CN107557138A - 一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及南极磷虾油的制备方法，具体涉及一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法。该方法包括自溶酶解、间歇式超声波辅助复合酶酶解法提取、脱除胆固醇工艺、脱氟蛋白工艺等步骤，本发明先利用南极磷虾体内的自溶酶进行自溶酶解，再利用间歇式超声波辅助复合酶酶解法对南极磷虾油进行提取，该方法操作便捷，得率较高；同时获得的南极磷虾油进行脱除胆固醇和含氟蛋白质的工艺，最终获得低胆固醇低氟的南极磷虾油产品，产品中磷脂含量高达42‑46％，EPA+DHA总量占总脂肪酸含量50％以上，此外还含有高含量的虾青素等生物活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及南极磷虾油的制备方法，具体涉及一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法。
背景技术
南极磷虾是世界上数量最大的生物资源之一。据统计，南极磷虾的生物量约为6-10亿吨，在不影响南极生态系统条件下南极磷虾的最大捕捞量约为5000万吨，是现今世界最具有开发价值的海洋生物资源。南极磷虾脂肪约占鲜重的0.5-3.6％，富含磷脂型态结合的ω-3高不饱和脂肪酸(包括DHA和EPA)，具有很好的生物学功能，因其高磷脂含量、高虾青素含量和高不饱和酸含量，使得南极磷虾油的生物活性优于深海鱼油。
目前，对南极磷虾油的提取方法主要包括酶解法、有机溶剂萃取法和超临界二氧化碳萃取法。酶解法是利用蛋白酶将蛋白质水解，使得蛋白质和油脂分离，从而分离获得油脂的方法，例如专利“一种南极磷虾油的制备方法”，公开号CN102559369A，利用南极磷虾自溶酶和外源酶分步酶解，并利用超声波辅助外源酶酶解，获得南极磷虾油，但外源酶仅为碱性蛋白酶单一酶，且超声波辅助过程仅在酶解反应前进行，使得酶解效率不是很高；又例如专利“水酶法制备南极磷虾油及其微胶囊和低氟南极磷虾肽的方法”，公开号CN104388176A，也是利用了碱性磷酸酶单一酶解法分离南极磷虾油，酶解效率较超声波辅助的单一酶解法更低。有机溶剂萃取法是利用相似相溶原理对南极磷虾油进行有机溶剂溶解萃取，再分离溶剂从而获得油脂的方法，常用的有机溶剂包括：乙醇、正已烷、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等，例如专利“从南极磷虾中提取高磷脂含量的虾油的方法”，公开号CN102041166A，利用非极性有机溶剂和极性有机溶剂分步萃取法获得高磷脂含量南极磷虾油；再例如专利“从鲜南极磷虾中提取高磷脂含量磷虾油的方法”，公开号CN104479850A，利用95％乙醇对南极磷虾进行2-4次提取，获得南极磷虾油，这种方法在提取过程中难免会带有有机溶剂残留，大大增加了食用风险。有机溶剂萃取时，经常要进行重复性萃取过程，以提高得率，使得提取过程复杂化；另外，分离有机溶剂和油脂往往要用到减压蒸馏，使得能耗过大。超临界二氧化碳萃取法可以极大程度保证油脂功能活性成分的结构和活性，并提高提取率，例如专利“提取甘油三酯型南极磷虾油和南极磷虾磷脂的方法”，公开号CN104388188A，利用超临界二氧化碳萃取法获得了高品质南极磷虾油，但这种方法成本较高，目前尚不利于工业化大量生产。酶解法和有机溶剂萃取法获得的南极磷虾油又往往含有较高的胆固醇和含氟蛋白质，对人体健康不利。同时上述提取方法中并未涉及到胆固醇和含氟蛋白质的脱除工艺。
南极磷虾体内有一个同时具有外切酶和内切酶活性的酶系统可以高效降解蛋白质，这对南极磷虾的贮运与保险提出了重大挑战，但同时也为南极磷虾自溶酶的应用带来了机遇。
发明内容
本发明为了解决现有技术存在的问题，提供了一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，本发明先利用南极磷虾体内的自溶酶进行自溶酶解，再利用间歇式超声波辅助复合酶酶解法对南极磷虾油进行提取，该方法操作便捷，得率较高；同时获得的南极磷虾油进行脱除胆固醇和含氟蛋白质的工艺，最终获得低胆固醇低氟的南极磷虾油产品，产品中磷脂含量高达42-46％，EPA+DHA总量占总脂肪酸含量50％以上，此外还含有高含量的虾青素等生物活性成分。
一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，包括以下步骤：
1)自溶酶解：以冷冻南极磷虾为原料，利用粉碎机粉碎至10-20目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中，45-55℃保温，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得南极磷虾浆料；
2)间歇式超声波辅助复合酶酶解法提取：取步骤1)中自溶后的南极磷虾浆料，加入4-8倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶，调节PH值，进行复合酶解，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理；酶解结束后，95-100℃灭酶10-15min，3000r/min离心10-15min除去底部残渣，8000r/min离心15-20min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油；
