CN107536803A - 一种靶向pH‑GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向pH‑GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，用具有pH‑GSH双响应性的胱胺功能化柱[5]芳烃作为主体分子，以含吡啶盐修饰的半乳糖衍生物作为客体分子，通过主客体作用制得糖功能化的柱[5]芳烃双亲性分子，在溶液中通过亲疏水作用形成纳米囊泡，并将抗癌药物包封在囊泡空腔内，从而构建具有靶向pH‑GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系。由于囊泡表面含有半乳糖基，可显著提高体系的生物相容性；同时，半乳糖基可与肝癌细胞表面过量表达的特异性半乳糖结合蛋白相互作用，实现靶向选择性进入癌细胞，进从而在癌细胞内快速释放抗癌药物，提高对癌细胞的杀伤力。

Description

一种靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系

技术领域

本发明属于纳米生物医药材料领域，具体涉及一种靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，并将其应用于抗癌药物运输。

背景技术

纳米载药体系是以纳米级微观范畴的亚微粒载体为基础，该载体利用癌细胞和正常细胞的微环境差异，实现药物在癌细胞中的快速释放，而在正常细胞中不释放或释放较慢，以减小其副作用。目前，虽然利用多种手段和材料构建了种类繁多的纳米载药体系，但依然存在着功能单一、负载效率低、具有一定毒性或需对被负载药物进行修饰等问题。因此，开发多功能的纳米载药体系就成为解决这一问题最有效的手段之一。研究表明，纳米囊泡作为两亲性分子的有序组合体，以其独特的双层膜结构现已成为最为重要的药物载体之一。它不仅具有良好的生物相容性，而且能与细胞膜发生吸附、融合等作用从而提高药物分子进入肿瘤细胞的能力，提高生物利用度。

大环分子柱芳烃作为新一代的超分子主体化合物，由于其富含电子的疏水空腔，并且易于通过修饰功能基团或与客体分子组装，从而实现亲水性和疏水性之间的转变，为纳米囊泡的构建提供了便利，显示出巨大的应用前景。2012年，浙江大学的黄飞鹤教授首次成功将柱芳烃组装成纳米囊泡并运用到药物负载上。2013年，南京大学的王乐勇教授通过合成水溶性的柱芳烃，构建了pH响应性的超分子囊泡，并将其应用于负载抗癌药物，从而减少了药物对正常细胞的副作用。在此基础上，本课组利用氧化态二茂铁修饰的柱芳烃，在水中自组装形成阳离子囊泡，用于抗癌药物和siRNA的共运输，初步实现了既能减小抗癌药物的副作用，又能克服癌细胞的耐药性。然而，这些体系存在缺少靶向选择性、刺激响应单一等不足，所以构建靶向双响应性多功能囊泡的纳米载药体系对克服这些不足具有重大的意义。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷或不足，本发明的首要目的在于提供一种具有良好生物相容性和靶向双响应性多功能囊泡的纳米载药体系。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，其特征在于，采用具有pH-GSH双响应性的胱胺功能化柱[5]芳烃作为主体分子，以含吡啶盐修饰的半乳糖衍生物作为客体分子，通过主客体作用制得糖功能化的柱[5]芳烃双亲性分子，在溶液中通过亲疏水作用形成多功能纳米囊泡，并将抗癌药物包封在囊泡空腔内，从而构成具有靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系。

根据本发明，所述的pH-GSH双响应性来自胱胺功能化柱[5]芳烃中的二硫键和氨基。

进一步地，所述的糖为可以特异性识别肝癌细胞表面糖结合蛋白的半乳糖。

本发明的另一目的是提供上述靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系制备方法，其特征在于，具体按如下步骤进行：

1)在柱[5]芳烃两端修饰上胱胺；

2)将含吡啶盐的半乳糖衍生物客体分子组装在胱胺功能化的柱[5]芳烃主体分子上形成糖靶向的pH-GSH双响应性的双亲性分子；

3)将抗癌药物溶于上述双亲性分子的水溶液中，通过亲疏水作用形成囊泡，将抗癌药物包封在囊泡空腔内，从米而构成靶向pH-GSH双响应性多功能纳囊泡载药体系。

本发明的第三个目的在于提供上述靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的用途，即：应用于抗癌药物的运输。

