杆菌A.eutrophus NCIMB 11599，而两种质粒则分别为只携带透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pWSK129-vgb(Kanr，卡那霉素抗性)和只携带λ噬菌体裂解基因(S-RRz)的质粒pUC18-S-RRz(Ampr，氨苄青霉素抗性)，构建双质粒系统重组菌A.eutrophus NCIMB 11599(pUC18-S-RRz，pWSK129-vgb)，Ampr，Kanr；培养温度改为30℃，其它各项操作均基本同实施例5，经过约30小时的摇瓶培养，最后即可收获一定纯度的PHB产品。
实施例7：
将宿主菌改为大肠杆菌E.coli HMS174，而两种质粒则分别为只携带透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pWSK129-vgb (Kanr，卡那霉素抗性)和只携带PHB合成基因(phbCAB)的质粒pTZ18u-PHB(Ampr，氨苄青霉素抗性)，构建双质粒系统重组菌E.coliHMS174(pTZ18u-PHB，pWSK129-vgb)，Ampr，Kanr；其它各项操作基本同实施例5，经过约24小时的摇瓶培养，即可收获一定纯度的PHB产品。
实施例8：
(1)把透明颤菌血红蛋白基因(vgb)用同源基因交换法插入大肠杆菌E.coli JM105的染色体中而得到的苏氨酸营养缺陷型菌株VG1，由上海生物工程研究中心获得。首先制备大肠杆菌菌株VG1的感受态细胞，制备方法基本同实施例1中的(1)。
(2)将本实验室构建的携带PHB合成基因(phbCAB)和λ噬菌体裂解基因(S-RRz)的质粒pTU14(Ampr，氨苄青霉素抗性)转入VG1感受态细胞中，质粒转化的方法基本同实施例1中的(2)。
(3)在含葡萄糖的LB培养基中对重组菌进行分批培养。接种前加入抗生素氨苄青霉素钠(100微克/毫升)和葡萄糖(20克/升)。种子液为试管培养液，10％接种量接种于300毫升三角瓶中，装液量为1/6。培养条件为：pH7.0，摇床转速为250转/分钟，培养温度为37℃。当细胞生长约58小时后，用离心机以4000转/分钟的转速，离心15分钟，弃上清液，收获离心后的细胞；此时，VG1(pTU14)在摇瓶中的细胞浓度可高达10.2g/L，PHB浓度，PHB百分含量及其产率分别为8.54g/L，83.76％和0.15g/L/h；且PHB对葡萄糖的转化率可以高达0.43(理论值为0.48)。
(4)用2mM的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液诱导细胞裂解，释放出胞内的聚β-羟基丁酸酯。在离心机上以4000转/分钟离心15分钟，收集沉淀，于80℃烘箱中烘干48小时，PHB产品纯度可从83.76％提高到94.6％。
实施例9：
本实施例的目的在于初步验证重组菌VG1(pTU14)的生长能力及PHB颗粒的积累能力。其中，各项操作基本均同实施例8，只是将重组菌的分批培养改为补料分批培养：补料液为500g/L的高浓葡萄糖，培养基中初糖浓度为20克/升，并使培养基中的补料糖浓度为10克/升；在每次补料时，均将菌液的pH值调到7.0。结果表明，经过52小时的补料培养(仅在摇瓶培养约24小时和36小时的时候分别补加葡萄糖一次)，重组菌VG1(pTU14)的菌体浓度可高达25.9g/L，这是迄今为止报道的利用大肠杆菌生产PHB过程中的摇瓶最高值；此外，菌体细胞中的PHB含量可高达95％以上。将收获的菌体细胞用2mM的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液诱导裂解，释放出胞内的聚β-羟基丁酸酯。在离心机上以4000转/分钟离心15分钟，收集沉淀，于80℃烘箱中烘干48小时，PHB产品纯度可以高达99％以上。
Claims (1)
1、一种构建多功能基因工程菌生产聚β-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，该方法由以下步骤组成：
(1)、首先采用分子克隆操作制备大肠杆菌和真养产碱杆菌的感受态细胞：从菌体的固体平板上挑取单菌落，接种于装有3-10毫升的LB液体培养基的试管中，液体培养基的组成为：酵母浸膏粉：5g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：10/gL，pH7.0，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养6-15小时；取0.1-1.0毫升培养液接种于装有50-100毫升LB液体培养基的三角瓶中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养至吸光度OD600为0.3-1.0；将培养液转入预冷的已灭菌离心管中，冰浴冷却5-20分钟后于2-6℃的离心机上以3000-8000转/分钟的转速离心5-20分钟；倒出培养液，在无菌条件下将管倒置1-3分钟以使残留的培养液流尽；加5-25毫升用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份沉淀，冰浴放置5-25分钟；于2-6℃的离心机上以3000-8000转/分钟的转速离心5-20分钟，弃上清；用1-5毫升用冰预冷过的0.1mol/L CaCl2再次重悬每份沉淀，最后在冰上放置片刻即得到感受态细胞，将制好的感受态细胞转移到已灭菌的1.5毫升离心管中，每管100-500微升；
(2)、在第一步制备好的感受态细胞中加入体积小于10微升、质量小于50纳克的携带透明颤菌血红蛋白基因的质粒pBR322-vgb，进行质粒的转化：混匀内容物，在冰上放置10-50分钟；接下来在42℃的循环水浴中，放置30-150秒，再冰浴1-10分钟后，每管加入0.5-5毫升的LB培养基，在25-38℃水浴或培养箱中温浴20-120分钟，将50-200微升已转化的感受态细胞涂布到含有相应抗生素的LB固体平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收，倒置平板，于25-38℃培养箱中培养10-30小时后，即出现重组菌的菌落，完成质粒的转化；
(3)、从转化后的重组大肠杆菌E.coli JM105-pBR322-vgb的固体平板上挑取单菌落，接种于装有1-10毫升的LB液体培养基的试管中，在25-38℃的温度下于150-300转/分钟的摇床上培养6-15小时；对收获的菌体采用试剂盒法提取并纯化其中的质粒pBR322-vgb，从而得到扩增的含透明颤菌血红蛋白基因的质粒pBR322-vgb；
(4)、采用限制性核酸内切酶对质粒pBR322-vgb进行透明颤菌血红蛋白基因片段的酶切分离，酶切温度为25-38℃，时间为1-5小时，酶切后的vgb片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收；
(5)、将酶切收获的透明颤菌血红蛋白基因与PHB合成基因及λ噬菌体裂解基因采用常规克隆操作进行基因重组，并引入宿主大肠杆菌和真养产碱杆菌中，构建多功能基因工程菌；
(6)、在含葡萄糖的LB液体培养基中对新构建的基因工程菌进行培养：种子液为试管培养液，接种量为1％-10％，培养基体积为30-100毫升，pH6.0-8.0，摇床转速为150-300转/分钟，培养温度为35-38℃，当细胞生长约24-36小时后，用离心机以4000-8000转/分钟的转速，离心10-20分钟，弃上清液，收获离心后的细胞；
(7)、用紫外照射、电击、冻融中的任何一种物理方法或乙二胺四乙酸二钠盐溶液和氯仿等化学试剂诱导细胞裂解，释放出胞内的聚β-羟基丁酸酯，菌悬液在离心机上以4000-8000转/分钟离心10-20分钟，收集沉淀，于60-80℃烘箱中烘干24-48小时，即获得本发明的产品聚β-羟基丁酸酯。
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