CN107602367A

CN107602367A - 4’‑羟基‑3’‑甲氧基查尔酮衍生物、其制备方法以及在抗肿瘤中的应用

Info

Publication number: CN107602367A
Application number: CN201710787804.4A
Authority: CN
Inventors: 杨宝峰; 董乃维; 张勇
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2037-09-04
Also published as: CN107602367B

Abstract

本发明公开了一类4’‑羟基‑3’‑甲氧基查尔酮衍生物、其制备方法以及在抗肿瘤中的应用。所述的4’‑羟基‑3’‑甲氧基查尔酮衍生物的化学结构式如下式Ⅰ所示，其中，R₁、R₂分别独立选自氢、羟基或C_1‐3烷氧基。本申请首次对一类4’‑羟基‑3’‑甲氧基查尔酮类衍生物的抗肿瘤活性进行了研究，对其进行了体外和体内抑制肿瘤活性的测试，结果显示这类衍生物对人肝癌细胞HepG2，人结肠癌细胞SW620和人肺癌细胞A549有较强的抑制活性。在PLC5肝癌裸鼠模型的体内实验中，活性优于对照药品5‑氟尿嘧啶。本发明的提出为肿瘤的治疗提供了一种新的有效的技术手段。

Description

4’-羟基-3’-甲氧基查尔酮衍生物、其制备方法以及在抗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及一类查尔酮衍生物及其制备方法和应用。特别涉及一类4’-羟基-3’-甲氧基查尔酮衍生物、其制备方法以及在抗肿瘤中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

查耳酮类化合物是一类主要由芳香醛与芳香酮通过Claisen-Schmidt缩合反应生成，结构中含有1,3-二苯基丙烯酮结构的化合物。查耳酮类化合物的二个苯基上有不同取代基团，表现出不同的生物活性。其中抗肿瘤类查耳酮化合物多具备2’-羟基。未见到有抗肿瘤活性的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮衍生物报道。且4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮衍生物在体外肿瘤细胞活性筛选中，表现明显的抗肿瘤细胞活性。在PLC5肝癌裸鼠模式的体内实验中，4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮衍生物抑制肿瘤活性强于对照药品5-氟尿嘧啶。

发明内容

本发明的目的在于提供一类具有抗肿瘤活性的查耳酮及其制备方法。

本发明的一类4’-羟基-3’-甲氧基查尔酮衍生物，其化学结构式如下式Ⅰ所示：

其中，R₁、R₂分别独立选自氢、羟基或C_1-3烷氧基。

其中，优选的，式Ⅰ中，R1为氢或甲氧基，R2为甲氧基。

其中，优选的，所述的衍生物为4’-羟基-3’-甲氧基-3-甲氧基查耳酮或4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的4’-羟基-3’-甲氧基查尔酮衍生物的方法，包括以下步骤：式II所示的芳香酮和式III所示的芳香醛在氢氧化钠催化下，乙醇作溶剂，室温反应48小时，反应液用稀盐酸调节pH到中性，加水析出结晶，抽滤，少量水洗，干燥，即得式I所示的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物。

其中，R₁、R₂分别独立选自氢、羟基或C_1-3烷氧基。

本发明首次证实4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物的抗肿瘤活性。在体外的人肝癌细胞HepG2，人结肠癌细胞SW620和人肺癌细胞A549活性筛选实验中，抗肿瘤活性强于对照品5-氟尿嘧啶。在PLC5肝癌裸鼠模式的体内实验中，4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮也表现出很强的抑制肿瘤活性，相同疗效下，剂量不及对照药品5-氟尿嘧啶的三十分之一。

因此，更进一步的，本发明还提出了所述的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

其中，优选的，所述的肿瘤包括肝癌、结肠癌及肺癌。

附图说明

图1为4’-羟基-3-甲氧基-3’-甲氧基查耳酮的氢核磁共振谱图；

图2为4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮的氢核磁共振谱图

图3为4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮在小鼠肝癌模型中对肿瘤生长影响的时间曲线(注：6x为4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的说明验证，所有实施例仅用于例证本发明，不限制本发明的保护范围。