3)脱除胆固醇工艺：配制质量分数为10～12％的β-环糊精溶液，取步骤2)中粗南极磷虾油和β-环糊精溶液混合，45～50℃，100～120r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心10～15min，取上层油脂备用；
4)脱氟蛋白工艺：取步骤3)中得到的上层油脂，用活性白土和氯化钙的混合物吸附含氟蛋白质，7500r/min离心10-15min；取上清液,加入无水硫酸钠除去多余水分，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油。
作为优选，所述步骤1)中恒温培养箱中的保温时间为60-90min。
作为优选，所述步骤2)中的碱性蛋白酶加入量为6000-12000U/g冷冻南极磷虾。
作为优选，所述步骤2)中的胰蛋白酶加入量为4000-8000U/g冷冻南极磷虾。
作为优选，所述步骤2)中的pH值为7.5-8.5；酶解时间为2-4h，酶解温度为40-50℃。
作为优选，所述步骤2)中的酶解期间每隔60min超声波处理时间为5-15min，超声声场强度为40～60W/cm2，超声温度为40-50℃，超声频率为20～25kHz。
作为优选，所述步骤3)中的粗南极磷虾油和β-环糊精溶液的体积比为1:1，所述β-环糊精溶液为β-环糊精的乙醇溶液。
作为优选，所述步骤4)中的活性白土和氯化钙的混合物中活性白土与氯化钙的质量比为3:1。
作为优选，所述步骤4)中的活性白土和氯化钙混合物与上层油脂的重量体积比为1:15，单位g/ml。
作为优选，所述步骤4)中加入无水硫酸钠的量与上清液的体积比为1:5，单位g/ml。
本发明解决了现有技术中存在的不足，利用南极磷虾体内的自溶酶进行酶解后，采用一种间歇式超声波辅助复合酶的酶解法，提高了南极磷虾油的提取率；本发明的提取工艺简单，成本低廉，适合于工业化大生产；同时本发明提供一种简便的脱除南极磷虾油胆固醇和含氟蛋白质的方法，提高了南极磷虾油的品质。
具体实施方式
本发明所使用的试剂没有特别的限制，可采用商购的常规试剂。如实施例中碱性蛋白酶和胰蛋白酶购买于合肥博美生物科技有限责任公司，β-环糊精购买于西安德立生物化工有限公司，活性白土购买于济南鑫隆化工有限公司，氯化钙购买于浙江大成钙业有限公司、无水硫酸钠购买于上海邦景实业有限公司。
活性白土和氯化钙混合物的配置：活性白土:氯化钙的质量比为3:1。
10％的β-环糊精溶液的配置：称取β-环糊精10g，溶解于90g无水乙醇中，混匀得10％的环糊精溶液。
11％的β-环糊精溶液的配置：称取β-环糊精11g，溶解于89g无水乙醇中，混匀得11％的环糊精溶液。
12％的β-环糊精溶液的配置：称取β-环糊精12g，溶解于88g无水乙醇中，混匀得12％的环糊精溶液。
本实施例中冷冻南极磷虾由浙江海力生集团有限公司提供。
实施例1
1)取冷冻南极磷虾1kg(干重为214g)，利用粉碎机粉碎至20目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中45℃下保温90min，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得自溶后南极磷虾浆料；
2)取自溶后南极磷虾浆料，加入4倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解，碱性蛋白酶加入量为6000U/g冷冻南极磷虾，胰蛋白酶加入量为6000U/g冷冻南极磷虾，pH值7.5，酶解时间2h，酶解温度45℃，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理，超声波处理时间为5min，超声声场强度为60W/cm2，超声温度45℃，超声频率为25kHz；酶解结束后，100℃灭酶10min，3000r/min离心10min除去底部残渣，8000r/min离心20min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油34.32g(42.80mL)；
3)配制质量分数为10％的β-环糊精溶液，向步骤2)中的粗南极磷虾油中加入42.80mL的10％β-环糊精溶液，45℃，110r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心15min，得上层油脂42.35mL；
4)用活性白土和氯化钙的混合物2.82g吸附步骤3)中的上层油脂，去除含氟蛋白质，7500r/min离心15min，得上清液41.51mL；加入无水硫酸钠8.30g，除去多余水分，离心，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油32.64g，其相关指标测定结果如表1。
表1
实施例2
1)取冷冻南极磷虾500g(干重为107g)，利用粉碎机粉碎至10目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中55℃下保温60min，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得自溶后南极磷虾浆料；
