CN107589187A - 一种烟草中残留抑芽丹的提取方法及测定方法 - Google Patents

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本发明涉及一种烟草中残留抑芽丹的提取方法及测定方法，属于烟草中农药残留检测技术领域。本发明烟草中残留抑芽丹的提取方法，包括以下步骤：将烟末样品与盐酸在100～150℃条件下磁力搅拌萃取1～3h，冷却至室温后离心，然后将上清液过柱净化，再用水洗脱即得。本发明烟草中残留抑芽丹的提取方法，无需进行回流，操作简便，过程简单、快速，提取效率高，适用于烟草样品中残留抑芽丹的提取，与国标方法的测定结果一致性好。

Description

一种烟草中残留抑芽丹的提取方法及测定方法
技术领域
本发明涉及一种烟草中残留抑芽丹的提取方法及测定方法，属于烟草中农药残留检测技术领域。
背景技术
抑芽丹，又称青鲜素、马来酰肼、顺丁烯二酰肼，是一种植物生长调节剂，被广泛应用于烟草以抑制腋芽生长。虽然现今并无确切的研究成果证明抑芽丹的使用能够诱发癌症，但已经证实大剂量地使用抑芽丹会导致基因突变。在CORESTA制定的指导性残留限量(GRLs)和我国烟草总公司企业标准《YQ 50-2014烟叶农药最大残留限量》中，对抑芽丹在烟草中的最大残留限量均定为80mg/kg。抑芽丹施用于烟草后，可经叶面角质层吸收而进入植株，其中一部分作为游离态存在，另一部分则以糖苷结合态存在。结合态的抑芽丹很难被直接萃取，因此，有效地提取烟草中残留的抑芽丹是对其准确测定的前提。
目前报道的烟草中残留抑芽丹残留的提取方法最早为由国际标准ISO 4876-1980方法(被转化为GB/T 19611-2004)中的水蒸气蒸馏方法，该方法将样品在碱液中煮沸后，加入锌粒，由新生态氢将抑芽丹还原成丁二酸酰肼，并随后水解，水蒸气蒸馏释放出联氨，分光光度法测定其与4-二甲基氨基苯甲醛形成的黄色化合物。该前处理方法较复杂，对蒸馏装置要求较高，且强碱的大量使用对玻璃仪器腐蚀严重。近年来，开发了许多以酸化甲醇直接提取、混合有机溶剂直接提取、盐酸溶液加热回流提取、盐酸溶液微波辅助萃取的前处理方法从原理上对国际标准的前处理方法进行改进。相比之下，盐酸溶液的提取效果较好，回收率较高，因此应用也最为广泛。但这些基于盐酸溶液提取的前处理方法中需要加热回流装置或者微波萃取装置。
2004年，杨昀，刘玉林等人在《分析化学》第32卷第3期第410页发表的《烟叶和土壤中抑芽丹残留分析方法及应用研究》公开了一种烟叶中抑芽丹残留的分析方法，其中样品前处理为向烟叶样品中加入盐酸于沸水浴中回流60min进行萃取，前处理过程繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草中残留抑芽丹的提取方法，以解决现有技术烟草中残留抑芽丹的提取过程复杂的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种烟草中残留抑芽丹的测定方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种烟草中残留抑芽丹的提取方法，包括以下步骤：
将烟末样品与盐酸在100～150℃条件下磁力搅拌萃取1～3h，冷却至室温后离心，然后将上清液过柱净化，再用水洗脱即得。
所述烟末样品为将烟草样品研磨成烟末。
所述过柱为过C18固相萃取柱。
所述盐酸的浓度为2～4mol/L。所述盐酸的浓度优选为3～4mol/L。进一步优选为4mol/L。
上述每2g烟末样品对应加入20mL盐酸。
所述磁力搅拌的速度为300rpm。
上述磁力搅拌萃取优选为：在100～150℃油浴条件下磁力搅拌萃取1h。
所述离心为以10000rpm的转速离心5min。
上述用水洗脱后过滤即得。
一种烟草中残留抑芽丹的测定方法，包括以下步骤：
将烟末样品与盐酸、氘代抑芽丹内标溶液在100～150℃条件下磁力搅拌萃取1～3h，冷却至室温后离心，然后将上清液过柱净化，再用水洗脱，过滤得待测液，将待测液进行超高效液相色谱-串联质谱测定。
所述过柱为过C18固相萃取柱。
上述每2g烟末样品对应加入20mL盐酸，所述盐酸的浓度为2～4mol/L。
所述盐酸的浓度优选为3～4mol/L。进一步优选为4mol/L。
所述氘代抑芽丹内标溶液的浓度为200μg/mL。
上述每2g烟末样品对应加入100μL氘代抑芽丹内标溶液。
所述磁力搅拌的速度为300rpm。
上述磁力搅拌萃取优选为：在100～150℃油浴条件下磁力搅拌萃取1h。
所述离心为以10000rpm的转速离心5min。
所述过滤为采用0.45μm的水相滤膜过滤。
所述超高效液相色谱-串联质谱测定的条件为：色谱柱：Hypercarb PorousGraphitic Carbon液相色谱柱；柱温：30℃；进样量：1μL；流动相：流动相A：含1％HAc的水，流动相B：含1％HAc的乙腈，进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；质谱条件：离子源：电喷雾电离源，温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流速：650L/h；反吹气流速：50L/h；监测模式：多反应监测。
上述含1％HAc的水是指HAc与水的体积比为1:99。
上述含1％HAc的乙腈是指HAc与乙腈的体积比为1:99。
所述梯度洗脱的洗脱梯度为：0min，100％A；8min，85％A，15％B；15min，85％A，15％B；16min，10％A，90％B；20min，10％A，90％B；21min，100％A；36min，100％A。
本发明的烟草中残留抑芽丹的提取方法，将烟末样品与盐酸在100～150℃条件下磁力搅拌萃取1～3h，冷却至室温后离心，然后将上清液过柱净化，再用水洗脱即得，无需进行回流，操作简便，过程简单、快速，提取效率高，适用于烟草样品中抑芽丹残留的提取。
本发明的烟草中残留抑芽丹的测定方法，先用盐酸对烟草中的抑芽丹进行提取，然后再进行超高效液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。本发明的烟草中残留抑芽丹的测定方法简单、准确、精密度高。
附图说明
图1为实施例1烟草中残留抑芽丹的提取装置示意图；
图2为实施例1中标准工作溶液的色谱图，其中TIC为总离子流图，MH为抑芽丹，D2-MH为氘代抑芽丹；
图3为实施例1中样品待测液的色谱图，其中TIC为总离子流图，MH为抑芽丹，D2-MH为氘代抑芽丹；