实施例1 4’-羟基-3’-甲氧基-3-甲氧基查耳酮的制备

具体的制备步骤如下：

取3.388g 4-羟基-3-甲氧基苯乙酮和2.20mL 3-甲氧基苯甲醛，溶于150mL乙醇，滴加12mL50％NaOH溶液，反应48h。反应液用稀盐酸调pH至中性后，加2倍量的水析出沉淀，抽滤，得黄色固体，少量水洗。干燥，称重，得2.663g浅黄色4’-羟基-3’-甲氧基-3-甲氧基查耳酮固体。收率为46.9％。

合成路线如下：

4’-羟基-3’-甲氧基-3-甲氧基查耳酮：分子式：C₁₇H₁₆O₄；分子量:284；产率:46.9％；黄色固体；m.p.111-113℃；IR(cm^-1):3414(OH),1656(C＝O),1602,1577,1517(C＝C),1282,1203(C-O),1022(ArH),783(＝CH)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm 7.77(d,J＝15.6Hz,1H,CH-9),7.65(d,J＝10.7Hz,2H,CH-5,CH-1),7.53(d,J＝15.6Hz,1H,CH-8),7.34(t,J＝7.8Hz,1H,CH-12),7.25(d,J＝8.0Hz,1H,CH-11),7.16(s,1H,CH-15),7.00(d,J＝8.1Hz,1H,CH-13),6.97(d,J＝8.0Hz,1H,CH-4),6.10(s,1H,HO-18),3.99(s,3H,CH₃O-19),3.87(s,3H,CH₃O-21).4’-羟基-3-甲氧基-3’-甲氧基查耳酮的氢核磁共振谱图如图1所示。

实施例2 4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮的制备

具体的制备步骤如下：

取0.828g 4-羟基-3-甲氧基苯乙酮和0.834g 3,4-二甲氧基苯甲醛，溶于40mL乙醇，滴加1.5mL50％NaOH溶液，反应48h。反应液用稀盐酸调pH至中性后，加1倍量的水析出沉淀，抽滤，得黄色固体，少量水洗。干燥，称重，得0.655g浅黄色4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮固体。收率为41.7％。

合成路线如下：

4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮：分子式：C₁₈H₁₈O₅；分子量:314；产率:41.7％；浅黄色固体；m.p.155-158℃；IR(cm^-1):3435(O-H),2833(OCH₃),1653(C＝O),1585,1514(C＝C),1271,1136(C-O),1020(ArH),819(＝CH)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm 7.77(d,J＝15.6Hz,1H,CH-9),7.65(d,J＝9.7Hz,2H),7.42(d,J＝15.4Hz,1H,CH-8),7.25(d,J＝11.1Hz,2H),7.17(s,1H,CH-15),7.00(d,J＝8.0Hz,1H,CH-4),6.91(d,J＝8.2Hz,1H,CH-12),6.10(s,1H,HO-18),4.02–3.91(t,9H,CH₃O-19,21,23).4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮的氢核磁共振谱图如图2所示。

实施例3本发明提供的两种化合物的抗肿瘤活性测定

1.溶液的配制：

10％FBS培养液的配制：购买HyClone RPMI Medium Modified 1640培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的双抗溶液，培养基的配制在超净工作台上进行，后放置冰箱4℃保存。

PBS缓冲液的配制：PBS磷酸缓冲液粉末，加入去离子水，充分溶解，高压灭菌后放置冰箱4℃保存。

MTT溶液的配制：MTT干粉0.25g，溶于50mLPBS缓冲液中，用0.22uM滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。

药品母液配制方法：将药物溶于40uL DMSO中，加入2mL10％FBS，混合均匀，取400uL混合液稀释10倍，配制成4mL 200uM浓度药物母液。

2.肿瘤细胞

本发明抗肿瘤活性测定所用3种肿瘤细胞：人肝癌细胞HepG2，人结肠癌细胞SW620和人肺癌细胞A549。

3.抗肿瘤活性测定

3.1抗人肝癌细胞HepG2的活性测试

HepG2细胞使用的培养液为含1％双抗和10％的胎牛血清的PRMI1640细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO₂的恒温培养箱。具体步骤：

(1)取96孔板，边缘孔用无菌PBS充填，每孔加入100uL细胞悬液(细胞悬液浓度为50000个/mL，每孔约5000个细胞)。

(2)加完细胞的96孔板放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药。

(3)将药品母液分别稀释不同倍数，配制成2uM、20uM、50uM、100uM浓度的药物溶液，加入到已贴壁细胞板的相应孔中，调整每孔的浓度分别为1uM、10uM、25uM、50uM、100uM，37℃恒温培养箱孵育48h。