2)取自溶后南极磷虾浆料，加入8倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解，碱性蛋白酶加入量为10000U/g冷冻南极磷虾，胰蛋白酶加入量为8000U/g冷冻南极磷虾，pH值8.5，酶解时间3h，酶解温度50℃，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理，超声波处理时间为10min，超声声场强度为40W/cm2，超声温度50℃，超声频率为20kHz；酶解结束后，95℃灭酶15min，3000r/min离心12min除去底部残渣，8000r/min离心15min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油18.75g(23.40mL)；
3)配制质量分数为12％的β-环糊精溶液，向步骤2)中的粗南极磷虾油中加入23.40mL的12％β-环糊精溶液，50℃，120r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心10min，得上层油脂22.03mL；
4)用活性白土和氯化钙混合物1.46g吸附步骤3)中的上层油脂，去除含氟蛋白质，7500r/min离心10min，得上清液21.77mL；加入无水硫酸钠4.35g，除去多余水分，离心，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油17.25g，其相关指标测定结果如表2。
表2
实施例3
1)取冷冻南极磷虾2KG(干重为428g)，利用粉碎机粉碎至15目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中50℃下保温80min，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得自溶后南极磷虾浆料；
2)取自溶后南极磷虾浆料，加入6倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解，碱性蛋白酶加入量为12000U/g冷冻南极磷虾，胰蛋白酶加入量为7000U/g冷冻南极磷虾，pH值8.0，酶解时间2h，酶解温度40℃，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理，超声波处理时间为15min，超声声场强度为40W/cm2，超声温度40℃，超声频率为25kHz；酶解结束后，98℃灭酶13min，3000r/min离心15min除去底部残渣，8000r/min离心20min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油78.67g；(98.20mL)
3)配制质量分数为11％的β-环糊精溶液，向步骤2)中的粗南极磷虾油中加入98.20mL的11％β-环糊精溶液，50℃，100r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心12min，得上层油脂97.06mL；
4)用活性白土和氯化钙混合物6.47g吸附步骤3)中的上层油脂，去除含氟蛋白质，7500r/min离心12min，得上清液94.43mL；加入无水硫酸钠18.87g，除去多余水分，离心，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油76.88g，其相关指标测定结果如表3。
表3
实施例4
1)取冷冻南极磷虾10KG(干重为2140g)，利用粉碎机粉碎至10目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中50℃下保温80min，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得自溶后南极磷虾浆料；
2)取自溶后南极磷虾浆料，加入5倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解，碱性蛋白酶加入量为10000U/g冷冻南极磷虾，胰蛋白酶加入量为8000U/g冷冻南极磷虾，pH值8.0，酶解时间3h，酶解温度45℃，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理，超声波处理时间为10min，超声声场强度为55W/cm2，超声温度45℃，超声频率为23kHz；酶解结束后，98℃灭酶15min，3000r/min离心15min除去底部残渣，8000r/min离心20min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油400.60g(499.80mL)；
3)配制质量分数为12％的β-环糊精溶液，向步骤2)中的粗南极磷虾油中加入499.80mL的12％β-环糊精溶液，50℃，110r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心12min，得上层油脂498.44mL；
4)用活性白土和氯化钙混合物33.23g吸附步骤3)中的上层油脂，去除含氟蛋白质，7500r/min离心15min，得上清液494.75mL；加入无水硫酸钠98.95g，除去多余水分，离心，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油393.28g，其相关指标测定结果如表4。
表4
实施例5