图4为盐酸浓度的优化结果图；
图5为提取温度的优化结果图；
图6为提取时间的优化结果图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
仪器与试剂
超高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司)；
磁力加热搅拌器(德国IKA公司)；
Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；
抑芽丹标样和氘代抑芽丹(德国Dr.Ehrensorfer公司)；
甲醇、乙腈(色谱纯，美国J.T.Baker公司)，
37％盐酸(分析纯，天津北方试剂公司)；
烟末样品为抑芽丹国际共同实验JETS 16/2样品。
实施例1
本实施例的烟草中残留抑芽丹的提取方法，包括以下步骤：
称取2.00g(精确至0.01g)烟末样品于100mL的耐热螺口锥形瓶中，向瓶中加入20mL 4mol/L盐酸水溶液加入磁力搅拌子并盖上盖后，按照如图1所示的方式进行萃取，具体为将锥形瓶置于放置在磁力加热搅拌器上的油浴中，油浴温度为150℃，以300rpm的转速磁力搅拌提取1h，冷却至室温后，提取液以10000rpm的转速离心5min后，用C18固相萃取小柱对上清液进行净化，上样量为2mL，用2mL水洗脱，所得净化液经0.45μm水相滤膜过滤，即得。
本实施例的烟草中残留抑芽丹的测定方法，包括以下步骤：
1)待测液的制备
称取2.00g(精确至0.01g)烟末样品于100mL的耐热螺口锥形瓶中，向瓶中加入20mL 4mol/L盐酸水溶液和100μL 200μg/mL的氘代抑芽丹内标溶液，加入磁力搅拌子并盖上盖后，将锥形瓶置于放置在磁力加热搅拌器上的油浴中，油浴温度为150℃，以300rpm的转速磁力搅拌提取1h，冷却至室温后，提取液以10000rpm的转速离心5min后，用C18固相萃取小柱对上清液进行净化，上样量为2mL，用2mL水洗脱，所得净化液经0.45μm水相滤膜过滤，即得。
2)系列标准工作溶液的配制
储备液的制备：以水作为溶剂配制质量浓度约为200μg/mL的抑芽丹储备液和200μg/mL的氘代抑芽丹内标溶液。
系列标准工作溶液的配制：分别准确移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1.0mL和2.0mL的200μg/mL的抑芽丹储备液于不同的50mL的容量瓶中，分别加入100μL的200μg/mL的氘代抑芽丹内标溶液，以水稀释定容，得到系列标准工作溶液，对应的7级标准工作溶液中抑芽丹的浓度为80ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，抑芽丹的含量为4μg、10μg、20μg、40μg、100μg、200μg、400μg。
3)标准工作曲线的制作
将步骤2)所得7种浓度的系列标准工作溶液进行超高效液相色谱-串联质谱测定分析，以目标物的色谱峰面积与内标的色谱峰面积之比为纵坐标，以抑芽丹的浓度为横坐标进行回归分析，得到标准曲线及其回归方程。标准曲线为Y＝0.049655×X+0.043096。第五级标准工作溶液的色谱图如图2所示，其中TIC为总离子流图，MH为抑芽丹，D2-MH为氘代抑芽丹。
上述超高效液相色谱-串联质谱的测定条件为：色谱条件：色谱柱为HypercarbPorous Graphitic Carbon液相色谱柱(100mm×4.6mm,5μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；流动相：流动相A：含1％HAc的水，流动相B：含1％HAc的乙腈，进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；洗脱梯度如表1所示。
表1洗脱梯度
时间(min) A(％) B(％)
0 100 0
8 85 15
15 85 15
16 10 90
20 10 90
21 100 0
36 100 0
质谱条件：离子源：电喷雾电离源(ESI)，温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流速：650L/h；反吹气流速：50L/h；多反应监测模式(MRM)，详细参数见表2。
表2抑芽丹及氘代抑芽丹的UPLC-MS/MS MRM参数
*定量离子
4)待测液的超高效液相色谱-串联质谱测定
将步骤1)所得待测液进行超高效液相色谱-串联质谱测定，测定条件同步骤3)中超高效液相色谱-串联质谱的测定条件，待测液的色谱图如图3所示，其中TIC为总离子流图，MH为抑芽丹，D2-MH为氘代抑芽丹。将测定所得的目标分析物的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积之比代入步骤3)所得的标准曲线中，计算得到待测液中抑芽丹的含量。
实验例1
盐酸浓度对提取效果的影响研究：
分别用1mol/L、2mol/L、3mol/L盐酸水溶液对烟末样品进行提取，其它条件同实施例1，结果如图4所示。由图4可知，随盐酸浓度的增大，提取效率提高，最终确定的盐酸的最佳使用浓度为4.0mol/L。
实验例2
油浴温度对提取效果的影响研究：
将油浴温度分别设定为60℃、80℃、100℃、120℃对烟末样品进行提取，其它条件同实施例1，结果如图5所示。由图5可知，随温度的升高，提取效率增大，考虑到锥形瓶的耐受性，最终选取150℃为最佳提取温度。
实验例3
提取时间对提取效果的影响研究：
将磁力搅拌提取时间分别设为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，其它条件同实施例1，结果如图6所示。由图6内容可知，随着时间延长，提取效率增大，在1h后增幅不大，兼顾省时和提取效率，确定最佳提取时间为1h。
实验例4
分别以已报道的加热回流、水蒸气蒸馏和本发明的提取方法对抑芽丹国际共同实验的5个烟末样品中的抑芽丹进行提取，对前处理所得样品溶液进行UPLC-MS/MS分析测定抑芽丹含量，结果如表3所示。
表3不同前处理方式测定结果的比较(mg/kg)
由表3内容可知，本发明的提取方法对烟草中残留抑芽丹的提取效率高于已报道的加热回流法，且本方法与经典的国际标准方法中所采用的水蒸气蒸馏法测定结果的一致性好。
实验例5
对空白烟末样品按抑芽丹限量80mg/kg进行回收率实验，平行测定3次，得到的回收率在95.6～102.9％范围内。