(4)药物作用结束后，每孔加入20uL MTT(5mg/mL)，培养3-4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150uL DMSO，37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟，之后用酶标仪检测490nm下各孔的OD值。

(6)根据OD值计算2种查耳酮和5-氟尿嘧啶的IC₅₀值。

3.2抗人结肠癌细胞SW620的活性测试

操作方法同人肝癌细胞HepG2活性测试。

3.3抗人肺癌细胞A549的活性测试

操作方法同人肝癌细胞HepG2活性测试。

4.结果

本发明提供的2种4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮衍生物的抗肿瘤细胞活性测试结果，如下表1所示：

表1 4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮衍生物的抗肿瘤活性测试结果

从上表结果可以看出本发明涉及的2种4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮衍生物，有明显的抗肿瘤细胞活性。其中，这2种化合物的抗肝癌和结肠癌活性均明显优于对照药品5-氟尿嘧啶。

实施例4 4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮在肝癌小鼠体内的活性测定

1.肝癌细胞的处理

将复苏的PLC5细胞加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5％CO₂含量的培养箱中培养。细胞覆盖率达到80％时，使用0.25％胰酶消化，磷酸盐缓冲液清洗细胞，重新加入新鲜的培养液。继续扩增培养细胞，直到数量达到实验需求。

2.肝癌小鼠模型制备及分组

取4～6周龄雄性SPF级BALB/c nu裸鼠30只，皮下注射PLC5肿瘤细胞(5×10⁶个/只)，一周后皮下肿瘤形成。测量形成的肿瘤体积，将裸鼠随机进行分组。全部裸鼠分为五组，分别为阴性对照组、阳性对照组(氟尿嘧啶组)、4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮高、中、低剂量组。

3.实验步骤

培养PLC5肝癌细胞，当细胞覆盖率达到80％，数量达到实验所需时，收集细胞，制成浓度为5×10⁷个/ml的细胞悬液。将细胞悬液注射到裸鼠体侧髋关节皮下，注射体积为110μL。肿瘤形成后，根据实验设计对裸鼠进行分组，依次是对照组、阳性对照组、4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮高、中、低剂量组。根据分组情况，分别给予腹腔注射不同剂量的不同药物。裸鼠给药后，每隔24小时观察小鼠的生理状态、体重、肿瘤形态和大小的变化。给药后两周，处死裸鼠，分离肿瘤，保存于-80℃备用，根据实验数据评价药物的肿瘤生长抑制作用。给药剂量如下表2所示(注：6x为4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮，以下同)：

表2 4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮及5-氟尿嘧啶给药剂量

4.各组药物对小鼠肿瘤体积的影响

通过4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮对肿瘤生长影响曲线(图3)可以发现，与阴性对照组比较，各个剂量组的4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮能够显著抑制肿瘤的生长。各个剂量组之间的抑制效果也没有显著性差别，说明4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮在较大剂量范围内杀伤肿瘤的效果相近。在给药前2周内，4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮的高中低三个剂量组与5-氟尿嘧啶组相当，由于4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮的低剂量组的浓度不及5-氟尿嘧啶的三十分之一。因此，4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮的抗肿瘤活性明显优于5-氟尿嘧啶。

以上这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.4’-羟基-3’-甲氧基查尔酮衍生物，其特征在于，所述衍生物的化学结构式如下式Ⅰ所示：

其中，R₁、R₂分别独立选自氢、羟基或C_1-3烷氧基。

2.如权利要求1所述的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物，其特征在于，式Ⅰ中，R₁为氢或甲氧基，R₂为甲氧基。

3.如权利要求1或2所述的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物，其特征在于所述的衍生物为4’-羟基-3’-甲氧基-3-甲氧基查耳酮或4’-羟基-3’-甲氧基-3,4-二甲氧基查耳酮。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述的4’-羟基-3’-甲氧基查尔酮衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：式II所示的芳香酮和式III所示的芳香醛在氢氧化钠催化下，乙醇作溶剂，室温反应48小时，反应液用稀盐酸调节pH到中性，加水析出结晶，抽滤，少量水洗，干燥，即得式I所示的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物。

其中，R₁、R₂分别独立选自氢、羟基或C_1-3烷氧基。

5.权利要求1-3任一项所述的4’-羟基-3’-甲氧基查耳酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述的肿瘤包括肝癌、结肠癌及肺癌。