由于半乳糖的靶向作用，该靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系对肝癌细胞表显出一定的靶向性；同时，利用癌细胞内较低的pH值影响体系中铵根离子和氨基的比例改变体系亲疏水性以及癌细胞内较高浓度的GSH促使体系中二硫键快速断裂加速囊泡破裂，从而在癌细胞内快速释放抗癌药物，提高对癌细胞的杀伤力。

实验结果表明，该靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，具有良好的生物相容性，可靶向进攻肝癌细胞，可有效地提高抗癌药物对癌细胞的杀伤力，为构建靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系提供了一个新的途径。

本发明提供的靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系及其用于抗癌药物的运输具有以下技术优势：

(1)解决了纳米载药体系中缺少靶向选择性和刺激响应单一的问题，符合当今社会的发展要求，具有良好的应用和发展前景。

(2)同现有的载药体系相比，该靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系可主动识别肝癌细胞、具有pH-GSH双响应性、实现抗癌药物的靶向运输。在该囊泡表面具有靶向作用的半乳糖，不仅可以改善材料的生物相容性保护正常细胞而且可以实现对肝癌细胞的主动识别；在肝癌细胞中，利用癌细胞内较低的pH值影响体系中铵根离子和氨基的比例改变体系亲疏水性以及癌细胞内较高浓度的GSH促使体系中二硫键快速断裂加速囊泡破裂，实现抗癌药物的快速释放，提高对癌细胞的杀伤力。

附图说明

图1是本发明的靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的制备以及囊泡载药释放示意图；

图2是靶向pH-GSH双响应性多功能囊泡的透射电镜图片；

图3是实施例6所得化合物H的核磁共振氢谱图；

图4是实施例11所得化合物G的核磁共振氢谱图；

图5是负载抗癌药物的靶向pH-GSH双响应性多功能囊泡的透射电镜图片；

图6是所得靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的载药毒性实验；

图7是所得靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的体外模拟释放曲线；

图8是所得靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的验证靶向性的细胞流式实验图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，在以下的实施例中，本发明给出了靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系合成以及该体系的制备过程，应当理解，以下的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

参见图2和图5，本实施例给出一种采用具有pH-GSH双响应性的胱胺功能化柱[5]芳烃作为主体分子，以含吡啶盐修饰的半乳糖衍生物作为客体分子，通过主客体作用制得糖功能化的柱[5]芳烃双亲性分子，在溶液中通过亲疏水作用形成纳米囊泡，并将抗癌药物包封在囊泡空腔内，从而构成靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系。

本实施例中，主体分子选择胱胺功能化的柱[5]芳烃；客体分子选择生物体内重要的半乳糖。

上述作为药物包封作用并且改善材料生物相容性的双亲性分子选择糖-胱胺功能化的柱[5]芳烃，使该载药体系在正常细胞中具备良好的生物相容性。

上述pH-GSH双响应性基团选择胱胺中的氨基和二硫键，利用癌细胞内较低的pH值影响体系中铵根离子和氨基的比例改变体系亲疏水性以及癌细胞内较高浓度的GSH促使体系中二硫键快速断裂加速囊泡破裂，从而实现抗癌药物地快速释放，提高对癌细胞的杀伤力。

参见图1，上述靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的制备方法，按如下步骤进行：

1)在柱[5]芳烃两端修饰上胱胺；

2)合成含吡啶盐的半乳糖衍生物客体分子；

3)将含吡啶盐的半乳糖衍生物客体分子与胱胺功能化的柱[5]芳烃通过主客体作用形成糖靶向pH-GSH双响应性的双亲性分子，在溶液中通过亲疏水作用上述双亲性分子形成纳米囊泡，并将抗癌药物包封在囊泡空腔内，从而构建具有靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系。

由于糖靶向pH-GSH双响应性的双亲性分子含有半乳糖基，不仅可显著提高体系的生物相容性；同时，利用半乳糖基可与肝癌细胞表面过量表达的特异性半乳糖结合蛋白相互作用，实现靶向选择性进入肝癌细胞，进而利用癌细胞内较低的pH值影响体系中铵根离子和氨基的比例改变体系亲疏水性以及癌细胞内较高浓度的GSH促使体系中二硫键快速断裂加速囊泡破裂，从而快速释放抗癌药物，提高对癌细胞的杀伤力。