Claims (10)

1.一种烟草中残留抑芽丹的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
将烟末样品与盐酸在100～150℃条件下磁力搅拌萃取1～3h，冷却至室温后离心，然后将上清液过柱净化，再用水洗脱即得。
2.根据权利要求1所述的烟草中残留抑芽丹的提取方法，其特征在于，所述过柱为过C18固相萃取柱。
3.根据权利要求1所述的烟草中残留抑芽丹的提取方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为2～4mol/L。
4.根据权利要求1所述的烟草中残留抑芽丹的提取方法，其特征在于，每2g烟末样品对应加入20mL盐酸。
5.一种烟草中残留抑芽丹的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
将烟末样品与盐酸、氘代抑芽丹内标溶液在100～150℃条件下磁力搅拌萃取1～3h，冷却至室温后离心，然后将上清液过柱净化，再用水洗脱，过滤得待测液，将待测液进行超高效液相色谱-串联质谱测定。
6.根据权利要求5所述的烟草中残留抑芽丹的测定方法，其特征在于，每2g烟末样品对应加入20mL盐酸，所述盐酸的浓度为2～4mol/L。
7.根据权利要求5所述的烟草中残留抑芽丹的测定方法，其特征在于，所述氘代抑芽丹内标溶液的浓度为200μg/mL。
8.根据权利要求5所述的烟草中残留抑芽丹的测定方法，其特征在于，所述过滤为采用0.45μm的水相滤膜过滤。
9.根据权利要求5所述的烟草中残留抑芽丹的测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-串联质谱测定的条件为：色谱柱：Hypercarb Porous Graphitic Carbon液相色谱柱；柱温：30℃；进样量：1μL；流动相：流动相A：含1％HAc的水，流动相B：含1％HAc的乙腈，进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；质谱条件：离子源：电喷雾电离源，温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流速：650L/h；反吹气流速：50L/h；监测模式：多反应监测。
10.根据权利要求9所述的烟草中残留抑芽丹的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱梯度为：0min，100％A；8min，85％A，15％B；15min，85％A，15％B；16min，10％A，90％B；20min，10％A，90％B；21min，100％A；36min，100％A。
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