1)取冷冻南极磷虾5KG(干重为1070g)，利用粉碎机粉碎至20目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中45℃下保温90min，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得自溶后南极磷虾浆料；
2)取自溶后南极磷虾浆料，加入6倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解，碱性蛋白酶加入量为9000U/g冷冻南极磷虾，胰蛋白酶加入量为6000U/g冷冻南极磷虾，pH值8.0，酶解时间3.5h，酶解温度45℃，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理，超声波处理时间为10min，超声声场强度为40W/cm2，超声温度45℃，超声频率为25kHz；酶解结束后，100℃灭酶15min，3000r/min离心15min除去底部残渣，8000r/min离心20min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油187.33g(233.70mL)；
3)配制质量分数为10％的β-环糊精溶液，向步骤2)中的粗南极磷虾油中加入233.70mL的10％β-环糊精溶液，50℃，120r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心12min，得上层油脂231.64ml；
4)用活性白土和氯化钙混合物15.44g吸附步骤3)中的上层油脂，去除含氟蛋白质，7500r/min离心15min，得上清液228.68ml；加入无水硫酸钠45.74g，除去多余水分，离心，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油181.50g，其相关指标测定结果如表5。
表5
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)自溶酶解：以冷冻南极磷虾为原料，利用粉碎机粉碎至10-20目；将粉碎后的南极磷虾置于恒温培养箱中，45-55℃保温，使南极磷虾自溶，以使部分蛋白质和油脂分离，得南极磷虾浆料；
2)间歇式超声波辅助复合酶酶解法提取：取步骤1)中自溶后的南极磷虾浆料，加入4-8倍体积蒸馏水，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶，调节PH值，进行复合酶解，酶解期间每隔60min进行超声波辅助酶解处理；酶解结束后，95-100℃灭酶10-15min，3000r/min离心10-15min除去底部残渣，8000r/min离心15-20min，取上层油脂层，得到粗南极磷虾油；
3)脱除胆固醇工艺：配制质量分数为10～12％的β-环糊精溶液，取步骤2)中粗南极磷虾油和β-环糊精溶液混合，45～50℃，100～120r/min转速避光搅拌1.5h，7500r/min转速离心10～15min，取上层油脂备用；
4)脱氟蛋白工艺：取步骤3)中得到的上层油脂，用活性白土和氯化钙的混合物吸附含氟蛋白质，7500r/min离心10-15min；取上清液,加入无水硫酸钠除去多余水分，上清即为低胆固醇低氟南极磷虾油。
2.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤1)中恒温培养箱中的保温时间为60-90min。
3.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤2)中的碱性蛋白酶加入量为6000-12000U/g冷冻南极磷虾。
4.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤2)中的胰蛋白酶加入量为4000-8000U/g冷冻南极磷虾。
5.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤2)中的pH值为7.5-8.5；酶解时间为2-4h，酶解温度为40-50℃。
6.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤2)中的酶解期间每隔60min超声波处理时间为5-15min，超声声场强度为40～60W/cm2，超声温度为40-50℃，超声频率为20～25kHz。
7.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤3)中的粗南极磷虾油和β-环糊精溶液的体积比为1:1，所述β-环糊精溶液为β-环糊精的乙醇溶液。
8.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步 骤4)中的活性白土和氯化钙的混合物中活性白土与氯化钙的质量比为3:1。
9.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤4)中的活性白土和氯化钙的混合物与上层油脂的重量体积比为1:15，单位g/ml。
10.根据权利要求1所述的一种超声波辅助酶解法制备南极磷虾油的方法，其特征在于所述步骤4)中加入无水硫酸钠的量与上清液的体积比为1:5，单位g/ml。
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