(一)胱胺功能化的柱[5]芳烃主体分子H的合成

实施例1：

化合物H1的合成：准确称取8.11g的N,N'-羰基二咪唑(50mmol)于110mL DCM中，冰浴，逐滴加入丙炔醇(1.7mL的丙炔醇溶于20mL的DCM中)，搅拌1h，转至室温，搅拌12h，TLC跟踪，反应结束，用35mL的水洗涤三次，收集有机相，无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到无色液体化合物H1。

实施例2：

化合物H2的合成：准确称取6.5g的胱胺盐酸盐(28.86mmol)于25mL的圆底烧瓶中，向内依次加入2.32g的NaOH(57.75mmol)和10mL的水，室温搅拌1h，减压旋蒸，然后把粗产品溶解到10mL的DCM中，过滤，无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到黄色液体化合物H2(该化合物不稳定，选择得到后，直接做下一步)。

实施例3：

化合物H3的合成：准确称取4.4g的化合物H2(28.52mmol)溶于盛有30mL DCM的100mL的圆底烧瓶中，称取3.47g化合物H1溶于20mL的DCM中，然后把该混合物逐滴加入到100mL的圆底烧瓶中。室温搅拌24h，TLC跟踪，反应结束，减压除去体系的溶剂，得到粗产品，将该粗产品溶于NaH₂PO₄(100mL，pH为4.2)，然后用3×30mL乙醚萃取三次，除去了体系两端全部上丙炔的胱胺。然后水相用1M的NaOH调节体系的pH到9.0，用3×40mL乙醚萃取三次，合并有机相，无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到黄色液体H3。

实施例4：

化合物H4的合成：准确称取234mg的化合物H3(1mmol)溶于盛有20mL THF的50mL的圆底烧瓶中，冰浴，逐滴加入Boc₂O酸酐(1.1eq，239mg的Boc₂O酸酐溶于2mL的THF中)，搅拌1h，转至室温，搅拌12h，TLC跟踪，反应结束，减压浓缩，得到黄色液体化合物H4。

实施例5：

化合物H5的合成：准确称取197mg溴代柱芳烃(0.10mmol)溶于盛有1.5mL DMF的10mL的圆底烧瓶中，向内加入71.5mg的叠氮化钠，避光，N₂保护，80℃，过夜，TLC跟踪，反应结束，冷却至室温，向混合体系中加入5mL的水，用乙醚萃取，无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到白色固体化合物H5。

实施例6：

化合物H的合成：准确称取0.79g化合物H5(0.10mmol)于10mL的圆底烧瓶中，向内依次加入0.165g的胱胺盐衍生物H4(1.1mmol)，9.7mg的NaVC(10％)，3mL DCM，N₂保护，用注射器向内加入3mg的CuSO₄.5H₂O(5％溶于3mL的水中)，避光，室温搅拌24h，TLC跟踪，反应结束，分液，DCM萃取3次(15mL)，无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到粗产品，粗产品用DCM:MeOH＝20:1进行柱色谱层析，得到白色固体H6；接下来，准确称取80mg的化合物H6(0.013mmol)于10mL的圆底烧瓶中，在0℃条件下，向内加入620μL的TFA(300eq)，TLC跟踪检测反应进度，搅拌24h，TLC跟踪，反应结束，减压浓缩，向体系中加入饱和碳酸钾(在0℃条件下)，析出白色固体，离心，得到白色固体化合物H。

(二)含吡啶盐的半乳糖衍生物客体分子G的合成

实施例7：

化合物G1的合成：准确称取叠氮全乙酰化半乳糖(0.7466g，2mmol)于盛有100mL甲醇的圆度烧瓶中，在向内加入CH₃ONa(432.1mg，8mmol)，氮气保护，室温搅拌2h，TLC检测反应完全，用离子交换树脂，调节体系pH到7，过滤，减压浓缩，得到黄色液体化合物G1。

实施例8：

化合物G2的合成：准确称取三乙二醇(1.94g，0.01mol)于盛有100mL乙腈的圆度烧瓶中，向内依次加入溴丙炔(1.77g，0.5mol)，无水K₂CO₃，氮气保护，回流24h，TLC检测反应，过滤，减压浓缩，粗产品用PE:EA＝2:1进行柱色谱层析，得到无色透明液体G2。

实施例9：

化合物G3的合成：量取15mL的浓硫酸缓慢加入到HBr水溶液中(21mL)在冰水浴的条件下，取化合物G2(1.16g，0.005mol)逐滴加入到上述混合物中，氮气保护，避光，回流24h，TLC检测反应，先向内加入等体积的冰水，然后用饱和碳酸氢钠中和，最后用DCM萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥过滤，减压浓缩，粗产品用PE:EA＝2:1进行柱色谱层析，得到无色透明液体化合物G3。

实施例10：

化合物G4的合成：准确称取41.1mg的化合物G2(0.2mmol)于盛有5mL THF的10mL的圆底烧瓶中，再依次向内加入化合物G3(50.2mg，0.2mmol)，CuI(18.6mg，0.1mmol)和DIPEA(0.68mL，3.9mmol)，氮气保护，室温搅拌24h，TLC检测反应完全，减压旋干，在粗产品中加入20mL的DCM，然后用水(3×10mL)洗涤，最后用饱和氯化钠(5mL)洗涤，收集到的有机相用无水NaSO₄干燥，过滤，旋干，粗产品用PE:EA＝1:2进行柱色谱层析，得到黄色液体化合物G4。

实施例11：

化合物G的合成：准确称取57.9mg的化合物G4(0.1mmol)于盛有3mL吡啶的10mL的圆底烧瓶中，氮气保护，回流12h，得到的粗产品减压旋干，用MeOH进行柱色谱层析。得到黄色液体化合物G。

(三)糖靶向pH-GSH刺激响应性的多功能纳米载药体系的制备

定量称取主体分子化合物H溶于水溶液中，加入等当量的客体分子化合物G，超声30min后，静止5min后，配成浓度为250μmol/L溶液，分别取少量滴到硅片表面，自然晾干即可用场发射扫面电镜进行观察，自然晾干即可用场发射扫面电镜进行观察，图2是靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的透射电镜图片，图5是所得靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系负载抗癌药物的透射电镜图片。

另外申请人还将上述靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系进行了载药毒性实验(图6)；以及验证靶向的细胞流式实验(图8)。

通过细胞流式实验验证了该载药体系的靶向性；通过体外模拟释放实验验证了该载药体系的pH-GSH双响应性；通过细胞毒性实验验证了该载药体系具有较好的生物相容性和提高药物对癌细胞的杀伤力。该多功能囊泡的纳米载药体系制备过程简单、制备周期短，具有良好的生物相容性，在纳米载药体系中表现出良好的应用和发展前景。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明，本发明不限于上述实施例。熟悉本领域技术的人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必付出大量的创造性劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的技术提示，对本发明的技术方案所做出的增加和替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，其特征在于，采用具有pH-GSH双响应性的胱胺化柱[5]芳烃作为主体分子，以糖作为靶向基团，以含吡啶盐修饰的半乳糖衍生物作为客体分子，通过主客体作用制得糖功能化的柱[5]芳烃双亲性分子，进一步在水溶液中利用亲疏水作用形成多功能纳米囊泡将抗癌药物包封在囊泡空腔内。

2.如权利要求1所述的靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，其特征在于，所述的主体分子为胱胺化的柱[5]芳烃，其pH-GSH双响应性来自胱胺中的二硫键和氨基。

3.如权利要求1所述的靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系，其特征在于，所述的糖为可以特异性识别肝癌细胞表面糖结合蛋白的半乳糖。

4.权利要求1至3其中之一所述的靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系的制备方法，其特征在于，按如下步骤进行：

1)在柱[5]芳烃大环分子修饰上具有pH-GSH双响应性的胱胺；

2)将含吡啶盐修饰的半乳糖衍生物客体分子与胱胺化柱[5]芳烃通过主客体相互作用制得糖靶向的pH-GSH双响应性的双亲性分子；

3)将糖靶向的pH-GSH双响应的双亲性分子在水溶液中利用亲疏水作用形成纳米囊泡，将抗癌药物包封，成为靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系。

5.权利要求1至3其中之一所述的靶向pH-GSH双响应性多功能纳米囊泡载药体系用于抗癌药物运输的应用。